羅方雯，黃永光,，涂華彬，胡 峰，尤小龍

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州茅臺酒廠（集團）習酒有限責任公司，貴州 習水 564622）

釀酒行業(yè)素有“曲乃酒之骨”之說，主要緣于大曲內豐富的微生物群落及酶系為白酒釀造及其酒體提供香味及其前體物質，進而對白酒品質產生重要影響[1]。酵母菌類是發(fā)酵之母，是乙醇發(fā)酵的主要動力和產香來源，產酒酵母主要影響酒的產量，同時一些生香酵母能產生酸、酚、芳香和酮類等風味化合物，進而對酒體的風格形成具有重要作用[2]，酵母菌類多在白酒釀造過程有檢出[3]。高溫制曲是醬香型白酒釀造的一大工藝特色，大曲不但培養(yǎng)時間長，且培養(yǎng)溫度高，曲塊在經過40 d的堆積發(fā)酵過程，制曲溫度高達58～65 ℃。酵母菌因耐溫特性受限，主要集中于制曲的前期和高溫堆積發(fā)酵的前期。在制曲前期，酵母菌含量一般為2%～5%，中后期由于58～65 ℃的高溫，酵母菌逐漸死亡[4]。Liu Xiu等[5]采用巢式聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）方法研究了茅臺大曲成型、成熟和干燥過程中微生物的多樣性變化，結果顯示茅臺大曲中有大量細菌、酵母菌和霉菌存在；同樣Wang Chaolu等[6]用純培養(yǎng)研究了茅臺大曲中的微生物，也揭示大曲含有豐富的細菌、霉菌和酵母菌特征。這些研究結果均表明醬香大曲蘊含豐富的微生物資源，也是制酒過程的微生物主要來源。

業(yè)內常有“離開茅臺鎮(zhèn)，就釀不出茅臺酒”的說法。同時，白酒企業(yè)新廠擴建時經常發(fā)生產酒質量不如老廠區(qū)的現象[7]，這些現象都表明環(huán)境微生物對白酒釀造的重要性。醬香型白酒釀造屬于開放式發(fā)酵；開放式制曲通過自然接種，網羅、富集、培養(yǎng)微生物，高溫堆積發(fā)酵過程糟醅可充分網羅、捕集生產環(huán)境（空氣、工具、場地、生產用水等）中的大量微生物，這是富集有益微生物（特別是酵母菌）的重要工序和關鍵環(huán)節(jié)，又稱“二次制曲”。因此，對釀造環(huán)境微生物的研究和解析對醬香白酒釀造具有舉足輕重的意義。

傳統(tǒng)分離方法的結果僅依賴于形態(tài)、生理生化特性進行分類和鑒定，且分離培養(yǎng)的微生物僅占微生物總數的0.1%～10%[8]。因此，應用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法對白酒釀造過程中酵母菌群多樣性的認識不夠全面深入，也不能全面反映釀造過程酵母菌群結構的真實性。隨著分子生物學的發(fā)展，越來越多免培養(yǎng)技術運用于解析復雜微生物態(tài)結構中的菌群多樣性特征。本實驗通過高通量測序結合數理統(tǒng)計系統(tǒng)分析了茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒主釀區(qū)域釀造環(huán)境及其生產大曲中的酵母菌群結構的多樣性特征，并進一步研究其在發(fā)酵過程中的變化規(guī)律及調控機制，以期豐富醬香型白酒釀造酵母菌群結構的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茅臺酒樣品取自貴州省仁懷市茅臺鎮(zhèn)觀音寺區(qū)、上坪村、椿樹村、巖灘村、向陽村、盧榮壩村及合馬鎮(zhèn)街道社區(qū)共7 個釀造醬香型白酒的不同主釀區(qū)域，17 個代表性釀酒企業(yè)的釀造環(huán)境和生產用大曲樣品。環(huán)境取樣點包括：酒廠生產車間的窗戶玻璃表面，窗臺上，車間四周墻體表面，晾堂地面、墻角，行車梯子及梁柱表面，配電箱及消防箱表面，尾酒罐表面及車間外地面等。取樣時間為2018年1—9月，茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒釀造1～7 輪次釀造生產的堆積發(fā)酵期。在每個采樣企業(yè)的樣品采集點，每一輪次均為固定的同一采樣點。按照設置的區(qū)域劃分，將從每個酒廠采集的樣品采用等量混合為該區(qū)域的綜合樣（研究實驗分析樣品，代表該區(qū)域的綜合樣品）。每輪次采集樣品現場采集后勻密封袋、專用箱轉運，運回實驗室分析，并留存樣低溫保存。

DNA Marker、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）、引物合成 上海生物工程股份有限公司；E.Z.N.A.?Soil DNA Kit 美國Omega BioTek公司；異丙醇（分析純） 貴州博奧瑞杰生物科技有限公司；TEA緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖 南京生興生物技術有限公司；Goldview染料 上海賽百盛有限公司；rTaqDNA聚合酶試劑盒 北京全式金生物技術有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國AXYGEN公司。

1.2 儀器與設備

Zealway G154DW高壓蒸汽滅菌鍋 致徽（廈門）儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；GeneAmp?9700型PCR儀 美國ABI公司；DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠；JS-680C凝膠成像儀 上海培清科技有限公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理及DNA提取[9-10]

分別取1.1節(jié)1～7輪次最后混勻的綜合樣各16 g于100 mL離心管中，用30 mL滅菌后的0.1 mol/L PBS懸浮，加入3～5 顆玻璃珠，旋渦振蕩7 min，400 r/min離心5 min，取上清液。將離心得到沉淀用PBS洗滌，旋渦振蕩4 min，400 r/min離心5 min，收集上清液，重復該步驟一次。收集全部上清液于12 000 r/min離心5 min，棄去上清液，收集細胞沉淀。預處理結束后，根據E.Z.N.A.?Soil DNA Kit的操作說明提取各樣品中的微生物總DNA。

1.3.2 16 S rDNA 基因擴增及Illumina MiSeq測序

使用16S rDNA通用真菌引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）對真菌ITS1FITS2R區(qū)域進行擴增。PCR體系及反應條件見黃蘊利等[11]的方法。每個樣本做3 個重復。將同一樣品的PCR產物混合后用1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫；1.1%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結果，將PCR產物用QuantiFluor TM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進行檢測并定量，再按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴增進行文庫模板富集，氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段，制備MiSeq PE文庫。再在Illumina MiSeq（PE300）平臺上機測序[9]。

1.4 數據分析

采用WPS 2019進行數據統(tǒng)計計算，Origin 8.6繪制堆積柱狀圖，TBtool繪制熱譜圖，R語言繪制群落差異分析圖。

2 結果與分析

2.1 主釀區(qū)域環(huán)境及大曲中酵母菌群多樣性結構分布

表1 本實驗檢出結果與其他文獻報道酵母屬對比分析結果Table 1 Comparative analysis of the results of this study and literature reports on yeast genera involved in Maotai-flavor liquor brewing

對高通量測序結果進行統(tǒng)計分析，從茅臺鎮(zhèn)醬香白酒主釀區(qū)域共檢出酵母屬53 種。環(huán)境中共檢測出酵母屬52 種，大曲中共檢測出酵母屬33 種。表1為本實驗檢出結果與其他研究者報道的酵母屬結果的比較分析。

郝飛[12]、郭敏[13]、王曉丹[20]、戴奕杰[24]等從醬香型白酒釀造過程中共檢出Trichomonascus、Cyberlindnera、Saccharomyces、Zygosaccharomyces、Geotrichum、Millerozyma、Trichosporon、Candida、Saccharomycopsis、Pichia、Cryptococcus、Malassezia、Sporobolomyces、Wickerhamomyces、Kazachstania、Meyerozyma、Saccharomycopsis、Torulaspora、Guehomyces、Tetrapisispora、Hannaella、Williopsis等酵母屬。Gibellulopsis在發(fā)酵奶酒中有發(fā)現[15]，牟穰[16]在黃酒釀造過程檢出Filobasidium，但在白酒釀造中鮮見有該2 種酵母屬的相關報道。本研究中，存在unclassified-Saccharomycetes和unclassified-Saccharomycetaceae未能清晰定性到屬種，正在進一步解析研究。通過與其他研究者所檢出酵母屬比較，在本研究中發(fā)現Gibellulopsis、Filobasidium、Kuraishia、Agaricostilbum、Arachnomyces、Bullera、Cystofilobasidium、Dioszegia、Erythrobasidium、Fellomyces、Yamadazyma、Eremothecium、Ballistisporomyces、Aessosporon、Kurtzmanomyces為首次從醬香型白酒釀造環(huán)境中檢出的酵母屬，進一步豐富了釀造酵母資源。

2.2 主釀區(qū)域產高溫大曲內酵母菌群多樣性結構

運用WPS 2019對7 個主釀區(qū)域生產用大曲中酵母菌的高通量測序結果進行統(tǒng)計分析，從7 個主釀區(qū)域的生產用大曲中共檢出33 種酵母屬，見圖1。

從圖1可以看出，各主釀區(qū)域生產大曲中占優(yōu)勢地位的酵母屬為Saccharomycopsis和Wickerhamomyces，其中Saccharomycopsis為各區(qū)域大曲中的絕對優(yōu)勢酵母屬。7 個區(qū)域的生產使用大曲在酵母屬上分布相差不明顯，且各區(qū)域優(yōu)勢酵母屬無明顯區(qū)別，表明茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒各區(qū)域生產及使用大曲在微生物結構組成上基本保持一致，具有相對穩(wěn)定性。其中，Saccharomycopsis相對豐度除在區(qū)域6為61.245%外，在其他區(qū)域都高達85%，平均相對豐度為87.66%，為各區(qū)域大曲的絕對優(yōu)勢酵母屬。Wickerhamomyces位居第2，在區(qū)域6相對豐度最高為26.80%，平均相對豐度為8.26%，各區(qū)域生產使用大曲的酵母屬在相對豐度上出現差異，可能是由于各區(qū)域的地理位置不同導致。Candida、Millerozyma和Trichomonascus平均相對豐度均大于0.2，其余酵母屬的相對豐度在各主釀區(qū)域都較低，其原因可能是這些酵母的含量在大曲中相對于上述酵母屬低，即使達到高通量檢出的閾值，但由于含量太低，導致檢出的豐度也低。郭敏[13]研究了醬香大曲微生物，在第1、2次翻曲以及大曲出房時期均檢出Wickerhamomyces，且相對豐度都較高，與本研究結論一致。王曉丹[20]、Wu[25]等的研究表明S.fibuligera和P.anomala在醬香大曲中處于優(yōu)勢地位，也與本研究結論一致。蔣思峽[26]在醬香大曲中檢出5 個酵母屬，分別為Cryptococcus、Lodderomyces、Pichia、Saccharomyces、Saccharomycopsis，并表明S.fibuligera在成品曲中廣泛存在。陳美竹[27]結合傳統(tǒng)鑒定方法和現代分子生物學手段，從醬香型白酒生產過程檢出酵母9 個屬，主要屬是Debaryomyces、Saccharomycopsis、Trichosporon、Schizosaccharomyces、Saccharomyces、Pichia、Candida和Issatchenkia。

圖1 主釀區(qū)域大曲酵母菌群多樣性結構在屬水平上的分布Fig.1 Distribution of yeast community composition in Daqu at genus level

羅方雯等[28]對7 個主釀區(qū)域醬香大曲中的酵母菌進行了可培養(yǎng)及分離鑒定，其中W.anomalus和S.fibuligera在各區(qū)域中的相對數量較高，平均相對數量分別達到41.73%和8.18%，且在各主釀區(qū)域均分離到?？膳囵B(yǎng)結果與本實驗高通量的檢出結果存在一定差異，在可培養(yǎng)中W.anomalus占絕對優(yōu)勢，而S.fibuligera次之，與高通量的結果恰好相反，這與2 種檢測方法的原理及其2 種菌屬的生物學特性均有關系，但2 種酵母屬均是大曲中的優(yōu)勢屬。結合其他研究者的研究結論，本實驗利用高通量解析，從釀造用高溫大曲中檢出的酵母屬種類最多，且大曲的優(yōu)勢酵母屬為Wickerhamomyces和Saccharomycopsis。其中，Cystofilobasidium、Gibellulopsis、Yamadazyma、Eremothecium和Aessosporon為首次從醬香大曲中檢出的酵母屬，進一步豐富了醬香大曲酵母菌的研究結果。

2.3 主釀區(qū)域環(huán)境酵母菌群結構多樣性分布

運用WPS 2019對7 個主釀區(qū)域釀造環(huán)境樣品中酵母屬的高通量測序結果進行數據統(tǒng)計分析，從環(huán)境中共檢出52 種酵母屬（圖2）。

圖2 釀造環(huán)境中酵母菌群多樣性結構在屬水平上的分布Fig.2 Distribution of yeast community composition in environment at genus level

從圖2可知，Saccharomycopsis在各主釀區(qū)域都有檢出，在區(qū)域7的相對豐度較小為2.938%，在其余區(qū)域相對豐度均高于30%；其次為Wickerhamomyces和Debaryomyces，Wickerhamomyces在區(qū)域6相對豐度為26.797%，平均相對豐度為21.54%，Debaryomyces在區(qū)域2中相對豐度最高為26.392%，平均相對豐度為10.67%。其中，Wickerhamomyces在區(qū)域7的相對豐度最高，而Saccharomycopsis相對豐度卻較少，與其他區(qū)域結果相反，這2 種酵母菌之間的相互作用機制有待進一步考究。其余相對豐度大于6%的酵母屬有Cryptococcus（6.82%）和unclassified-Saccharomycetaceae（6.01%），檢出頻率都為100%。區(qū)域1～6的絕對優(yōu)勢酵母屬為Saccharomycopsis，而區(qū)域7的優(yōu)勢酵母屬為Wickerhamomyces和Cryptococcus，其原因可能是由于區(qū)域7的環(huán)境更適合這2 種酵母菌生長。從圖2還可看出，區(qū)域2和區(qū)域6中的酵母屬的多樣性豐富度高于其他5 個區(qū)域，其原因同樣可能是不同環(huán)境氣候條件的細微差異所致，這也可能是導致各區(qū)域釀出基酒的酒體風格存在細微差異的原因。茅臺技術中心對其醬香白酒釀造環(huán)境及其酒廠周邊生態(tài)環(huán)境中的微生物開展全面普查，從中檢出11 種酵母[29]。張亞麗[30]從茅臺鎮(zhèn)空氣中分離出16 種酵母菌，分屬于10 個不同的屬，且從4 個季節(jié)的空氣中均分離到Saccharomycopsis。王彥華[31]對福矛窖酒釀造車間空氣的微生物開展研究，得出釀造車間空氣樣本中的酵母菌種屬較少，其中Sterigmatomyces含量相對較多，其次為Rhodosporidium和Trichosporon。在茅臺鎮(zhèn)4 個季節(jié)空氣中均分離到Saccharomycopsis，而在福矛窖酒釀造車間空氣樣本中并未發(fā)現該屬，說明不同地域的釀造環(huán)境對白酒釀造微生物的富集存在差異。同樣茅臺鎮(zhèn)不同地域釀造環(huán)境和生產使用大曲在微生物的組成和相對豐度存在差異，進一步說明茅臺鎮(zhèn)不同釀造區(qū)域對釀造微生物的富集存在差異。

羅方雯等[28]對相應環(huán)境樣品中的酵母菌開展了可培養(yǎng)和分離鑒定，結果表明Wickerhamomyces在環(huán)境中的相對數量較高，平均相對數量占比高達31.13%，Cryptococcus為5.08%，且在各區(qū)域均有分離檢出；Saccharomycopsis的相對數量較少，平均相對數量占比只有1.68%，與高通量結果存在一定的差異。由于目前對茅臺鎮(zhèn)醬香白酒主釀區(qū)域環(huán)境中的酵母菌研究非常少，且大多都缺乏系統(tǒng)性。將其他研究者的結論結合本課題高通量分析結果，初步確定茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒釀造區(qū)域環(huán)境的優(yōu)勢酵母屬為Wickerhamomyces、Debaryomyces、Saccharomycopsis和Cryptococcus；且本研究過程從主釀區(qū)域環(huán)境中所檢測的酵母屬的多樣性特征明顯，新檢出發(fā)現Agaricostilbum、Arachnomyces、Bullera、Cystofilobasidium、Dioszegia、Erythrobasidium、Fellomyces、Filobasidium、Gibellulopsis、Kuraishia、Yamadazyma、Eremothecium、Ballistisporomyces、Aessosporon和Kurtzmanomyces，這些酵母屬在醬香白酒酵母菌的研究中未有過相關報道。

2.4 主釀區(qū)域生產大曲和釀造環(huán)境的酵母菌群多樣性差異

比較環(huán)境和大曲中酵母菌屬的多樣性結構特點（圖3），可看出酵母菌屬在環(huán)境和大曲之間的差異性較顯著，環(huán)境的酵母多樣性豐富度明顯高于大曲。其中，酵母屬Gibellulopsis、Yamadazyma、Zygosaccharomyces、Saccharomycopsis、Trichomonascus、Wickerhamomyces、Kluyveromyces和Williopsis相對豐度在環(huán)境和大曲中保持一致。酵母屬Agaricostilbum、Arachnomyces、Arthrographis、Bullera、Dioszegia、Erythrobasidium、Fellomyces、Filobasidium、Geotrichum、Hannaella、Kwoniella、Kuraishia、Leucosporidiella、Priceomyces、Rhodosporidium、Schwanniomyces、unclassified-Saccharomycetaceae、Ballistisporomyces、Kurtzmanomyces和Komagataella在大曲中未檢出，在環(huán)境中單獨檢出；而酵母屬Tetrapisispora在環(huán)境中未檢出，在大曲中單獨檢出。酵母屬Cryptococcus、Cyberlindnera、Cystobasidium、Cystofilobasidium、Debaryomyces、Guehomyces、Kazachstania、Lodderomyces、Meyerozyma、Rhodotorula、Sporobolomyces、Sterigmatomyces、Symbiotaphrina、Torulaspora、Trichosporon、Eremothecium、Kodamaea、Aessosporon、Pichia和Malasssezia在環(huán)境中的相對豐度優(yōu)于大曲，相反unclassified-Saccharomycetes、Millerozyma和Saccharomyces等菌屬在大曲中的相對豐度優(yōu)于環(huán)境。進一步說明釀造環(huán)境與釀造大曲的酵母菌群在種屬類別多樣性上存在明顯差異。

圖3 環(huán)境、大曲中主要酵母屬多樣性豐度熱圖Fig.3 Heatmap showing the diversity and abundance of major yeast genera in environment and Daqu

Venn圖分析可直觀反映釀造環(huán)境與生產用大曲在酵母屬菌群結構多樣性方面的共有種群及特有種群的特征性（圖4）。所有樣品中共檢出53 種酵母屬，環(huán)境中共檢出52 種酵母屬，大曲共檢出33 種酵母屬，大曲中有96.97%的酵母屬來自環(huán)境；在環(huán)境中檢出而未在大曲中檢出的酵母屬有20 種，在大曲中檢出未在環(huán)境中檢出的酵母屬只有1 種。結合圖1～4，明顯看出環(huán)境酵母群落結構多樣性豐富度顯著高于大曲，大曲中的絕大多數酵母菌屬來自環(huán)境，由環(huán)境遷移進入大曲，這可能是由于大曲在存放過程中不斷網羅、富集環(huán)境中的酵母菌所致。醬香型白酒生產使用大曲屬于高溫曲，其制作過程中溫度高達65 ℃左右，酵母幾乎被淘汰，其發(fā)酵力很弱。生產過程酵母的來源主要靠大曲貯存過程和堆積發(fā)酵過程網羅空氣中、場地上的微生物獲得，進一步證實醬香白酒釀造過程生產大曲貯存6 個月非常必要。而在大曲中檢出但未在環(huán)境中檢出的1 種酵母屬，更大的可能性是由于其在環(huán)境中含量很少，大曲在存放過程中從環(huán)境吸收后使其得到了富集培養(yǎng)，從而達到了高通量的檢出限。

圖4 環(huán)境、大曲酵母屬水平分布Venn圖Fig.4 Venn diagram of the horizontal distribution of yeast genera in environment and Daqu

3 結 論

對茅臺鎮(zhèn)醬香白酒釀造的7 個不同主釀區(qū)域的釀造環(huán)境及生產用大曲的酵母菌群多樣性結構運用高通量測序技術進行解析，共檢出53 種酵母屬；其中從大曲樣品中共檢出33 種，環(huán)境樣品中共檢出52 種屬。結果表明，主釀區(qū)域醬香大曲的優(yōu)勢酵母屬為Saccharomycopsis和Wickerhamomyces，其中Cystofilobasidium、Gibellulopsis、Yamadazyma、Eremothecium和Aessosporon為首次從醬香大曲中檢出；環(huán)境的優(yōu)勢酵母屬為Wickerhamomyces、Saccharomycopsis、Debaryomyces和Cryptococcus，其中Agaricostilbum、Arachnomyces、Bullera、Dioszegia、Erythrobasidium、Fellomyces、Filobasidium、Kuraishia、Ballistisporomyces和Kurtzmanomyces在醬香白酒研究中未有過相關報道。

環(huán)境和大曲之間的酵母菌群落結構差異性顯著，環(huán)境的酵母屬多樣性高于大曲。其中，Gibellulopsis、Yamadazyma、Zygosaccharomyces等8 種酵母屬相對豐度在環(huán)境和大曲中保持相對一致；而Cryptococcus、Cyberlindnera、Cystobasidium和Cystofilobasidium等20 種酵母屬在環(huán)境中的相對豐度優(yōu)于大曲，相反unclassified-Saccharomycetes、Millerozyma和Saccharomyces等酵母屬在大曲中的相對豐度優(yōu)于環(huán)境。其中，Agaricostilbum、Arachnomyces和Arthrographis等20 種酵母屬只在環(huán)境中檢出未在大曲中檢出，而Tetrapisispora只在大曲中檢出未在環(huán)境中檢出。大曲中的酵母屬有96.97%來自于環(huán)境，進一步說明環(huán)境是醬香白酒釀造過程中的主要微生物來源。對環(huán)境和大曲之間的酵母菌群多樣性進行系統(tǒng)的相似性和差異性比較，解析了茅臺鎮(zhèn)醬香白酒主釀區(qū)域環(huán)境和大曲之間酵母菌的差異性特征，確定了環(huán)境是茅臺鎮(zhèn)醬香白酒發(fā)酵過程中的主要微生物來源。本研究對茅臺鎮(zhèn)醬香白酒主釀區(qū)域環(huán)境和醬香大曲之間酵母屬結構的分布、相似性以及差異性進行系統(tǒng)的分析，在一定程度上豐富了醬香型白酒釀造過程中酵母菌資源。