呂變梅，蔣雪薇,2,，彭 東，徐曉剛，丁 源，羅曉明,2，周尚庭

（1.長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410114；2.湖南省調(diào)味品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410600；3.加加食品集團(tuán)股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410600）

醬油是以大豆和小麥為主要原料，經(jīng)過(guò)微生物及其酶系長(zhǎng)期作用，最終形成具有特殊色澤和獨(dú)特醬香的傳統(tǒng)調(diào)味品[1]。醬油風(fēng)味的形成是米曲霉、乳酸菌及酵母菌等多菌種相互作用的結(jié)果，其中酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酯類、醇類等物質(zhì)，對(duì)醬油風(fēng)味的形成具有十分重要的貢獻(xiàn)[2]。目前應(yīng)用于醬油發(fā)酵的酵母菌主要有魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）、球擬酵母（Torulopsisspp.）和假絲酵母（Candidaspp.），其中魯氏接合酵母與球擬酵母應(yīng)用最廣[3]。魯氏接合酵母是醬油釀造中后期風(fēng)味形成的重要菌株之一，它在醬油發(fā)酵中可以提升乙醇、高級(jí)醇及芳香雜醇類物質(zhì)的含量[4]。

醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究中，乙醇作為一種常見(jiàn)的香氣成分被檢出，其特殊香味對(duì)醬油風(fēng)味有重要影響，且能與酸類物質(zhì)結(jié)合，生成各種風(fēng)味物質(zhì)及風(fēng)味物質(zhì)的前體，對(duì)醬油色澤風(fēng)味的形成以及改善醬油品質(zhì)發(fā)揮著重要的作用[5]。蔡金星等[6]研究發(fā)現(xiàn)，乙醇的存在對(duì)醬油的風(fēng)味和色澤都有明顯影響，同時(shí)，一定量乙醇的存在有利于醬油保存[7]。日式醬油發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)，提高乙醇含量有利于提升醬油品質(zhì)[8]。目前對(duì)于醬油中揮發(fā)性香氣成分乙醇的研究主要集中在檢測(cè)含量[9]及菌種添加引起的風(fēng)味成分變化[10]，而改良耐鹽產(chǎn)乙醇菌種以獲得較好的乙醇產(chǎn)量并進(jìn)行應(yīng)用研究報(bào)道較少。本研究利用紫外誘變魯氏接合酵母L6選育得到1 株優(yōu)良的耐鹽產(chǎn)乙醇酵母L6-1，研究其在高鹽稀態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用，通過(guò)跟蹤分析發(fā)酵醬醪中乙醇積累量與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化，確定添加產(chǎn)乙醇酵母對(duì)釀造醬油品質(zhì)的提升作用，以期為耐鹽產(chǎn)乙醇風(fēng)味酵母在醬油釀造中的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

出發(fā)菌株：魯氏接合酵母L6，篩選自湖南某醬油廠的高鹽稀態(tài)醬醪中，由湖南省調(diào)味品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心（長(zhǎng)沙理工大學(xué)分中心）保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

豆芽汁培養(yǎng)基配制參照文獻(xiàn)[11]。

2,3 ,5 -氯化苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）篩選雙層培養(yǎng)基，上層培養(yǎng)基：葡萄糖5 g、瓊脂粉15 g、TTC試劑0.5 g，1 000 mL蒸餾水，121 ℃滅菌15 min；下層培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、蛋白胨2 g、酵母膏1.5 g、MgSO4·7H2O 4 g、K2HPO41 g、瓊脂粉20 g，1 000 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH 5.6～5.8，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；ZWY-2102C恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；PE28型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；YRE2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；436GC/EVOQ TQ/PAL氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國(guó)布魯克科技有限公司；Rxi-5Sil MS色譜柱 瑞思泰康科技（北京）有限公司；65 μm PDMS/DVB固相微萃取針 美國(guó)色譜科公司。

1.3 方法

1.3.1 紫外誘變致死率曲線的測(cè)定

將菌種接種至含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% NaCl的豆芽汁液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，取菌懸液，離心洗滌3 次后制成108個(gè)細(xì)胞/mL的菌懸液備用；吸取10 mL菌懸液于功率15 W紫外燈下，距離45 cm照射0、30、60、90、120、180、240 s后分別取樣稀釋涂平板，28 ℃避光培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，繪制致死率曲線[12]。致死率計(jì)算如式（1）所示：

1.3.2 突變株篩選

誘變后的菌懸液涂于TTC篩選平板的下層培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，倒入TTC上層培養(yǎng)基，30 ℃避光保溫2～3 h。挑選TTC上層平板中顯色深的菌株，接入含10% NaCl的豆芽汁液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，再在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h后，測(cè)定乙醇含量。

1.3.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將魯氏接合酵母L6與誘變后篩選的突變株L6-1分別接種于含10% NaCl的豆芽汁液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)，在0～48 h每隔2 h取樣測(cè)OD570nm，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 高鹽稀態(tài)醬醪發(fā)酵工藝

按成品曲-鹽水1∶2（質(zhì)量比）拌入質(zhì)量分?jǐn)?shù)23%的鹽水，制備16% NaCl的鹽鹵發(fā)酵醪，置于28 ℃保溫發(fā)酵，將出發(fā)菌株及選育菌株制備成濃度為107個(gè)細(xì)胞/mL的菌懸液，分別加入發(fā)酵25 d的醬醪中，接種量為5%（體積分?jǐn)?shù)），28 ℃繼續(xù)恒溫發(fā)酵65 d，總發(fā)酵周期90 d，未添加酵母菌的為對(duì)照組。分別在發(fā)酵第0、15、30、45、60、75、90天取醬醪壓榨醬油，測(cè)定還原糖、總酸、氨態(tài)氮、乙醇含量。

1.3.5 分析方法

1.3.5.1 乙醇含量測(cè)定

參照GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測(cè)定》的密度瓶法[13]。

1.3.5.2 發(fā)酵醬油理化指標(biāo)測(cè)定

還原糖含量測(cè)定參照GB/T 5009.7—2016《食品中還原糖的測(cè)定》[14]；總酸含量測(cè)定參照GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[15]；氨態(tài)氮含量測(cè)定參照GB 18186—2000《釀造醬油》的甲醛法[16]。

1.3.5.3 高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

樣品準(zhǔn)備：取成品醬油，添加5 μL質(zhì)量濃度為0.816 μg/μL的2-甲基-3-庚酮作為內(nèi)標(biāo)物，總體積為2 mL[17]。固相微萃取條件：振蕩器50 ℃，將醬油樣品加熱振蕩25 min。氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，程序升溫，40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升溫至120 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min；載氣為高純氦氣，流速1.2 mL/min，分流比10∶1。質(zhì)譜條件：電子電離源，電子能量70 eV，發(fā)射電流200 μA，離子源溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z30～500。揮發(fā)性化合物定量計(jì)算如式（2）所示：

式中：C1為揮發(fā)性化合物含量；C2為內(nèi)標(biāo)物含量；A1為揮發(fā)性化合物峰面積；A2為內(nèi)標(biāo)物峰面積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用主成分分析對(duì)風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，使用SPSS軟件處理數(shù)據(jù)[18]，利用Origin 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 出發(fā)菌株的紫外誘變及乙醇高產(chǎn)菌株的篩選

魯氏接合酵母是耐高滲透壓酵母[19]，能在高鹽環(huán)境下生長(zhǎng)，可利用原料降解產(chǎn)生的還原糖代謝產(chǎn)生乙醇[20]。前期從高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬醪中篩選出1 株耐鹽魯氏接合酵母L6，其在含10% NaCl豆芽汁培養(yǎng)基中的乙醇積累量（體積分?jǐn)?shù)）為1.75%，有一定的產(chǎn)乙醇能力，適合作為選育耐鹽產(chǎn)乙醇酵母的出發(fā)菌株。

紫外誘變是物理誘變中最為簡(jiǎn)便安全的誘變劑，在選育中常作為誘變因子[21]。采用不同的照射時(shí)間處理制備好的菌懸液，繪制致死率曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。研究發(fā)現(xiàn)，正突變往往出現(xiàn)在致死率較低的情況下，選擇致死率70%～80%的誘變條件處理菌株，除能獲得較高的正突變率外，還比較易于篩選[22]，從圖1可以看出，致死率為70%～80%時(shí)，誘變處理時(shí)間為60～90 s，選擇誘變時(shí)間90 s，處理出發(fā)菌株L6，誘變后的菌懸涂布于TTC雙層平板，篩選獲得54 株生長(zhǎng)良好、顯色明顯的突變菌株。

圖1 紫外誘變致死率曲線Fig.1 Lethality of UV mutagenesis

圖2 耐鹽產(chǎn)乙醇突變株的篩選結(jié)果Fig.2 Results of screening for ethanol-producing mutants

TTC是一種無(wú)色顯色指示劑，能與酵母菌無(wú)氧呼吸代謝產(chǎn)生乙醇過(guò)程中被乙醇脫氫酶脫掉的氫結(jié)合，還原成紅色的1,3,5-三苯甲臜，因此通過(guò)呈色的深淺可以判斷出乙醇脫氫酶活力大小及產(chǎn)乙醇能力的高低，顏色越深，說(shuō)明產(chǎn)乙醇能力越強(qiáng)[23]。TTC顯色篩選平板如圖2a（紅色圈標(biāo)注出的為顯色深的菌落），對(duì)比54 個(gè)顯色明顯的菌株，選出顯色較深的15 株，豆芽汁發(fā)酵測(cè)定乙醇積累量，結(jié)果見(jiàn)圖2b。可以看出，突變株1、4、7、8、12乙醇積累量均高于出發(fā)菌株L6，將其分別命名為L(zhǎng)6-1、L6-4、L6-7、L6-8和L6-12，其中L6-1的乙醇積累量最高，為2.71%，較出發(fā)菌株提高54.86%，經(jīng)5 次傳代及保藏，其在10% NaCl的豆芽汁培養(yǎng)基發(fā)酵中乙醇積累量平均為2.48%，具有良好的遺傳穩(wěn)定性，可以應(yīng)用于醬油發(fā)酵中。

2.2 突變株L6-1與出發(fā)菌株L6性能比較

在高鹽條件下，菌株的生長(zhǎng)性能往往會(huì)發(fā)生一些變化，如遲緩期延長(zhǎng)、對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率降低等。為研究L6-1和L6的生長(zhǎng)性能，分別測(cè)定其在10% NaCl豆芽汁培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3a。10% NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，L6-1和L6同時(shí)進(jìn)入和結(jié)束對(duì)數(shù)期，生長(zhǎng)周期一致，但是L6-1菌體濃度稍高于L6。由圖3b可知，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)由5%升高到16%時(shí)，L6-1和L6活菌數(shù)均下降104CFU/mL，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～14%的培養(yǎng)條件下，L6-1活菌數(shù)高于L6，而NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%的培養(yǎng)條件下，L6活菌數(shù)則超過(guò)L6-1，但相差不大，突變株L6-1具有較好的耐鹽能力，適合應(yīng)用到醬油發(fā)酵中。接種L6-1和L6到不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的豆芽汁培養(yǎng)基中，發(fā)酵72 h測(cè)定乙醇積累量，結(jié)果見(jiàn)圖3c。隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，乙醇積累量呈下降趨勢(shì)，與活菌數(shù)變化趨勢(shì)相符，說(shuō)明在液體培養(yǎng)基中活菌數(shù)直接影響了乙醇的積累，5%～14%的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)下L6-1相比L6產(chǎn)乙醇能力明顯增強(qiáng)，有應(yīng)用于醬油發(fā)酵的潛力。

圖3 L6與L6-1性能比較Fig.3 Comparison of growth and fermentation performance of L6 and L6-1

2.3 L6-1在高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油釀造中的應(yīng)用

2.3.1 添加L6-1對(duì)高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油乙醇含量及理化指標(biāo)的影響

魯氏接合酵母為醇香型酵母，可在pH 5.0～6.0的環(huán)境中生長(zhǎng)，主要作用于醬油發(fā)酵前期，這個(gè)階段主要是原料降解、乳酸菌產(chǎn)乳酸、魯氏接合酵母進(jìn)行乙醇發(fā)酵，過(guò)高或過(guò)低添加濃度都不利于乙醇的產(chǎn)生及醬油風(fēng)味的形成[24]。醬醪發(fā)酵開(kāi)始時(shí)pH值為6.5～7.0，發(fā)酵到25 d，pH值下降為5.5～6.0，有利于魯氏接合酵母的生長(zhǎng)及代謝，因此發(fā)酵25 d作為添加時(shí)間。前期預(yù)備實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用菌懸濃度107個(gè)細(xì)胞/mL、接種量5%能獲得較好的發(fā)酵效果，采用發(fā)酵至第25天的醬醪以上述菌懸濃度及接種量接種L6-1及L6，研究發(fā)酵醬醪中隨時(shí)間而變化的乙醇積累量及各項(xiàng)理化指標(biāo)。

圖4 高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬醪中乙醇積累量的變化Fig.4 Variations in ethanol content during high-salt liquid-state fermentation of soy sauce

醬油中的乙醇主要是由酵母菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)生，乙醇能賦予醬油特有的醇香風(fēng)味，并且為乙酯類風(fēng)味物質(zhì)的形成奠定基礎(chǔ)，完善醬油的風(fēng)味體系，同時(shí)還可抑制雜菌生長(zhǎng)，有利于醬油的保存，因此醬油中乙醇含量是評(píng)價(jià)釀造醬油品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[25]。如圖4所示，醬醪發(fā)酵25 d添加L6-1及L6，發(fā)酵進(jìn)行到45 d，乙醇積累量分別為1.00%、1.26%，分別比對(duì)照組提高78.57%、125%。發(fā)酵進(jìn)行到90 d，L6-1和L6的乙醇積累量分別降到0.58%、0.71%，分別高于對(duì)照組48.72%、82.05%。L6和L6-1對(duì)醬醪中的乙醇含量均有明顯提升作用，L6在高鹽稀態(tài)醬醪（16% NaCl）中發(fā)酵積累乙醇的能力比其突變株L6-1強(qiáng)，這與兩株菌在16% NaCl的豆芽汁培養(yǎng)基中表現(xiàn)一致，可見(jiàn)，在高鹽環(huán)境中，突變株L6-1的生長(zhǎng)能力弱于出發(fā)菌株L6，從而厭氧代謝產(chǎn)物乙醇的積累量略少；另外，L6-1乙醇積累量小于L6也可能是其生成的部分乙醇被進(jìn)一步用于合成乙酯類物質(zhì)，需要進(jìn)一步研究乙酯類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

醬油發(fā)酵的理化指標(biāo)主要有還原糖、總酸、氨態(tài)氮含量，其中氨態(tài)氮含量是醬油的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，而總酸含量也是判斷醬油質(zhì)量的重要指標(biāo)。醬油發(fā)酵中還原糖含量的變化能夠反映淀粉的降解與微生物消耗還原糖之間平衡的結(jié)果，總酸是發(fā)酵過(guò)程中微生物分解糖類底物而生成的各種有機(jī)酸，氨態(tài)氮由水解蛋白質(zhì)生成，氨態(tài)氮含量能夠顯示釀造醬油的呈味能力和發(fā)酵水平[26]。在發(fā)酵25 d的醬醪中接種L6-1、L6，對(duì)醬醪中還原糖、總酸和氨態(tài)氮含量進(jìn)行分析。由圖5a可知，發(fā)酵0～15 d，由于淀粉酶分解碳水化合物，生成低聚糖及葡萄糖等，還原糖呈上升趨勢(shì)，之后還原糖作為主要碳源被代謝生成乙醇、高級(jí)醇與有機(jī)酸等物質(zhì)，其含量開(kāi)始下降，添加L6-1的醬醪還原糖含量比添加L6下降速率更快；由圖5b可知，發(fā)酵0～15 d，總酸含量迅速上升，隨后增速變緩，發(fā)酵60 d，總酸達(dá)到最高后開(kāi)始下降，這一階段是有機(jī)酸類物質(zhì)與乙醇等醇類物質(zhì)成酯的時(shí)期，醬香在這一階段開(kāi)始形成，75 d后由于芽孢桿菌等細(xì)菌的作用，總酸又出現(xiàn)了小幅升高，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中總酸質(zhì)量濃度均未超過(guò)25 g/L，符合釀造醬油標(biāo)準(zhǔn)；由圖5c可知，發(fā)酵0～30 d是米曲霉蛋白酶的主要作用時(shí)期，蛋白酶水解蛋白質(zhì)使氨態(tài)氮含量上升，45～75 d由于美拉德反應(yīng)及微生物作用，游離氨基酸被消耗，氨態(tài)氮含量下降，75 d以后，由于細(xì)菌的作用，氨態(tài)氮含量略有升高，從發(fā)酵30 d開(kāi)始，醬油氨態(tài)氮含量開(kāi)始保持在7 g/L以上，達(dá)到一級(jí)釀造醬油的標(biāo)準(zhǔn)?？傮w而言，添加L6-1及L6發(fā)酵均有利于還原糖降解，在積累乙醇的同時(shí)對(duì)釀造醬油重要指標(biāo)總酸及氨態(tài)氮的影響較小。

圖5 高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬醪中理化指標(biāo)的變化Fig.5 Variations in physicochemical indicators during high-salt liquid-state fermentation of soy sauce

2.3.2 添加L6-1對(duì)高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

耐鹽產(chǎn)乙醇酵母對(duì)醬油風(fēng)味的形成發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可在代謝過(guò)程中利用糖類等物質(zhì)代謝產(chǎn)生乙醇、高級(jí)醇、芳香雜醇以及酮、酚等物質(zhì)，醇類物質(zhì)可進(jìn)一步與酸類物質(zhì)形成酯類香氣成分[27]。揮發(fā)性物質(zhì)成分是微生物綜合作用的結(jié)果，也是衡量醬油品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[28]。采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析樣品中揮發(fā)性物質(zhì)成分，結(jié)果見(jiàn)圖6及表1。

圖6 高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類Fig.6 Numbers of volatile components in HLF soy sauces

發(fā)酵結(jié)束時(shí)，對(duì)照組和添加L6-1與L6發(fā)酵組的物質(zhì)種類數(shù)分別為37、47、27 種。如圖6所示，添加L6-1的發(fā)酵醬油中酯類物質(zhì)、醇類物質(zhì)（不含乙醇）、醛類物質(zhì)、酚類物質(zhì)、酮類物質(zhì)、酸類物質(zhì)分別為17、14、5、4、4、1 種，分別比L6添加組多2、10、4、1、3、0 種。內(nèi)標(biāo)法定量分析計(jì)算各物質(zhì)的含量，結(jié)果見(jiàn)表1，可以看出L6-1、L6、對(duì)照組的發(fā)酵醬油中醇類含量分別為1 507.87、1 743.72、1 177.63 ng/g，L6-1添加組與L6添加組分別較對(duì)照組提高28.04%、48.07%；雖然添加L6-1發(fā)酵醬油醇類物質(zhì)總含量比添加L6醬油低，但添加L6-1的醬油中醇類物質(zhì)種類更加豐富；酯類物質(zhì)種類分別為17、15、17 種，含量分別為828.72、583.72、518.56 ng/g，L6-1添加組與L6添加組在酯類物質(zhì)種類差別不大的情況下，其含量分別較對(duì)照組提高59.81%、12.57%，其中L6-1添加組乙酯類物質(zhì)含量最高，為605.64 ng/g，比添加L6及對(duì)照組的發(fā)酵醬油分別提高6.79%及20.61%。結(jié)合其乙醇積累量的變化可知，L6-1積累的乙醇部分被用來(lái)合成乙酯類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，增加了醬油香氣的豐富度，因此添加L6-1有利于醬油香氣成分的多樣性。

結(jié)合表1可知，醇類物質(zhì)中，具有玫瑰花香的苯乙醇在3 種發(fā)酵醬油中都有檢測(cè)到，添加L6-1發(fā)酵醬油中含量最高為1 217.78 ng/g，分別比對(duì)照組與添加L6的發(fā)酵醬油高出52.57%、9.21%，有肉湯香的3-甲硫基丙醇在對(duì)照組與添加L6-1的醬油中都有檢測(cè)到，具有蘑菇香的3-辛醇、常用作食用香料的二異丁基甲醇只在添加L6-1的醬油中檢測(cè)到，雖然這3 種物質(zhì)含量低，但其香氣閾值低，對(duì)醬油香氣貢獻(xiàn)大；酯類物質(zhì)中，具有玫瑰香氣的乙酸苯乙酯只在添加L6-1的發(fā)酵組中檢測(cè)出，另外添加L6-1的醬油中一些重要的乙酯類香氣物質(zhì)苯甲酸乙酯（水果氣味）、琥珀酸二乙酯（食品加香劑）、辛酸乙酯（水果香）、乙酸苯乙酯（煙草、玫瑰香）、癸酸乙酯（葡萄香）、月癸酸乙酯（樹(shù)葉香）、十四酸乙酯（鳶尾油香）、棕櫚酸乙酯（蠟香）的含量均不同程度高于其他實(shí)驗(yàn)組，它們可緩沖醬油的咸味并通過(guò)抑制胺類和部分脂肪酸類物質(zhì)的刺激感及苦味賦予醬油良好的風(fēng)味[29]；醛類物質(zhì)中，苯乙醛在3 種發(fā)酵醬油中都有檢測(cè)出，L6對(duì)苯乙醛有提升作用，但具有杏仁味的糠醛、苯甲醛和具有可可香味與水果香味的2-苯基巴豆醛、異戊醛只在添加L6-1的醬油中檢測(cè)到；酚類物質(zhì)中，L6對(duì)異丁香酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚均有提升作用，2-甲氧基-4-乙烯基苯酚與麥芽酚只在添加L6-1的醬油中檢測(cè)出，2-甲氧基-4-乙烯基苯酚具有丁香味，麥芽酚有焦奶油硬糖的味道，起到增香、固香、增甜的作用，對(duì)醬油香氣影響較大[30]。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定量分析結(jié)果說(shuō)明添加L6-1能夠促進(jìn)醬油風(fēng)味物質(zhì)的形成，提高醬油風(fēng)味物質(zhì)的豐富度。

表1 高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分及含量Table 1 Volatile flavor compositions of HLF soy sauces

續(xù)表1

對(duì)發(fā)酵醬油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)一步進(jìn)行主成分分析，從醇類、酯類、醛類、酚類、酮類、酸類、其他物質(zhì)七大類物質(zhì)中提取出2 個(gè)主成分，各主成分的貢獻(xiàn)率及總貢獻(xiàn)率如表2所示，所提取的2 個(gè)主成分總貢獻(xiàn)率達(dá)到100.00%，能充分解釋各個(gè)原始成分。各主成分載荷圖如圖7所示，在PC1軸上，醇類、醛類、酮類、酸類的相關(guān)性系數(shù)較大，因此可用PC1解釋這4 類物質(zhì)，其中醇類、醛類及酮類物質(zhì)呈正相關(guān)，而酸類物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)；PC2軸顯示，酯類、酚類、其他物質(zhì)的相關(guān)性系數(shù)較大，因此可用PC2解釋這3 類物質(zhì)。

表2 主成分方差貢獻(xiàn)情況Table 2 Contribution rates of principal components to total variance

圖7 主成分載荷圖Fig.7 Loading plot of principal components

計(jì)算各變量的主成分得分系數(shù)并計(jì)算各主成分得分，得到最終總得分計(jì)算公式：F總=0.737F1＋0.263F2，各醬油樣品主成分得分及總得分如表3所示。

表3 醬油樣品主成分得分Table 3 Principal component scores of soy sauces

由表3可看出，總得分對(duì)照組最低，則L6-1與L6對(duì)醬油的風(fēng)味呈正向貢獻(xiàn)，且L6-1得分最高，因此，突變株L6-1有明顯提升醬油風(fēng)味的作用。L6在PC1上得分較高，PC1與醇類、醛類、酮類的相關(guān)性系數(shù)較大，說(shuō)明L6對(duì)此三類物質(zhì)貢獻(xiàn)較大；L6-1在PC2上得分較高，PC2與酯類、酚類、其他的相關(guān)性系數(shù)較大，同時(shí)PC1上也有較好得分，由于PC1得分的權(quán)重系數(shù)為0.737，L6-1的總得分與PC1和PC2都有較大相關(guān)性，說(shuō)明L6-1除醇類、醛類、酮類物質(zhì)貢獻(xiàn)較大外，酯類、酚類、其他類物質(zhì)的貢獻(xiàn)也較大。綜合乙醇積累量、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類、含量及貢獻(xiàn)度，可以發(fā)現(xiàn)，突變株L6-1接入醬醪后，除提高乙醇為主的醇類化合物種類和含量之外，還對(duì)醬油重要的香氣成分酯類，特別是乙酯類物質(zhì)的形成起到了重要的促進(jìn)作用，有效地豐富了釀造醬油的風(fēng)味。

3 結(jié) 論

醬油釀造由傳統(tǒng)的曬露法及低鹽固態(tài)發(fā)酵發(fā)展為現(xiàn)代高鹽稀態(tài)發(fā)酵，其封閉的發(fā)酵設(shè)備大幅減少了污染菌的質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也影響了釀造醬油的風(fēng)味。以魯氏接合酵母L6為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外誘變選育了1 株在10% NaCl豆芽汁培養(yǎng)基中能很好積累乙醇的突變株L6-1，16% NaCl高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬醪中對(duì)比研究L6-1和L6，發(fā)現(xiàn)醬醪發(fā)酵45 d時(shí)兩株菌乙醇含量均達(dá)到了最高，分別比對(duì)照組提高了78.57%和125%，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，其乙醇積累量有所下降；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定量分析發(fā)現(xiàn)，添加L6-1的發(fā)酵醬油除乙醇外的醇類物質(zhì)以及酯類物質(zhì)（特別是乙酯類物質(zhì)）的豐富度均好于L6，其中乙酯類風(fēng)味物質(zhì)含量最高為605.64 ng/g，比添加L6及對(duì)照組的發(fā)酵醬油分別提高了6.79%及20.61%；主成分分析并評(píng)分發(fā)現(xiàn)，添加突變株L6-1的發(fā)酵醬油得分最高，進(jìn)一步說(shuō)明了L6-1除提高醬油乙醇含量外，對(duì)醬油風(fēng)味物質(zhì)的豐富度及風(fēng)味具有良好的促進(jìn)作用。選育耐鹽產(chǎn)乙醇酵母，能促進(jìn)醬醪發(fā)酵中乙醇及乙醇為底物的乙酯及其他物質(zhì)的積累，在提高醬油醇香風(fēng)味的同時(shí)有效提升了醬油風(fēng)味的豐富度，這為今后醬油釀造風(fēng)味菌的選育提供了一條圍繞核心代謝產(chǎn)物選育的思路，將更有效地提升釀造醬油的品質(zhì)。

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