彭迎春 張 媛 楊志娟 萬曉麗 楊 洋 師增增

(1 四川省樂山市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,樂山市 614000，電子郵箱：344875025@qq.com；2 西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,陜西省西安市 710077；3 中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,陜西省西安市 710038)

子癇前期是一種以新發(fā)高血壓和蛋白尿為特征的妊娠期常見特異性疾病，危及母兒安全[1]。子癇前期的確切發(fā)病機制不清，相關(guān)研究表明，其是多因素、多機制及多通路引起的疾病，其中滋養(yǎng)細胞增殖障礙、凋亡增加，螺旋動脈重塑受損引發(fā)后續(xù)病理性胎盤形成，為主要的機制學(xué)說[2]。因此，了解滋養(yǎng)細胞功能相關(guān)影響因素，對探究子癇前期的病因具有一定意義。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)長度超過200nt且不能編碼蛋白質(zhì)，其不僅參與細胞增殖和凋亡、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移等過程，還能以多種方式調(diào)控同為非編碼RNA屬性的微小RNA(microRNA，miRNA)，間接影響miRNA的靶基因，從而發(fā)揮相關(guān)生理功能[3]。研究顯示，部分lncRNA能夠調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞的侵襲和遷移，與子癇前期有關(guān)[4]。lncRNA-小核仁 RNA宿主基因5(small nucleolar RNA host gene 5,SNHG5)在黑色素瘤細胞中能夠通過對miRNA-155發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)作用，促進細胞增殖，并抑制細胞凋亡[5]。而miRNA-155與子癇前期的相關(guān)性研究已較為深入，其在子癇前期患者胎盤組織中病理性高表達，并靶向調(diào)控細胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表達從而影響滋養(yǎng)細胞增殖、遷移[6]。因此，lncRNA- SNHG5是否與子癇前期相關(guān)，及其能否通過對miRNA-155發(fā)揮ceRNA作用，從而影響滋養(yǎng)細胞功能參與疾病發(fā)病過程，值得探究。本研究主要分析了lncRNA-SNHG5在重度子癇前期(severe preeclampsia,sPE)孕婦胎盤組織中的表達情況，及其通過調(diào)控miRNA-155及cyclin D1對人正常滋養(yǎng)細胞HTR8增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床標本來源 收集2018年10月至2019年6月于樂山市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科住院首次接受剖宮產(chǎn)分娩的60例產(chǎn)婦的胎盤組織，其中sPE孕婦30例(sPE組)、健康孕婦 30例(正常組)。sPE組的診斷均符合第9版《婦產(chǎn)科學(xué)》[7]中的相關(guān)標準。兩組均排除合并糖尿病、心臟病、慢性高血壓、慢性腎炎、自身免疫疾病、血栓形成病癥、精神疾病者，以及既往有陰道或剖宮產(chǎn)分娩史、胎兒畸形和HELLP綜合征病史者。兩組研究對象在體質(zhì)指數(shù)、年齡、妊娠時間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。收集的胎盤組織用無菌磷酸鹽緩沖鹽水洗滌，立即在液氮中快速冷凍，然后在-80℃下儲存待檢。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有納入研究對象均簽署知情同意書。

表1 兩組研究對象一般資料比較(x±s)

1.2 細胞株及主要試劑、儀器 人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞HTR8購自美國ATCC公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Thermo Fisher Scientific公司(批號：MFCD00217820、10099141)；空質(zhì)粒(pcDNA3.1)和SNHG5過表達質(zhì)粒(pcDNA3.1-SNHG5)購自中國上海吉瑪公司；SNHG5抑制序列小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)、PCR引物由中國廣州瑞博公司合成；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司(批號：15596026)；PrimeScript RT Master Mix及PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自日本TaKaRa公司(批號：RR036A，6210A，DRR041A)；脂質(zhì)體 2000試劑盒購自美國Invitrogen公司(批號：11668-027)；細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)購自中國碧云天公司(批號：C0037)；SDS裂解液及蛋白提取試劑盒購自美國Invitrogen公司(批號：88700)；鼠抗人cyclin D1單克隆抗體、鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗購自英國Abcam公司(批號：EPR2241，EPR16891，ab6728)。CFX96型實時熒光定量PCR分析儀購自美國Bio-Rad公司，iBright CL750化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)、Multiskan FC酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將HTR8細胞復(fù)蘇后，接種培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素(購自中國碧云天公司，批號：ST488-1、ST488-2)的RPMI-1640培養(yǎng)基中。將細胞置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期HTR8細胞，將細胞分為對照組、過表達組、抑制組采用六孔板進行細胞轉(zhuǎn)染實驗，按照脂質(zhì)體2000試劑盒說明書步驟，分別進行空質(zhì)粒(pcDNA3.1)、lncRNA-SNHG5過表達質(zhì)粒(pcDNA3.1-lncRNA-SNHG5)、siRNA(lncRNA-SNHG5抑制序列)的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)條件同前。每組設(shè)置5個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染后6 h行第1次細胞換液。

1.4 實時熒光定量PCR法檢測相關(guān)基因表達水平 按照TRIzol試劑盒說明步驟，提取凍存sPE組、正常組胎盤組織以及各轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染48 h后細胞的總RNA，并檢測RNA質(zhì)量及濃度。根據(jù)PrimerBank(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)公布的基因序列設(shè)計合成lncRNA-SNHG5、miRNA-155、cyclin D1及內(nèi)參U6、β-肌動蛋白(β-actin)的引物序列，具體序列見表2。使用PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄合成lncRNA-SNHG5、cyclin D1 cDNA，使用PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄合成miRNA-155 cDNA。分別以U6、β-actin為內(nèi)參，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明行實時定量PCR。PCR總反應(yīng)體系為25 μL，其中含2 μL cDNA、上下游引物各1 μL、12.5 μL SYBR Premix Ex Taq試劑、8.5 μL滅菌蒸餾水。采用兩步法進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。采用基于比較Ct法計算目的基因的相對表達水平。每次設(shè)定3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

表2 目的基因引物序列

1.5 CCK-8 法檢測細胞增殖 按照CCK-8測定試劑盒說明步驟，檢測各組細胞轉(zhuǎn)染后增殖能力。對數(shù)生長期HTR8細胞，調(diào)整細胞密度至2×103個/100 μL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，分為對照組、過表達組、預(yù)制組，按照1.3步驟進行轉(zhuǎn)染，24 h、48 h、72 h后，加入等量CCK-8試劑溶液孵育1 h后，于酶標儀上讀取波長為450 nm處的吸光度值(A值)。實驗重復(fù)3次。

1.6 免疫印跡法檢測各組細胞cyclin D1蛋白的表達水平 采用SDS裂解溶液裂解各組細胞后提取總蛋白，二喹啉甲酸法蛋白測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。蛋白上樣后進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì)，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂乳在室溫下將膜封閉1 h，然后在4℃下與鼠抗人cyclin D1(1 ∶2 500)、鼠抗人GAPDH(1 ∶1 500)單克隆抗體孵育過夜。次日用TBST洗膜后將膜與辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶5 000)在室溫下孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測印跡條帶。目的蛋白的表達量以cyclin D1/內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示。實驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；多級間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組胎盤組織lncRNA-SNHG5的表達情況 sPE組lncRNA-SNHG5相對表達水平為0.63±0.14，低于正常組的0.99±0.06(t=-13.007，P<0.001)。

2.2 轉(zhuǎn)染后各組HTR8細胞中 lncRNA-SNHG5、miRNA-155以及cyclin D1的表達情況 抑制組、對照組、過表達組的lncRNA-SNHG5、cyclin D1 mRNA及蛋白相對表達水平均依次升高、miRNA-155相對表達水平依次降低(均P<0.05)。見表3、表4、圖1。

表3 轉(zhuǎn)染后3組細胞SNHG5、miRNA-155、cyclin D1 mRNA相對表達水平的比較(x±s)

表4 轉(zhuǎn)染后3組細胞cyclin D1蛋白相對表達水平的比較(x±s)

圖1 轉(zhuǎn)染后3組HTR-8細胞cyclin D1蛋白電泳圖

2.3 各組HTR8細胞增殖能力比較 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后不同時間節(jié)點(24 h、48 h、72 h)，與對照組相比，過表達組HTR8細胞增殖能力均升高，而抑制組HTR8細胞增殖能力均降低(均P<0.05)。見表5。

表5 3組HTR-8細胞轉(zhuǎn)染后不同時間點的A值比較(x±s)

3 討 論

子癇前期嚴重威脅母嬰健康，其病因尚未完全明確，螺旋動脈重鑄不足，血管內(nèi)皮細胞損傷、炎癥、遺傳等因素均與子癇前期相關(guān)[8]，滋養(yǎng)細胞功能異常導(dǎo)致的螺旋動脈重塑障礙已被認為是子癇前期發(fā)病機制的重要過程[9]。目前，已有諸多研究明確了子癇前期妊娠胎盤組織中差異表達的非編碼RNA(包括miRNA、lncRNA)，這些非編碼RNA能夠介導(dǎo)滋養(yǎng)細胞功能發(fā)生變化，可能參與了子癇前期發(fā)病過程[2,10]。lncRNA-SNHG5通過調(diào)控腫瘤細胞增殖、侵襲、凋亡等參與疾病過程，與直腸癌、黑色素瘤、乳腺癌等腫瘤密切相關(guān)[11]。但目前有關(guān)lncRNA-SNHG5與妊娠相關(guān)疾病(如子癇前期等)關(guān)系的相關(guān)研究報告不多，且lncRNA參與疾病的相關(guān)具體機制仍需進一步探究。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，與正常晚孕胎盤組織相比，lncRNA-SNHG5在sPE患者胎盤組織中呈病理性低表達(P<0.05)，提示lncRNA-SNHG5與sPE的發(fā)生可能相關(guān)。

基因組測序項目表明，人類基因組中有超過90%的基因組被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA，而lncRNA 與miRNA作為最為重要的兩類非編碼RNA，除能夠通過影響基因表達、表觀遺傳學(xué)等參與調(diào)節(jié)多種生理過程外，這兩者間還能夠通過競爭結(jié)合、“海綿效應(yīng)”等方式[12-13]，相互關(guān)聯(lián)、影響，共同構(gòu)成了一個精細、復(fù)雜、值得探究的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在黑色素瘤細胞中l(wèi)ncRNA-SNHG5與miRNA-155之間的負向調(diào)控關(guān)系已得到驗證[5]，SNHG5能夠通過對miRNA-155發(fā)揮ceRNA作用，間接影響相關(guān)細胞功能。本研究中，我們更換細胞平臺，在人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞HTR8中分別轉(zhuǎn)染SNHG5過表達質(zhì)粒、SNHG5抑制序列后，細胞中l(wèi)ncRNA-SNHG5的過表達與抑制效果顯著(P<0.05)；并且與對照組比較，過表達組細胞的miRNA-155表達水平降低，而抑制組miRNA-155表達水平升高(P<0.05)，提示HTR8細胞中的miRNA-155表達可被lncRNA-SNHG5負性調(diào)控，這與Yan等[5]的研究結(jié)果具有相似性。

miRNA-155與子癇前期的相關(guān)性研究已較為深入，其在子癇前期胎盤組織中病理性高表達，并靶向調(diào)控cyclin D1表達從而影響滋養(yǎng)細胞增殖、遷移[6]。因此，我們在明確了lncRNA-SNHG5與sPE的關(guān)系，以及其在滋養(yǎng)細胞中可能與miRNA-155具有競爭性結(jié)合關(guān)系的基礎(chǔ)上，通過CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染lncRNA-SNHG5后HTR8細胞的增殖能力，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后不同時間點過表達lncRNA-SNHG5后HTR8細胞增殖能力升高，而抑制其表達則HTR8細胞增殖能力降低(均P<0.05)；進一步檢測miRNA-155靶基因cyclin D1的表達，發(fā)現(xiàn)lncRNA-SNHG5表達增強后HTR8細胞中cyclin D1在mRNA及蛋白水平上均表達升高(P<0.05)。

cyclin D1能夠通過影響周期獨立性激酶-4的生物學(xué)活性，從而參與細胞周期G1/S的調(diào)控，與細胞增殖密切相關(guān)[14]。cyclin D1與miRNA-155在3′ 非翻譯區(qū)端具有互補結(jié)合的種子序列，兩者間具有負性調(diào)控關(guān)系；cyclin D1對 HTR8細胞的遷移能力具有促進和保護作用[6]。因此，結(jié)合本實驗結(jié)果，我們推測：與sPE相關(guān)的lncRNA-SNHG5過表達后，可能對miRNA-155發(fā)揮了ceRNA樣作用，內(nèi)源性競爭性結(jié)合、吸附miRNA-155，抑制其表達，繼而間接降低了miRNA-155對cyclin D1的負性調(diào)控，致使cyclin D1表達增高，解除了miRNA-155對滋養(yǎng)細胞增殖能力的抑制作用，使HTR8細胞增殖力提高。但是lncRNA-SNHG5與miRNA-155在滋養(yǎng)細胞中競爭性結(jié)合的靶點，以及在HTR8細胞中具體的結(jié)合部位、相關(guān)機制，均是我們后續(xù)應(yīng)該完善和探究的問題。

綜上所述， lncRNA-SNHG5可能與sPE的發(fā)生有關(guān)，其可能通過調(diào)控miRNA-155/cyclin D1途徑，影響滋養(yǎng)細胞增殖能力。而新近研究表明，lncRNA已經(jīng)具有了作為子癇前期早期診斷與治療靶點的潛在可能[15]，因此，本研究結(jié)果或可為后續(xù)探究子癇前期的病因機制，豐富子癇前期疾病診治手段提供了新的思路和基礎(chǔ)。