張仁文

(吉林化工學院，吉林 吉林 132022)

1 引言

肝癌作為全球死亡率極高的惡性腫瘤，嚴重威脅人類的生命與健康，因此尋找有效的治療手段愈發(fā)重要。肝癌細胞有增殖迅速這一特征，這種極速增殖是由肝癌細胞中異常的脂質(zhì)代謝引起的[1，2]。脂質(zhì)代謝一方面增強肝癌細胞能量的獲取來促進細胞增殖和轉(zhuǎn)移，另一方面脂質(zhì)代謝產(chǎn)物還可以作為信號分子用來加強細胞信號的傳遞[3，4]。膽固醇是細胞中的天然組分，其不僅是細胞膜的主要成分也是體內(nèi)多種活性物質(zhì)合成的前體分子。有研究表明細胞內(nèi)膽固醇代謝紊亂能引起一系列疾病[5]，然而外源性膽固醇在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用仍未得到充分研究。因此本實驗將探究外源膽固醇對肝癌細胞活力的影響，并進一步觀察對細胞脂質(zhì)代謝中關鍵基因表達的影響。

2 材料與方法

2.1 實驗細胞

人肝癌細胞系HepG2。

2.2 實驗藥品

DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、膽固醇、CCK-8、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR檢測試劑盒。

2.3 實驗方法

2.3.1 CCK-8檢測細胞活力

HepG2細胞培養(yǎng)至約80%匯合度時，胰酶消化并計數(shù)，以每孔5000個細胞接種于96孔板中培養(yǎng)過夜。配制不同膽固醇濃度的培養(yǎng)基并替換96孔板培養(yǎng)基，膽固醇濃度分別為0，6.25，12.5，25，50，100mg/L，每個濃度設置4個復孔，其中0mg/L為對照組，繼續(xù)培養(yǎng)(37℃，5% CO2)。培養(yǎng)24 h后向每孔加入10μL CCK-8溶液，用移液器吹打混勻，將96孔板在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培育2h，用酶標儀測定各孔在450nm處的吸光度。

2.3.2 qRT-PCR檢測脂代謝相關基因表達情況

1、樣品RNA的提取

將HepG2細胞以2×105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)過夜。分別加入含0，12.5，100mg/L膽固醇的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結束后采用Trizol法提取各孔細胞總RNA。分光光度法測定提取的總RNA的純度和濃度，于-80℃保存待用。

2、樣品cDNA合成

每組取1μg總RNA用于進行逆轉(zhuǎn)錄反應，按試劑盒說明書將總RNA、buff溶液、引物和DEPC水在冰上混勻制備20μL反應體系。將各PCR管置于PCR儀中，42℃反應15 min，隨后85℃加熱5s失活逆轉(zhuǎn)錄酶，即得各組cDNA產(chǎn)物，于-20℃保存。

3、qRT-PCR檢測

上述cDNA溶液稀釋100倍后用作qRT-PCR檢測的模板，每孔模板量為2μL。將各基因上下游引物、qRT-PCR預混溶液和ddH2O在冰上混勻后分裝到8聯(lián)排中，每孔18μL，每孔再加入2μL模板溶液制備為20μL反應體系，上機檢測。每個基因設置3個復孔，反應結束后讀取各孔Ct值，計算各組各基因表達的變化，以GAPDH為內(nèi)參基因。

3 實驗結果與討論

3.1 膽固醇對HepG2細胞活力的影響

采用CCK-8法檢測不同濃度膽固醇對HepG2細胞活力的影響，結果見圖1。膽固醇能顯著抑制HepG2細胞活性。在低濃度膽固醇作用下，細胞活力降低不明顯，隨著膽固醇濃度的增加，細胞活力顯著降低，呈現(xiàn)劑量依賴性。在最高濃度100mg/L膽固醇作用下，細胞活力下降了約46%，與對照組相比具有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)。

圖1 膽固醇對HepG2細胞活力的影響

3.2 膽固醇對脂代謝通路基因表達的影響

以0mg/L膽固醇處理細胞為對照組，分別觀察低濃度膽固醇(12.5mg/L)和高濃度膽固醇(100mg/L)對HepG2細胞中脂代謝相關基因FASN、SREBP-1c、ACC1、SCD1和CPT1的表達變化。采用相對定量法，以GAPDH為內(nèi)參基因。結果見圖2。

圖2 脂代謝相關基因表達變化

根據(jù)圖2可知，與對照組相比，低膽固醇(12.5mg/L)處理對HepG2細胞中脂代謝相關基因的表達影響較小，其中FASN、ACC1、SCD1和CPT1基因的表達與對照組相比，無統(tǒng)計學差異，僅SREBP-1c基因表達略有下調(diào)，約為對照的0.85倍，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。而高濃度膽固醇處理則顯著降低了HepG2細胞中FASN、SREBP-1c和ACC1基因的表達，分別為對照組的0.34倍、0.46倍和0.26倍，具有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)。高濃度膽固醇處理后HepG2細胞中SCD1基因表達亦受到抑制，為對照組的0.69倍，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。而CPT1基因的表達則不受膽固醇的影響，無論低濃度還是高濃度膽固醇處理，表達與對照組相比均無變化，無統(tǒng)計學意義。

4 結論

通過以上研究我們證明，外源膽固醇能夠抑制肝癌HepG2的細胞活力，呈現(xiàn)劑量依賴關系。進一步研究發(fā)現(xiàn)，高濃度膽固醇能夠影響HepG2細胞中脂代謝相關基因FASN、SREBP-1c、ACC1和SCD1的表達，而對CPT1基因表達無影響，表明膽固醇可能通過SREBP-1c-FASN途徑影響HepG2細胞中甘油三脂的合成[6]，也可能通過抑制SCD1基因的表達來抑制SCD1-AMPK通路從而達到抑制HepG2細胞的活性[7]。然而外源膽固醇抑制細胞活力以及影響HepG2細胞中脂代謝相關基因表達的機制仍不十分清楚，尚需進一步研究證明。