韓藝凡，繆文麗，張慧慧，冷運(yùn)儒，郎 朗

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 英才學(xué)院，哈爾濱 150076)

刺五加和板藍(lán)根藥用的由來(lái)已久，是中國(guó)傳統(tǒng)中藥.刺五加味辛、微苦、性溫，具有益氣健脾、補(bǔ)腎安神的功效[1]，適用于腎肺兩虛、心脾不足、失眠多夢(mèng)等癥[2]，近代臨床研究表明，刺五加中含有多種活性化學(xué)成分，具有抗衰老，抗癌，降血糖等作用[3-6]，目前廣泛用于治療風(fēng)濕病、冠心病、心絞痛和腦梗死等[7].板藍(lán)根性味苦寒，具有清熱解毒、涼血、利咽的功效[8]，適用于溫?zé)岚l(fā)病，癰腫瘡毒等[9]，在臨床上常被用于治療流感、扁桃體炎、毛細(xì)支氣管炎、防治流行性乙型腦炎等[10-12]，板藍(lán)根顆粒能有效預(yù)防流行性感冒發(fā)熱，為家庭常備藥[13].有機(jī)氯農(nóng)藥的危害極大，可影響男性生育功能，有致畸和潛在的致癌威脅[14]，藥材中有機(jī)氯農(nóng)藥的殘留不僅會(huì)影響藥材質(zhì)量，食用后還會(huì)堆積于脂肪組織，損傷機(jī)體，危害人類健康[15].因此建立能夠準(zhǔn)確測(cè)定有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的方法變得極為重要.本試驗(yàn)以刺五加、板藍(lán)根為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)影響超聲提取法提取效率的3個(gè)因素(提取溫度、提取時(shí)間、丙酮-二氯甲烷組成比例)進(jìn)行正交試驗(yàn)，并結(jié)合氣相色譜法進(jìn)行殘留農(nóng)藥的含量測(cè)定，選出最優(yōu)提取條件，為合理安全使用中藥材提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺五加：遼寧省朝陽(yáng)市某中草藥種植產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)；

板藍(lán)根：吉林撫松縣某大型中藥材種植基地.

濃硫酸(優(yōu)級(jí)純)、正己烷(分析純)、丙酮(分析純)、二氯甲烷(分析純)、無(wú)水硫酸鈉(分析純)、氯化鈉(分析純)、正己烷(色譜純)試劑均為國(guó)產(chǎn).

標(biāo)準(zhǔn)品與供試樣品：六氯苯(HCBs)、γ-六六六(γ-HCH)、七氯(Heptachlor)、反式氯丹(Trans-chlordane)(質(zhì)量濃度20 μg/mL)、p, p′-DDT(質(zhì)量濃度100 μg/mL)、艾氏劑(Aldrin)均購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心.

1.2 儀器

美國(guó)Agilent公司生產(chǎn)的MSD 質(zhì)譜檢測(cè)器和6890N氣相色譜儀(ECD檢測(cè)器)；鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司生產(chǎn)的SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵；上海一恒科技有限公司生產(chǎn)的DZF-6030A型真空干燥箱；深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司生產(chǎn)的JP-030ST型超聲波清洗機(jī)；

1.3 色譜條件

選用規(guī)格為HP-5 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)的Agilent彈性石英毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度為290 ℃；檢測(cè)器的溫度300 ℃；進(jìn)樣量為1.0 μL；色譜柱進(jìn)行程序升溫：開(kāi)始溫度為100 ℃，恒溫1 min，先以10 ℃/min的升溫速率加熱至200 ℃，恒溫2 min，再以8 ℃/min的升溫速率加熱至280 ℃，恒溫2 min；采取不分流進(jìn)樣方式，將N2(>99.999%)作為載氣：1.5 mL/min(恒流)，外標(biāo)法定量.電子電離源；電離能量為70 eV；發(fā)射電流為0.2 mA；光電倍增器的電壓350 V；離子源的加熱溫度為200 ℃；氣相色譜接口溫度為285 ℃；掃描質(zhì)量范圍為50～450 amu；掃描速度為1 s/scan；溶劑延遲時(shí)間為4 min.

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 提取方法

準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品藥材與10 g無(wú)水硫酸鈉于250 mL具塞錐形瓶?jī)?nèi)混勻，呈松散狀.加入30 mL一定比例的丙酮-二氯甲烷(2+1、1+1、1+2)浸泡12 h，超聲提取一定時(shí)間(15、20、25 min).靜置5 min，過(guò)濾，適用旋蒸瓶直接收集濾液，所剩殘?jiān)俜謩e加入30 mL丙酮，重復(fù)超聲提取3次，并合濾液.將提取液于一定溫度(20、30、40 ℃)水浴上減壓濃縮，加5 mL正己烷，操作如上，反復(fù)幾次至溶液近干，即可除凈二氯甲烷和丙酮.將所得溶液轉(zhuǎn)移到離心管中，正己烷定容至5 mL.緩慢加入1 mL濃硫酸，振蕩搖動(dòng)約1 min，離心(3 000 r·min-1) 10 min.取上清液，即得.

1.4.2 有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量測(cè)定方法

1) 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

用正己烷分別將六氯苯、γ-六六六、七氯、艾氏劑、p, p′-DDT、反式氯丹6種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液.精密量取1 mL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液定容至10 mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度均為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液.

2) 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

將質(zhì)量濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，分別用正己 烷稀釋成5個(gè)不同的質(zhì)量濃度，其中六氯苯、七氯、反式氯丹、p, p′-DDT分別配制成質(zhì)量濃度為5、50、100、200、1 000 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液；γ-六六六、艾氏劑分別配制成質(zhì)量濃度為5、50、100、200、250 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液.按照“1.3”的條件進(jìn)樣，平行3次試驗(yàn)，進(jìn)行線性回歸，利用Excel制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程.

3) 有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量的測(cè)量

取3份供試品藥材，按“1.4.1”制備供試品，按“1.3”進(jìn)樣，進(jìn)行GC分析，得到相應(yīng)的峰面積，根據(jù)回歸方程計(jì)算供試樣品藥材中殘留的含有機(jī)氯農(nóng)藥量.

1.4.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化

選取提取溫度、提取時(shí)間、丙酮-二氯甲烷組成比例3個(gè)因素作為考察對(duì)象分別為A、B、C.如表1所示，選擇3個(gè)水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，選用L9(34)正交表，把其中一列視為空白列，對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出最優(yōu)提取條件.

表1 刺五加、板藍(lán)根中有機(jī)氯正交設(shè)計(jì)因素水平表

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 有機(jī)氯農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線

6種有機(jī)氯農(nóng)藥均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2.在測(cè)定刺五加和板藍(lán)根中殘留的含有機(jī)氯農(nóng)藥量時(shí)，只需將通過(guò)色譜法得到的峰面積值代入對(duì)應(yīng)有機(jī)氯農(nóng)藥的回歸方程，即可計(jì)算出相應(yīng)含農(nóng)藥殘留量.

表2 有機(jī)氯農(nóng)藥的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

刺五加中檢測(cè)出p, p′-DDT、六氯苯和七氯三種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留，表3為三種農(nóng)藥的正交試驗(yàn)結(jié)果，表4為結(jié)果分析，表5為方差分析.板藍(lán)根中檢測(cè)出p, p′-DDT和七氯兩種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留，結(jié)果見(jiàn)表6～8.表6為兩種農(nóng)藥的正交試驗(yàn)結(jié)果，表7為結(jié)果分析，表8為方差分析.由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，提取溫度、提取時(shí)間和丙酮-二氯甲烷組成比例對(duì)刺五加、板藍(lán)根中殘留有機(jī)氯農(nóng)藥的提取效果影響趨勢(shì)相同.由方差分析可知，提取溫度和提取時(shí)間對(duì)刺五加、板藍(lán)根中殘留有機(jī)氯農(nóng)藥的提取均具有顯著影響，而溶劑比例對(duì)農(nóng)藥的提取無(wú)顯著影響，確定其影響因素的大小是：A>B>C，即提取溫度(℃)>提取時(shí)間(min)>丙酮-二氯甲烷組成比例.由表3、4和表6、7可知刺五加、板藍(lán)根中有機(jī)氯農(nóng)藥提取的最優(yōu)方案均為A3B3C3，即最優(yōu)提取條件為：提取溫度40 ℃、提取時(shí)間25 min、丙酮-二氯甲烷(1+2)作提取溶劑.

表3 刺五加中有機(jī)氯試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果

表4 刺五加中有機(jī)氯試驗(yàn)結(jié)果分析

表5 刺五加中有機(jī)氯方差分析

表6 板藍(lán)根中有機(jī)氯試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果

表7 板藍(lán)根中有機(jī)氯試驗(yàn)結(jié)果分析

含p.p'-DDT量/(μg·kg-1)K184.38101.00125.76135.22K2111.51135.70125.27113.88K3186.03145.22130.89132.82k128.1333.6741.9245.07k237.1745.2341.7637.96k362.0148.4143.6344.27極差R33.8814.741.877.11因素主次ABC優(yōu)方案A3B3C3

表8 板藍(lán)根中有機(jī)氯方差分析

3 結(jié) 語(yǔ)

本文通過(guò)方差分析確定三因素的影響大小為順序?yàn)? 提取溫度(℃)>提取時(shí)間(min)>丙酮-二氯甲烷組成比例.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明刺五加、板藍(lán)根中殘留有機(jī)氯農(nóng)藥的最優(yōu)提取條件為：A3B3C3，即在40 ℃下用30mL的丙酮-二氯甲烷(1+2)超聲提取25 min.