畢榮生

摘? 要：目的：本次試驗(yàn)的目的在于通過對(duì)伊曲康唑注射液無菌檢查法的建立及方法優(yōu)化研究，選擇出更加適合伊曲康唑注射液無菌控制的檢查方法。方法：本次試驗(yàn)方法參照《中國(guó)藥典》中的無菌檢查法，篩選出伊曲康唑注射液的最優(yōu)無菌檢查法，選用三種溶液，分別為0.1%的蛋白胨水溶液、pH值為7.0的氯化鈉蛋白胨緩沖液以及0.9%的無菌氯化鈉溶液作為沖洗溶液，應(yīng)用薄膜過濾法，將多種菌種多為試驗(yàn)菌進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。通過這種方式形成三種試驗(yàn)方法，對(duì)伊曲康唑注射液進(jìn)行無菌檢查。結(jié)果：通過試驗(yàn)對(duì)比分析，可以看出方法2與方法1雖然沖洗溶液不同，但是檢查效果相同，其中0.1%的蛋白胨水溶液成本要更低。方法3雖然所用沖洗量比較少，但是操作過程比較復(fù)雜，沖洗過程中容易出現(xiàn)結(jié)晶的情況，不便過濾，綜合對(duì)比之后，建議選擇方法1進(jìn)行伊曲康唑注射液的無菌檢查。結(jié)論：選擇方法1進(jìn)行伊曲康唑注射液的無菌檢查，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，值得推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：伊曲康唑注射液;無菌檢查法;薄膜過濾法

伊曲康唑注射液是比較常見的一種廣譜抗真菌藥，主要用于各種由致病菌導(dǎo)致的感染疾病的治療。主要是通過抑制真菌細(xì)胞膜所需的麥角固醇的合成，破壞真菌細(xì)胞膜的形成，最終殺滅真菌。伊曲康唑注射液在治療期間不會(huì)對(duì)身體其它功能器官造成損傷，治療效果顯著，安全性比較好。伊曲康唑注射液因?yàn)槭怯糜谡婢腥镜闹委煟虼藢?duì)伊曲康唑注射液本身的無菌要求比較高，無菌檢查是保證注射液安全無菌的重要途徑。此前雖然已經(jīng)有過對(duì)伊曲康唑注射液的無菌檢查的研究，但是并不明確。本文根據(jù)要求，重新對(duì)伊曲康唑注射液的無菌檢查方法進(jìn)行優(yōu)化研究，用3種不用的稀釋溶液通過薄膜過濾法確定出最有效的無菌檢查法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

WCP-600隔水式培養(yǎng)箱;LRH-250生化培養(yǎng)箱;HTY-2000封閉式集菌儀;HFsafe-760s型生物安全柜;KSF220集菌培養(yǎng)器。

1.2 菌種、樣品

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌。以上菌種均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心，試驗(yàn)用菌株均為第2代。樣品為規(guī)格為25mL：0.25g的伊曲康唑注射液。

1.3 沖洗液與培養(yǎng)基

pH值為7.0的氯化鈉蛋白胨緩沖液，0.1%的蛋白胨水溶液，0.9%的無菌氯化鈉溶液，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，改良馬丁培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基適用性檢查均符合《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24h;接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48h，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數(shù)小于100CFU的菌懸液。接種黑曲霉菌至改良馬丁瓊脂斜面，25℃培養(yǎng)7d，用0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫孢子，制成每1ml含孢子數(shù)小于100CFU的孢子懸液。結(jié)果見表1。

2.2 供試液制備

取伊曲康唑注射液樣晶，去除外包裝，以無菌操作方法消毒處理備用，接種每種培養(yǎng)基的檢驗(yàn)數(shù)量為20支，檢驗(yàn)量為12.5ml。

2.3 驗(yàn)證方法

2.3.1 試驗(yàn)管

試驗(yàn)管中取供試液，采用薄膜過濾法，用0.1%蛋白胨水溶液為沖洗液：沖洗500mL/膜，100mL次作為方法1;pH7.0氯化鈉蛋：白胨緩沖液為沖洗液沖洗500mL/膜，100mL/次作為方法2;每支伊曲康唑注射液以50mL0.9%無菌氣化鈉溶液稀釋，薄膜過濾，再以0.9%無菌氯化鈉溶液為沖洗液，沖洗500mL/膜，100mlL/次作為方法3，進(jìn)行處理過濾試驗(yàn)，最后一次沖洗液中加入少于100CFU的試驗(yàn)菌。過濾后每個(gè)培養(yǎng)管內(nèi)灌注培養(yǎng)基，培養(yǎng)觀察5d。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置30-35℃培養(yǎng)，改良馬丁培養(yǎng)基置23～28℃培養(yǎng)，觀察5d，結(jié)果見表2。

2.3.2 對(duì)照管

不加入供試液，按2.3.1試驗(yàn)管方法，同法試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

2.4 判斷方法

以上三種方法全都進(jìn)行三次的平行試驗(yàn)，將供試品管中的試驗(yàn)菌與對(duì)照管中的試驗(yàn)菌進(jìn)行比較，如果供試品管中的試驗(yàn)菌生長(zhǎng)情況良好，那么就說明供試品在這種檢驗(yàn)條件下的抑菌控制作用并不明顯，可以對(duì)照該檢查方法和條件進(jìn)行無菌檢查。反之，如果試驗(yàn)品中任何一個(gè)容器中的試驗(yàn)菌生長(zhǎng)情況出現(xiàn)問題，生長(zhǎng)緩慢或者不生長(zhǎng)，就說明這種檢驗(yàn)方式具有一定的抑菌作用，需要先將抑菌性去除，然后再進(jìn)行重新驗(yàn)證，直至無抑菌作用，再進(jìn)行無菌檢查。

2.5 結(jié)果

本文所采用的三種試驗(yàn)方法，與對(duì)照管進(jìn)行比對(duì)之后，可以看出試驗(yàn)菌中的菌種生長(zhǎng)情況全部良好，檢驗(yàn)驗(yàn)證通過，伊曲康唑注射液可以采用這三種方法進(jìn)行無菌檢查。方法1與方法2中所選用的沖洗溶液不同，但是試驗(yàn)效果相同，其中方法1中使用的0.1%蛋白胨水溶液成本相對(duì)更低。方法3雖然配制過程更相似，沖洗液用量也比較少，但是操作過程復(fù)雜，溶液容易出現(xiàn)結(jié)晶的情況，不容易過濾。根據(jù)對(duì)比分析結(jié)果來看，方法1更適用于伊曲康唑注射液的無菌檢查。

3 討論

本次試驗(yàn)所采用的0.1%蛋白胨水溶液，pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液以及0.9%無菌氯化鈉溶液都可以用來作為沖洗溶液進(jìn)行藥品的無菌檢測(cè)，但是作用的機(jī)制各不相同。其中0.1%蛋白胨水溶液中的蛋白胨營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，利于微生物的生長(zhǎng)和恢復(fù);pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液除了含有與0.1%蛋白胨水溶液相同質(zhì)量的蛋白胨之外，還有磷酸二氫鉀以及氯化鈉等多種無機(jī)鹽，主要功能是用來維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組成、能量轉(zhuǎn)移以及代謝的平衡，因?yàn)镻H值比較穩(wěn)定，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，有利于微生物的生長(zhǎng);0.9%無菌氯化鈉溶液可以保證細(xì)胞中的滲透壓穩(wěn)定，避免細(xì)胞破裂。從沖洗效果來看，pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液的沖洗效果最好，但是成本也比較高，在使用方法1與方法2進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，薄膜過濾之前不需要進(jìn)行潤(rùn)膜這一環(huán)節(jié)，0.1%蛋白胨完全能夠滿足試驗(yàn)需求。方法3模擬了注射液在輸液之前的配制程序，但是在過濾的時(shí)候發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶產(chǎn)生，薄膜被堵塞，管中的壓力上升，薄膜破損風(fēng)險(xiǎn)大，如果要用這一種方法進(jìn)行無菌檢查，必須要保證溶液能夠充分稀釋，過濾前后薄膜確保完好。方法1與方法2進(jìn)行沖洗試驗(yàn)時(shí)，對(duì)白色念珠菌和黑曲霉菌等試驗(yàn)菌的抑菌性去除最低沖洗量分別為500mL/膜和100mL/次，對(duì)其它試驗(yàn)菌并沒有發(fā)現(xiàn)抑菌性的產(chǎn)生，可以進(jìn)行下一步的無菌優(yōu)化試驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)

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