王波 董小林

三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)有效治療方法少，易復(fù)發(fā)，預(yù)后差[1-3]。具有血管生成作用的AGGF1(angiogenic factor with G and FHA domains 1)基因在肝癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，與不良預(yù)后相關(guān)[4]。本研究主要探討AGGF1在三陰性乳腺癌中的表達(dá)情況及其與預(yù)后的關(guān)系。

對象與方法

一、對象

我院2003年1月～2009年1月我院收治的三陰性乳腺癌病人109例，均有完整病歷資料及完整隨訪資料，排除7例Ⅳ期病人，共入選病人102例，均為女性，年齡35～71歲，中位年齡51歲。三陰性乳腺癌臨床病理指標(biāo)由我院病歷系統(tǒng)獲取，包括年齡、組織學(xué)分級、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長因子受體2(HER-2)、增殖指數(shù)(Ki-67)等。采用定期住院、門診復(fù)診或者電話隨訪。102例首診并首治的三陰性乳腺癌病人，采用乳腺癌改良根治術(shù)或保乳術(shù)，化療方案為表阿霉素+環(huán)磷酰胺4次序貫多西他賽4次或表阿霉素+環(huán)磷酰胺+多西他賽共6次，需要放療病人化療結(jié)束后輔以放療，病理類型均為浸潤性導(dǎo)管癌。病人均簽署知情同意書，本研究內(nèi)容經(jīng)過我院倫理委員會。

二、方法

1.免疫組織化學(xué)檢測：對入選的102例三陰性乳腺癌石蠟包埋組織標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)5 μm切片備用。AGGF1蛋白檢測一抗購于Abcam公司，檢測步驟按試劑盒說明進(jìn)行，用PBS代替一抗做陰性對照，用正常乳腺組織作為陰性對照。ER、PR、HER-2、Ki-67等指標(biāo)檢測由我院病理檢測中心進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)檢測。

2.AGGF1的Western blot檢測：AGGF1的蛋白提取按RIPA蛋白提取試劑盒說明進(jìn)行，用BCA蛋白含量檢測試劑盒進(jìn)行蛋白定量檢測。每孔上樣40 μg蛋白，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%BSA室溫封閉1小時(shí)，AGGF1抗體4℃孵育過夜，以β-actin抗體作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。參照文獻(xiàn)用Image-Pro Plus 6.0軟件分析AGGF1與β-actin的灰度比值，代表AGGF1蛋白相對含量。結(jié)果判定參照同類研究文獻(xiàn)[6]，比值<0.1為陰性表達(dá)，比值≥0.1為陽性表達(dá)，計(jì)算AGGF1蛋白表達(dá)陽性率。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)。AGGF1蛋白表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系用χ2檢驗(yàn)，AGGF1的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果與Western blot檢測結(jié)果相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析,用Kaplan-Meier繪制生存曲線，行Log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.AGGF1的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果：三陰性乳腺癌組織中出現(xiàn)棕黃色細(xì)胞為陽性細(xì)胞，由我院2位高年資病理科醫(yī)師進(jìn)行閱片并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行結(jié)果判定[6]，隨機(jī)選取4個(gè)區(qū)域，觀察染色強(qiáng)度：無著色=0分，淺著色=1分，中等程度著色=2分，強(qiáng)著色=3分；觀察陽性細(xì)胞所占比例：<1%=0分，1%～10%以下=1分，10%～50%=2分，>50%=3分。綜合結(jié)果判定：細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例得分相乘,積分<4分為AGGF1陰性表達(dá)，積分≥4分為AGGF1陽性表達(dá)。102例乳腺癌組織中，AGGF1蛋白陽性例數(shù)42例，陽性表達(dá)率41.2%，AGGF1蛋白陰性例數(shù)60例，陰性表達(dá)率58.8%，見圖1。

2.AGGF1的Western blot檢測結(jié)果：AGGF1蛋白Western blot檢測陽性例數(shù)43例，陽性表達(dá)率為42.2%，AGGF1蛋白陰性例數(shù)59例，陰性表達(dá)率57.8%。見圖2。

3.AGGF1的免疫組織化學(xué)與Western blot檢測相關(guān)性：免疫組織化學(xué)檢測AGGF1蛋白陽性42例，陰性60例；Western blot檢測AGGF1蛋白陽性43例，陰性59例；結(jié)果顯示，在三陰性乳腺癌組織中，兩者檢測結(jié)果一致，呈正相關(guān)(r=0.859，P=0.00)。

4.隨訪：102例三陰性乳腺癌病人隨訪時(shí)間自2003年9月～2009年1月，中位隨訪時(shí)間41.5個(gè)月，隨訪期間，死亡20例。總生存(overall-survival，OS)定

義為：接受治療日開始至死亡的時(shí)間，隨訪截止仍生存為刪失數(shù)據(jù)。并從住院病歷系統(tǒng)詳細(xì)記錄并整理病人年齡、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER、PR、HER-2、Ki-67等指標(biāo)。

5.AGGF1蛋白表達(dá)與三陰性乳腺癌病人臨床病理指標(biāo)的關(guān)系：AGGF1蛋白表達(dá)與病人年齡、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間的關(guān)系無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與Ki-67間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 AGGF1蛋白表達(dá)與三陰性乳腺癌病人

6.AGGF1蛋白表達(dá)與三陰性乳腺癌病人預(yù)后的關(guān)系：AGGF1蛋白陽性表達(dá)組，隨訪期間死亡17例，AGGF1蛋白陰性表達(dá)組，隨訪期間死亡例3例。Kaplan-Meier生存曲線分析表明，AGGF1蛋白陽性表達(dá)組的OS差于AGGF1蛋白陰性表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

7.以Ki-67為亞組因素分析AGGF1蛋白表達(dá)與三陰性乳腺癌病人預(yù)后的關(guān)系：Ki-67低表達(dá)63例，AGGF1蛋白陽性表達(dá)20例，陰性表達(dá)43例，隨訪期間死亡9例；Ki-67高表達(dá)39例，AGGF1蛋白陽性表達(dá)22例，陰性表達(dá)17例，隨訪期間死亡11例。以Ki-67為亞組因素，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，Ki-67高表達(dá)，AGGF1蛋白陽性表達(dá)組的OS差于AGGF1蛋白陰性表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.14,P=0.00)；Ki-67低表達(dá)，兩組OS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

討 論

三陰性乳腺癌與非三陰性乳腺癌比較，總體治療效果差，生存期短，死亡率高[7-9]。積極探索三陰性乳腺癌預(yù)后相關(guān)因素，強(qiáng)化治療、加強(qiáng)隨訪，從而改善預(yù)后至關(guān)重要[10]。研究發(fā)現(xiàn)，血管生成是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的重要因素，抗血管生成的藥物如貝伐單抗、索拉菲尼等已進(jìn)入臨床試驗(yàn)[11-12]。三陰性乳腺癌的治療方法局限，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在三陰性乳腺癌中，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)陽性表達(dá)病人易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后差[13-14]。陸穎等[15]研究發(fā)現(xiàn)，對于轉(zhuǎn)移性三陰性乳腺癌，在化療基礎(chǔ)上聯(lián)合血管內(nèi)皮抑素可延長中位疾病進(jìn)展時(shí)間。

AGGF1自發(fā)現(xiàn)以來，已明確其為血管生成因子[16]。有研究表明，AGGF1與肝癌病人不良預(yù)后相關(guān)，與VEGF、CD34等血管因子呈正相關(guān)[17-18]。

我們在AGGF1的免疫組織化學(xué)檢測基礎(chǔ)上，進(jìn)行了Western blot檢測驗(yàn)證，明確了兩者檢測結(jié)果具有高度一致性。分析顯示，三陰性乳腺癌病人中，AGGF1蛋白表達(dá)陽性病人與AGGF1蛋白表達(dá)陰性病人相比，預(yù)后差，生存期短，死亡率高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示AGGF1蛋白陽性表達(dá)是三陰性乳腺癌預(yù)后的不良因素。此外，Ki-67在AGGF1的不同表達(dá)組間分布有差異。生存分析結(jié)果顯示，在Ki-67高表達(dá)組，AGGF1蛋白表達(dá)陽性病人OS較AGGF1蛋白表達(dá)陰性病人差。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)AGGF1蛋白陽性表達(dá)與三陰性乳腺癌不良預(yù)后相關(guān)，有可能可作為三陰性乳腺癌預(yù)后判斷的指標(biāo)。本研究后續(xù)工作探討其與三陰性乳腺癌血管生成的關(guān)系、作用機(jī)理，以進(jìn)一步明確AGGF1是否可作為三陰性乳腺癌潛在的抗血管治療靶點(diǎn)，為拓展三陰性乳腺癌的治療、改善預(yù)后提供積極的思路。