吳小延，李丹，楊鑫華，劉小云，龍亞康，王芳，鄧玲

510060 廣州，中山大學腫瘤防治中心，華南腫瘤學國家重點實驗室(吳小延、楊鑫華、劉小云、龍亞康、王芳、鄧玲);510095廣州，廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 核醫(yī)學科(李丹)

近年來，隨著國家大力推進精準醫(yī)療計劃，高通量測序技術(shù)在臨床檢測應用上取得極大的發(fā)展，其應用已擴展至腫瘤個體化治療、遺傳疾病風險預測、傳染性疾病基因及心血管疾病等其他復雜疾病的臨床診斷和治療中，檢測范圍涵蓋各個領(lǐng)域[1-8]。然而，高通量測序技術(shù)作為一種快速崛起的新技術(shù)，目前尚缺乏系統(tǒng)性的法規(guī)或指南來規(guī)范高通量測序技術(shù)檢測項目的開展，只能參考國內(nèi)外有關(guān)學會已出臺的零散的相關(guān)共識與指南[9-14]。高通量測序技術(shù)是由許多細小過程聯(lián)結(jié)或嵌套組成的一個極為復雜的檢測過程，由于該技術(shù)實驗操作步驟較多，檢測流程復雜，數(shù)據(jù)信息量大等因素，故需要進行合理的質(zhì)量控制才能使檢測質(zhì)量達到既定要求[15-17]。國內(nèi)高通量測序技術(shù)平臺多，設(shè)計Panel的大小及檢測基因類型均有差別，因此，對高通量測序技術(shù)進行質(zhì)量控制已經(jīng)成為臨床實驗室迫切的需求和面臨的巨大挑戰(zhàn)[10,18-19]。為了保證檢測結(jié)果的準確性、穩(wěn)定性和可靠性，應建立具體的規(guī)范化的檢測流程與增加必要的內(nèi)部質(zhì)量控制方案，來及時發(fā)現(xiàn)及把控檢測過程中存在的質(zhì)量風險。因此將質(zhì)控樣本和臨床樣本同時進行檢測可保證檢測過程的有效性。本研究利用Illumina NextSeq500平臺，人多基因突變檢測通用試劑盒(燃石醫(yī)學檢驗所有限公司，295 Panel)，結(jié)合我們實驗室的建庫流程，對攜帶表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、間變淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)、酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor,KIT)和大鼠內(nèi)瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)4種已知基因及7種突變類型樣本，按比例混合稀釋成基因突變頻率均為5.00%和2.50%的兩個質(zhì)控品，通過對質(zhì)控品特異性、均一性及穩(wěn)定性的高通量檢測結(jié)果差異對比分析,以期使高通量測序技術(shù)流程更穩(wěn)定，結(jié)果更可靠。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集中山大學腫瘤防治中心分子診斷科標本庫經(jīng)過燃石醫(yī)學檢驗所有限公司，295 Panel高通量檢測已知EGFR、ALK、KIT和KRAS基因突變類型及野生型的福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE)組織樣本，并通過蘇州吉因加生物醫(yī)學工程有限公司的人1 021基因突變檢測試劑盒的高通量測序法校驗其突變，且分別將EGFR、ALK、KIT和KRAS4種基因共7個突變位點按5.00%、2.50%的突變頻率混入全陰野生型樣本，作為外部質(zhì)控品。

1.2 高通量測序

常規(guī)石蠟包埋組織切片，根據(jù)HE染色結(jié)果，富集腫瘤細胞區(qū)域(大于20%)并按試劑盒說明書進行組織DNA提取(FFPE DNA Kit試劑盒，QIAGENA公司)。利用Illumina公司NextSeq500測序儀進行測序，其檢測流程及工作原理(圖1)為：將基因組DNA經(jīng)超聲波打斷成200 bp左右的片段；進行末端修復加堿基A；加上接頭制備成文庫。將樣本文庫加入到測序芯片上，進行橋式PCR擴增，形成DNA簇，通過有熒光標記的脫氧核糖核苷三磷酸，進行邊合成邊測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用燃石醫(yī)學有限公司提供的標準化自動樣本管理與數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對原始數(shù)據(jù)進行過濾并進行生物信息學分析。

1.4 均一性評價

為保證質(zhì)控樣本的均一性，將制備好的質(zhì)控品隨機抽取10支進行均一性評價，用相同的儀器、試劑及同一人進行檢測。

1.5 穩(wěn)定性評價

1.5.1短期穩(wěn)定性實驗 隨機抽取在冷凍條件下(-20℃)保存的5.00%、2.50%的突變質(zhì)控品，做好標記，分別放于指定溫度(2℃～8℃、25℃)，每種條件放置10支。從第0周開始，每周抽取2支，用高通量檢測試劑盒檢測，連續(xù)監(jiān)測1個月。

1.5.2長期穩(wěn)定性實驗 隨機抽取置于-20℃冷凍保存的5.00%、2.50%的突變質(zhì)控品2支，用高通量檢測試劑盒檢測，每月分別檢測1次，連續(xù)檢測12個月。

1.5.3測序深度評價 將稀釋好的5.00%、2.50%陽性質(zhì)控品分別降采樣到3 000×、2 000×、900×、700×、500×、400×、350×、200×，每個深度分別取3次，然后利用Illumina公司NextSeq500測序儀進行檢測，以觀察測序深度與靈敏度的關(guān)系，進一步驗證質(zhì)控品的穩(wěn)定性。

圖1 基于捕獲高通量測序技術(shù)檢測流程

1.6 特異性實驗

采用人多基因突變檢測通用試劑盒(燃石醫(yī)學檢驗所有限公司，295 Panel)分別對5.00%、2.50%的突變質(zhì)控品進行檢測，檢測中使用相同的劑量，儀器消耗品及同一位操作人員。對比結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 人1 021基因突變檢測結(jié)果

本研究對選取已知EGFR、ALK、KIT和KRAS4種基因突變類型的FFPE腫瘤樣本的人1 021基因突變檢測試劑盒檢測情況分析結(jié)果顯示，選取的樣本均攜帶基因突變，共有7種突變類型(包括小片段缺失、插入、點突變和融合)，說明選取的臨床樣本含有目的片段，將臨床樣本測序后證明符合預期實驗結(jié)果。具體結(jié)果見圖2、表1。

2.2 質(zhì)控品5.00%、2.50%的高通量檢測結(jié)果

通過對質(zhì)控品5.00%的高通量測序結(jié)果分析顯示，共檢出5種基因突變類型(因5.00%突變頻率高，稀釋量超出總體積量，故只選取了5個突變類型的樣本)，突變頻率在3.70%～5.60%(表2)。通過對質(zhì)控品2.50%的高通量測序結(jié)果分析顯示，共檢出7種基因突變類型，突變頻率在1.90%～3.10%(表2)。

2.3 均一性實驗

對隨機抽取的10個5.00%、2.50%質(zhì)控品進行室內(nèi)質(zhì)控品日內(nèi)重復性測定，突變率差異在正常變化范圍內(nèi)，5.00%質(zhì)控品和2.50%質(zhì)控品CV均<10%，從圖3、4所示數(shù)據(jù)可以看出符合質(zhì)控品的日內(nèi)重復性要求，證明重復性良好結(jié)果。

2.4 穩(wěn)定性實驗

圖2 突變型標本和野生型標本的高通量測序結(jié)果

表1 高通量測序檢測陽性標本結(jié)果

表2 質(zhì)控品5.00%、2.50%高通量測序結(jié)果

圖3 5.00%質(zhì)控品的室內(nèi)質(zhì)控日內(nèi)重復性分析(N=10)

圖4 2.50%質(zhì)控品的室內(nèi)質(zhì)控日內(nèi)重復性分析(N=10)

圖5 5.00%、2.50%質(zhì)控品不同溫度下短期穩(wěn)定性結(jié)果

圖6 5.00%、2.50%質(zhì)控品-20℃長期穩(wěn)定性結(jié)果

圖7 5.00%質(zhì)控品不同測序深度與靈敏度的關(guān)系

圖8 2.50%質(zhì)控品不同測序深度與靈敏度的關(guān)系

圖9 5.00%質(zhì)控品Levey-Jennings質(zhì)控圖

圖10 2.50%質(zhì)控品Levey-Jennings質(zhì)控圖

2.5 特異性試驗

同時采用人多基因突變檢測通用試劑盒(燃石醫(yī)學檢驗所有限公司，295 Panel)分別對5.00%、2.50%的突變質(zhì)控品進行檢測，只有7個突變位點，并無其他交叉陽性，特異性符合要求。

3 討 論

目前我國和世界上各實驗室所使用的高通量檢測均為實驗室自建試驗。這意味著高通量檢測在臨床應用中具有非常大的靈活性，也意味著高通量檢測臨床應用具有較大的風險性，這給高通量檢測實驗室的管理、人員培訓和質(zhì)量控制等(包括檢測實驗和生物學信息分析)帶來巨大的壓力[21-23]。二代測序檢測項目與傳統(tǒng)檢測項目相比具有質(zhì)控點多、自配試劑多、指南標準少及檢驗過程的性能驗證和確認還不完備[24-25]等特點。因此，高通量實驗室室內(nèi)質(zhì)量控制(internal quality control，IQC) 是保證實驗結(jié)果準確的重要環(huán)節(jié)，已成為各級實驗室日常工作中一項不可或缺的內(nèi)容。本研究嚴格按照高通量測序技術(shù)的質(zhì)量控制要求及方法，并且自制外部質(zhì)控品進行IQC，以保證檢測結(jié)果的準確性與穩(wěn)定性。分析前對樣本的運輸和保存進行質(zhì)量控制，分析中需要病理醫(yī)師對可評估的樣本進一步明確病理診斷，并評價標本有無出血、壞死和不利于核酸檢測的前處理(例如含鹽酸脫鈣液處理)，病變細胞(如腫瘤細胞)的總量和比例，避免假陰性：組織標本中腫瘤細胞含量建議達到20%以上，低于此標準可富集后檢測[26-29]；再如，在進入高通量檢測流程環(huán)節(jié)，核酸質(zhì)量是高通量檢測成功的關(guān)鍵因素[30]，在制備文庫前應采用多種方法對核酸質(zhì)量進行評估，包括純度、濃度和完整性分析[31-33]；在文庫制備過程中，需要對文庫的濃度，片段大小等進行質(zhì)量分析，每個檢測項目應設(shè)定其文庫質(zhì)量的要求，明確接受或拒絕的標準；分析后需要對下機數(shù)據(jù)進行初步質(zhì)量控制，看數(shù)據(jù)質(zhì)量是否滿足生信分析需求等等。

基因組DNA能夠涵蓋包括野生型、純合突變型和雜合突變型在內(nèi)的所有突變類型。因此本研究利用日常檢驗陽性及陰性樣本自制質(zhì)控品，將檢測樣本作為質(zhì)控品可以模擬基因組復雜性，與檢測標本具有相同性質(zhì)，既符合臨床檢測的需要又節(jié)省了成本，同時該質(zhì)控物穩(wěn)定性和特異性較強。此核酸質(zhì)控品從日常檢測的樣本中獲取，一般選擇核酸溶液超過100 μL且濃度高于100 ng /μL 的樣本核酸，根據(jù)200 ng的投入量需求，每次實驗僅需要1～2 μL質(zhì)控核酸，此質(zhì)控品可以保證一個實驗室6個月以上的IQC需要。本實驗選擇的自制質(zhì)控品從來源上難以大量獲得，且未經(jīng)過嚴格的標準物篩選檢測，但樣本混合后檢測的實際突變頻率與預期突變頻率基本一致，但是也有個別差異稍大，原因可能有如下幾點：樣本間的差異性、探針捕獲效率的不同、在稀釋混合樣本中帶來的誤差等，這些都可能導致后面檢測結(jié)果突變頻率的偏差。雖然質(zhì)粒沒有來源限制，且突變頻率比較容易控制，但是質(zhì)粒不能檢測核酸提取過程，不能全面地監(jiān)控試劑盒的檢測能力。

綜上，本實驗室自制質(zhì)控品達到了本研究所建立的高通量測序技術(shù)檢測流程及內(nèi)部質(zhì)控標準體系的全部參考數(shù)值，突變頻率在2.50%～5.00%也能被穩(wěn)定檢測出，未出現(xiàn)假陰性，說明質(zhì)控品的建立可以使檢測結(jié)果可靠、準確度高，顯示該標準體系的參數(shù)具有廣泛的參考意義，對測序結(jié)果正確性、穩(wěn)定性起到舉足輕重的作用，也為同行或即將開展該門技術(shù)的相關(guān)醫(yī)技和科研人員提供參考或借鑒意義，同時促進高通量測序技術(shù)更好地進入臨床應用和科研工作中，以助精準醫(yī)療一臂之力。

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