房昉 溫偉波 楊齡 謝雪華 陶麗玲
摘要:目的 初步建立健肝消脂方醫(yī)院制劑的質量標準。方法 采用薄層色譜法分別定性鑒別該醫(yī)院制劑中的三七、赤芍、青皮、黃芪,采用高效液相色譜法定量測定該醫(yī)院制劑中丹酚酸B的含量。結果 在選定的薄層色譜條件下,供試品色譜與對照品色譜相應位置上顯相同顏色的斑點,分離效果較好,專屬性強。高效液相色譜法測定丹酚酸B的線性范圍在0.101 μg~2.525 μg之間,線性關系良好(r2=1)。平均回收率為101.7%,相對標準偏差值為0.98%。結論 該方法簡便可行、專屬性強、重現性好,可作為初步質量標準用于控制該制劑的質量。
關鍵詞:健肝消脂方;薄層色譜法;高效液相色譜法;質量標準
中圖分類號:R285.5 文獻標志碼:A 文章編號:1007-2349(2020)09-0073-06
Preliminary Study on Quality Standard of Hospital Preparationsof Jiangan Xiaozhi Prescription
FANG Fang1,WEN Wei-bo1,YANG Ling2,XIE Xue-hua1,TAO Li-ling2
(1. The First Affiliated Hospital of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650021,China;2. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China)
【Abstract】Objective: To preliminarily establish the quality standard of hospital preparation of Jiangan Xiaozhi prescription. Methods: TLC was used to qualitatively identify Panax notoginseng,Radix paeoniae rubra,Pericarpium Citri,and Astragalus membranaceus in the hospital preparation,and the content of salvianolic acid B in the hospital preparation was quantitatively determined by HPLC. Results: Under the selected TLC conditions,spots of the same color appeared on the corresponding positions of the chromatogram of the test substance and the chromatogram of the reference substance,with good separation effect and strong specificity. The linear range of salvianolic acid B measured by HPLC was between 0.101 μg~2.525 μg,and the linear relationship is good (r2=1). The average recovery rate was 101.7%,and the relative standard deviation value was 0.98%. Conclusion: The method is simple and feasible,with strong specificity and good reproducibility,and can be used as a preliminary quality standard to control the quality of the preparation.
【Key words】Jiangan Xiaozhi prescription,TLC,HPLC,quality standard
健肝消脂方是由云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院溫偉波主任醫(yī)師根據其多年診治非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的臨床經驗所擬定。目前該方已在臨床上得到了廣泛應用,臨床療效優(yōu)良。該方由丹參、三七、赤芍、青皮、黃芪等十二味中藥組成,具有活血化痰、健肝消脂的功效。但其湯劑劑型臨床服用不便,為便于患者服用,我們以顆粒劑的形式制備了健肝消脂方醫(yī)院制劑,并采用薄層色譜法(Thin Layer Chromatography,TLC)對方中三七、赤芍、青皮、黃芪進行定性鑒別,采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)對丹參中丹酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)的含量進行定量測定,以期為有效地控制健肝消脂方醫(yī)院制劑的質量提供方法。
1 儀器與試藥
1.1 儀器 LC-2030高效液相色譜儀(日本島津公司),CPA225D分析天平(德國賽多利斯公司),KQ-500B超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)。
1.2 試劑試藥 三七(批號:20180701)、赤芍(批號:20180901)、青皮(批號:20180701)、黃芪(批號:20180902)飲片(均購自昆明道地中藥飲片廠,符合2015年版《中國藥典》標準)。丹酚酸B(批號:111562-201716)、人參皂苷Rb1(批號:110704-201827)、人參皂苷Rg1(批號:110703-201832)、三七皂苷R1(批號:110745-201820)、芍藥苷(批號:110736-201943)、橙皮苷(批號:110721-201818)、黃芪甲苷(批號:110781-201717)(均購自中國食品藥品檢定研究院);薄層層析用硅膠G(青島海洋化工有限公司);甲醇[賽默飛世爾科技(中國)有限公司,批號:178507]、乙腈(Sigma-Aldrich Co,LLC,批號:WXBC9206V)均為色譜純。
2 方法與結果
2.1 三七TLC鑒別 根據《國家中成藥標準匯編》所載三七脂肝丸的國家藥品標準[WS-10285(ZD-0285)-2002]及《中華人民共和國藥典》相關內容[1]進行操作。
2.1.1 供試品溶液制備 取健肝消脂方醫(yī)院制劑10 g,研細,加乙醚50 mL,浸漬1 h,超聲處理5 min,濾過,棄去乙醚液,藥渣揮干乙醚,加水飽和的正丁醇25 mL,加熱回流1 h,放冷,濾過,濾液置分液漏斗中,用正丁醇飽和的氨試液洗2次,每次20 mL,放置分層,分取正丁醇液,蒸干,殘渣加甲醇2 mL使溶解,作為供試品溶液。
2.1.2 陰性樣品溶液制備 按處方取除去三七以外的藥材,按照制備方法制成揮發(fā)油包合物及提取浸膏,按照制備處方比例混合輔料,稱取適量,按照2.1.1制備方法制成陰性樣品溶液。
2.1.3 對照品溶液制備 取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1對照品,分別加甲醇制成每1 mL各含0.5 mg的混合溶液,作為對照品溶液。
2.1.4 鑒別方法 吸取上述三種溶液各2 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)10℃以下放置的下層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,噴以硫酸乙醇溶液(1→10),在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點,陰性樣品溶液無干擾,見圖1。
2.2 赤芍TLC鑒別[1]
2.2.1 陰性樣本溶液制備 按處方取除去赤芍以外的藥材,按照制備方法制成揮發(fā)油包合物及提取浸膏,按照制備處方比例混合三七粉、輔料,稱取適量,按照2.1.1方法制成陰性樣品溶液。
2.2.2 對照品溶液制備 取芍藥苷對照品,加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液,作為對照品溶液。
2.2.3 鑒別方法 吸取2.1.1項下的供試品溶液、2.2.1項下陰性樣品溶液和2.2.2項下對照品溶液各5 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以5%香草醛硫酸溶液,加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點,陰性溶液無干擾,見圖2。
2.3 青皮TLC鑒別[1]
2.3.1 供試品溶液制備 取健肝消脂方醫(yī)院制劑10 g,研細,加水40 mL浸泡15 min,時時振搖,濾過,濾液加乙醚振搖洗滌3次,每次30 mL,水層加乙酸乙酯振搖提取2次,每次30 mL,合并乙酸乙酯提取液,濃縮至2 mL,作為供試品溶液。
2.3.2 陰性樣品溶液制備 按處方取除去青皮以外的藥材,按照制備方法制成揮發(fā)油包合物及提取浸膏,按照制備處方比例混合三七粉、輔料,稱取適量,按照2.3.1制備方法制成陰性樣品溶液。
2.3.3 對照品溶液制備 取橙皮苷對照品,加乙酸乙酯制成1 mL含0.1 mg的溶液,作為對照品溶液。
2.3.4 鑒別方法 吸取上述三種溶液各5 μL,分別點于同一用0.5%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-甲醇-水(32:17:5)的下層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,噴于1%三氯化鋁乙醇溶液,置紫外燈(365nm)下檢視,供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點,陰性溶液無干擾,見圖3。
2.4 黃芪TLC鑒別[2-3]
2.4.1 供試品溶液制備 取健肝消脂方醫(yī)院制劑5 g,研細,加2%氫氧化鉀甲醇溶液50 mL,加熱回流2 h,濾過,濾液蒸干,殘渣加水30 mL使溶解,用三氯甲烷-正丁醇(2:1)溶液振搖提取4次,每次15 mL,合并三氯甲烷-正丁醇溶液,加1%磷酸二氫鉀溶液洗滌2次,每次25 mL,三氯甲烷-正丁醇溶液蒸干,殘渣加甲醇1 mL使溶解,作為供試品溶液。
2.4.2 陰性樣品溶液制備 按處方取除去黃芪以外的藥材,按照制備方法制成揮發(fā)油包合物及提取浸膏,按照制備處方比例混合三七粉、輔料,稱取適量,按照2.4.1制備方法制成陰性樣品溶液。
2.4.3 對照品溶液制備取黃芪甲苷對照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作為對照品溶液。
2.4.4 鑒別方法 吸取上述三種溶液各5 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)10℃下放置的下層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,加熱至斑點顯色清晰,供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點,陰性溶液無干擾,見圖4。
3 定量分析
依據健肝消脂方醫(yī)院制劑制備方法,丹參采用水提方式,故選擇丹參藥材中水溶性有效成分丹酚酸B為含量測定指標,檢測方法為HPLC[1]。
3.1 色譜條件 色譜柱:ACE-EXL-121-2546U(C18,250×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-0.1%磷酸溶液(24:76);檢測波長:286nm;流速:1.2 mL/min。此條件下丹酚酸B與其他組分達到有效分離(r>1.5),理論板數按丹酚酸B峰計算應不低于6000。
3.2 溶液制備
3.2.1 供試品溶液的制備 取健肝消脂方醫(yī)院制劑適量,研細,取約2.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇溶液50 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率500 W,頻率40 kHz)30 min,再稱定重量,用50%甲醇溶液補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
3.2.2 陰性樣品溶液的制備 按處方比例,稱取除丹參以外其他藥材,按照制備方法制成陰性樣品,稱取適量,再按照3.2.1的制備方法,制得。
3.2.3 對照品溶液的制備 取丹酚酸B對照品適量,精密稱定,加50%甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液,即得。
3.3 線性關系考察 精密吸取對照品溶液1、5、10、20、25 μL進行色譜測定,測定峰面積。以進樣量為橫坐標,色譜峰峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,并以進樣量對峰面積進行回歸,得回歸方程為Y=1125797X-2657,r2=1,表明進樣量在0.101 μg-2.525 μg范圍內呈良好的線性關系。
3.4 專屬性考察 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液注入液相色譜儀中,記錄色譜圖,供試品溶液色譜圖與對照品色譜圖丹酚酸B有相同保留時間色譜峰,陰性樣品溶液色譜圖丹酚酸B相應位置未見有峰,方中其他藥材、輔料均對丹酚酸B含量測定不產生干擾,方法專屬性良好,方法可行。見圖5至圖7。
3.5 穩(wěn)定性考察 取健肝消脂方醫(yī)院制劑適量參照3.2.1制備方法制成供試品溶液,室溫放置,分別于0、2、4、6、8、12、18、24 h精密吸取注入液相色譜儀,記錄色譜圖,峰面積相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)值為0.30%,穩(wěn)定性良好。
3.6 重復性考察 取健肝消脂方醫(yī)院制劑6份,參照3.2.1制備方法制成供試品溶液,測定含量,結果示供試品平均含量為1.69 mg/g,RSD值為1.96%,重復性良好。
3.7 準確度考察 采用加樣回收法測定。取6份已知含量供試品(含量0.12%)約1.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,分別加入丹酚酸B對照品溶液(濃度1.001 mg/mL)0.8、1.2、2.0 mL,加50%甲醇50 mL,稱定重量,超聲處理(功率500W,頻率40kHz)30 min,放冷,加50%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液測定,結果見表1。
3.8 供試品溶液制備方法考察
3.8.1 提取溶劑考察 取健肝消脂方醫(yī)院制劑約2.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,分別加甲醇、80%甲醇、50%甲醇、乙醇各50 mL,稱定重量,超聲處理(功率500W,頻率40kHz)30 min,放冷,分別加甲醇、80%甲醇、50%甲醇、乙醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,測定,結果見表2。
表2試驗結果表明:50%甲醇有效成分提取效率最高,故將供試品溶液制備所用溶劑定為50%甲醇。
3.8.2 提取時間考察 取健肝消脂方醫(yī)院制劑約2.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇50 mL,稱定重量,分別超聲處理(功率500W,頻率40kHz)60、90 min,放冷,分別加50%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,測定,結果見表3。
試驗結果表明:50%甲醇為溶劑,采用超聲處理方法,30 min與60 min相近,90 min含量有所降低,可能由于超聲時間過長而溶液溫度上升有關,故提取時間定為30 min。
3.9 樣品測定 對3批樣品進行含量測定,測定結果見表4。
4 討論
由于本品成分較多,供試品處理較為關鍵。在制劑的定性分析中,曾對三七供試品溶液制備方法進行研究。供試品未經乙醚處理所制備的供試品溶液,經試驗展開后,在與對照品相應的位置上主斑點顯色不清晰;而經乙醚處理后,試驗效果良好。除此之外,我們曾對青皮供試品溶液制備方法進行研究,按照《中華人民共和國藥典》青皮藥材制備方法制備,供試品在與對照品相應的位置上主斑點顯色不清晰,經乙醚除雜處理后,試驗效果良好。
三七、丹參均是健肝消脂方中的君藥。三七味甘、微苦,性溫,歸肝、胃、心、大腸經,具有散瘀之功,傳統中醫(yī)學用于治療脘脅久痛,癥瘕積塊等病癥;現代研究證實,三七能夠提高肝組織中超氧化物歧化酶的活性,還可降低血糖,臨床可用于治療高脂血癥、丙氨酸氨基轉移酶增高癥[4]。而中外多部藥典均把人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1作為三七含量測定的重要標準[5]。丹參味苦、微寒,歸心、心包、肝經,具有活血祛瘀之功,傳統中醫(yī)學于治療癥瘕積聚等病證;現代研究證實,丹參具有調節(jié)血脂、保護肝損傷、促進肝細胞再生、抗肝纖維化等作用,可用于改善高脂血癥,可用于治療高脂血癥、糖尿病、肝纖維化等疾病[4]。而丹酚酸B是丹參中的重要水溶性酚酸類化合物,是丹參的主要有效成分之一,也是丹參質量控制的重要指標之一[6-8]。
而赤芍、青皮、黃芪則均為健肝消脂方中的臣藥。赤芍味苦,性微寒,歸肝、脾經,具有活血祛瘀之功,現代藥理學研究證實赤芍具有保肝作用,而芍藥苷則是赤芍TLC鑒別的主要對照品,同時芍藥苷也是赤芍的主要品質標志物[4]。青皮味苦、辛,性溫,歸肝、膽、胃經,具有消積化滯之功,現代藥理證實青皮具有保護肝細胞的功能,而橙皮苷則是青皮TLC鑒別的主要對照品,同時橙皮苷也是青皮的主要品質標志物[4]。黃芪味甘,性溫,歸肺、脾經,具有益氣升陽之功,現代藥理研究證實黃芪具有良好的清除自由基、抗氧化作用,對于NAFLD模型大鼠,黃芪水煎劑能有效調節(jié)其血脂水平、保護肝功能和降低脂質過氧化水平,而黃芪甲苷則是黃芪TLC鑒別的主要對照品之一,同時黃芪甲苷也是黃芪的主要品質標志物之一[4-9]。
中藥復方制劑的質量控制是目前中醫(yī)藥現代化發(fā)展過程中的一個難點,而基于質量標志物(Q-marker)的中藥復方制劑評價方法已經受到了廣大學者的重視[10-11]。我們的研究中,以丹酚酸B、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、芍藥苷、橙皮苷、黃芪甲苷作為健肝消脂方的質量標志物,采用經典方法對上述指標進行檢測,初步確立了健肝消脂方醫(yī)院制劑的質量標準。但今后仍應立足于中藥復方制劑的已知有效成分及中藥復方的臨床功效,利用先進技術,進一步深入研究該制劑的質量評價方法。
參考文獻:
[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:11-1209.
[2]潘萍,潘金火.康媛顆粒質量標準研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2007(10):42-44.
[3]胡同瑜,張本山.復方黃芪口服液質量標準研究[J].中國現代醫(yī)藥雜志,2006(6):106-108.
[4]南京中醫(yī)藥大學.中藥大辭典[M].上海:上海科學技術出版社,2017:63-2441.
[5]劉夢楠,熊慧,薛雪,等.三七炮制歷史及標準現狀分析[J].中華中醫(yī)藥雜志,2019,34(4):1477-1480.
[6]任雪,董繼先,沈文,等.干燥方式對保健食品中丹酚酸B含量的影響[J].食品工業(yè),2019,40(11):22-25.
[7]侯夢妮,顧霄,謝珍,等.丹酚酸B在大鼠體內的代謝產物及代謝途徑研究[J].中國現代應用藥學,2019,36(21):2673-2682.
[8]任俞霏,陳小青,孔維宗,等.丹酚酸B對非酒精性脂肪性肝病細胞模型自噬功能的影響[J].實用肝臟病雜志,2019,22(6):804-807.
[9]婁新睿,廖康,朱明君,等.黃芪水煎劑對SD大鼠非酒精性脂肪肝的干預作用[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2019,16(25):12-16.
[10]孟憲生,包永睿,王帥,等.復方中藥質量標志物的發(fā)現與量效色卡可視化技術[J].藥學學報,2019,54(2):222-227.
[11]周昱杉,梁潔,信晨曦,等.中藥復方制劑質量評價方法[J].中華中醫(yī)藥學刊,2019,37(3):589-592.
(收稿日期:2020-05-07)