沈 淼，馬欽風(fēng)，馬有良，尹秋萍，張玉英*

(1.青海大學(xué)研究生院，青海 西寧 810016；2.青海省人民醫(yī)院超聲科，青海 西寧 810007)

肝泡型棘球蚴病(hepatic alveolar echinococcosis, HAE)是慢性、復(fù)雜性、地方性人畜共患病，外科手術(shù)為首選治療方法，但創(chuàng)傷大，且易出現(xiàn)并發(fā)癥[1]。熱消融術(shù)現(xiàn)已成為治療HAE的新興微創(chuàng)方法[2-3]。本研究觀察超聲造影(contrast-enhanced ultrasound, CEUS)聯(lián)合聲輻射力脈沖(acoustic radiation force impulse, ARFI)彈性成像評價微波消融(microwave ablation, MWA)治療大鼠HAE療效的價值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及造模 清潔級雄性SD大鼠50只，鼠齡約3個月，平均體質(zhì)量200 g，由青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心提供[SYXK(青)2020-0001]。參照文獻(xiàn)[4-5]方法建立HAE模型，經(jīng)常規(guī)超聲證實(shí)40只造模成功。

1.2 動物分組及處理 將40只HAE模型大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組30只和對照組10只。對實(shí)驗(yàn)組行MWA，術(shù)前12 h停飼，按0.5 ml/100 g體質(zhì)量腹腔注射7%水合氯醛麻醉，于超聲引導(dǎo)下將消融針(康友KY-2450A)插入病灶內(nèi)，功率40 W，消融30 s～2 min， 待病灶全部變?yōu)閺?qiáng)回聲后擴(kuò)大消融0.5 cm病灶旁組織，CDFI示無血流信號提示消融成功。對照組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 儀器與方法 采用Siemens Acuson Oxana3超聲診斷儀，線陣探頭9L4(頻率4～9 MHz)，于術(shù)前及術(shù)后1個月行常規(guī)超聲、CEUS及ARFI檢查。先行常規(guī)超聲，記錄病灶形態(tài)及大小。將六氟化硫微泡(SonoVue)凍干粉59 mg與5 ml生理鹽水混合，經(jīng)大鼠尾靜脈注射1 ml后即刻注入1 ml生理鹽水沖管，以CEUS模式連續(xù)觀察5 min，記錄動脈相(2～20 s)、門靜脈相(21～40 s)及延遲相(41～300 s)[5]。采用ImageJ軟件定量分析HAE病灶邊緣帶灰階強(qiáng)度，以造影后病灶邊緣增強(qiáng)帶5個不同位置為ROI，并選取相鄰正常肝組織(術(shù)后術(shù)前保持ROI位置一致)，計(jì)算病灶周圍增強(qiáng)帶與相鄰肝組織的平均灰階比，比值≥1.1為高增強(qiáng)，≤0.9為低增強(qiáng)，二者之間為等增強(qiáng)。于二維模式下顯示病灶最佳切面，開啟ARFI模式，于病灶周邊浸潤帶選取5個ROI分別測量剪切波速度(shear wave velocity, SWV)，以平均值為最后結(jié)果。

1.4 病理學(xué)檢查 術(shù)后1個月完成超聲掃查后處死并解剖大鼠。根據(jù)CEUS及ARFI聲像圖，每只大鼠病灶取1～3塊標(biāo)本，每塊標(biāo)本均包括HAE病灶、周邊浸潤帶及正常肝組織。標(biāo)本經(jīng)固定、包埋、切片后行常規(guī)HE染色、CD34免疫組織化學(xué)染色及Masson染色。①以CD34標(biāo)記微血管密度(microvessel density, MVD)，血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表現(xiàn)。于HAE病灶邊緣帶計(jì)數(shù)MVD：先在低倍光鏡下(×100)選擇5個微血管最密集區(qū)域，即“熱點(diǎn)”，再在高倍光鏡下(×400)計(jì)數(shù)，取平均值作為結(jié)果。②于高倍鏡下(×400)觀察Masson染色片病灶邊緣區(qū)域5個ROI，采用Image-Pro Plus 6.0軟件測量藍(lán)色膠原纖維面積，取平均值作為纖維化面積。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料以±s表示，以t檢驗(yàn)及單因素方差分析比較組間病灶最大徑、SWV、MVD和纖維化面積，以t'檢驗(yàn)分析灰階比值變化；采用Pearson直線相關(guān)分析觀察灰階比值及MVD、SWV與纖維化面積的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組26只消融成功，4只因穿刺失敗而放棄消融。術(shù)后1個月內(nèi)死亡7只，其中4只腹腔出血，2只嚴(yán)重腸粘連、腸管擴(kuò)張，1只麻醉后即刻出現(xiàn)全身痙攣、窒息。最終實(shí)驗(yàn)組納入19只、共21個病灶，對照組大鼠10只共10個病灶，一般情況均良好。

圖1 實(shí)驗(yàn)組大鼠MWA術(shù)前及術(shù)后1個月CEUS及ARFI圖像 A、B.術(shù)前(A)及術(shù)后1個月(B)CEUS圖像顯示術(shù)后病灶增強(qiáng)強(qiáng)度減弱(箭示HAE病灶邊緣帶)； C、D.術(shù)前(C)及術(shù)后1個月(D)ARFI圖像顯示術(shù)后邊緣帶SWV增大；術(shù)前二維超聲、CEUS及ARFI測量病灶最大徑分別為1.12、1.51、1.54 cm，術(shù)后1個月分別為0.94、1.25、1.18 cm

2.1 病灶最大徑 術(shù)前二維超聲、CEUS及ARFI 所測2組病灶最大徑差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.112、-1.185、-1.148，P=0.275、0.246、0.260)。術(shù)后1個月，實(shí)驗(yàn)組3種方法所測病灶最大徑均較術(shù)前縮小(P均<0.001)，對照組均較入組時增大(P均<0.001)。CEUS、ARFI所測2組病灶最大徑大于二維超聲(P均<0.05)，CEUS與ARFI測值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1、2及圖1。

2.2 消融前后病灶邊緣帶灰階比值 實(shí)驗(yàn)組最終共選取105個ROI，術(shù)前94.29%(99/105)為高增強(qiáng)，3.81%(4/105)為等增強(qiáng)，1.90%(2/105)為低增強(qiáng)，平均灰階比值為1.73±0.24；術(shù)后1個月59.05%(62/105)為高增強(qiáng)，32.38%(34/105)為等增強(qiáng)，8.57%(9/105)為低增強(qiáng)，平均灰階比值為1.16±0.15，術(shù)后1個月HAE病灶周邊邊緣帶灰階比低于術(shù)前(t'=9.177，P<0.001)。

表1 3種方法測量實(shí)驗(yàn)組大鼠MVA術(shù)前及術(shù)后1個月病灶最大徑比較(±s，n=21)

表1 3種方法測量實(shí)驗(yàn)組大鼠MVA術(shù)前及術(shù)后1個月病灶最大徑比較(±s，n=21)

方法最大徑(cm)術(shù)前術(shù)后1個月t值P值二維超聲1.26±0.391.07±0.3814.631<0.001CEUS1.57±0.42*1.38±0.41*13.067<0.001ARFI1.54±0.38*1.34±0.39*10.139<0.001F值4.0103.677--P值0.0230.031--

注：*：與二維超聲比較，P<0.05

表2 3種方法測量對照組大鼠入組時及飼養(yǎng)1個月后病灶最大徑比較(±s，n=10)

表2 3種方法測量對照組大鼠入組時及飼養(yǎng)1個月后病灶最大徑比較(±s，n=10)

方法最大徑(cm)入組時飼養(yǎng)1個月后t值P值二維超聲1.10±0.27 1.23±0.26 -7.960<0.001CEUS1.40±0.28*1.53±0.28*-7.702<0.001ARFI1.39±0.30*1.54±0.28*-14.848<0.001F值3.4184.248--P值0.0480.025--

注：*：與二維超聲比較，P<0.05

2.3 消融前后病灶邊緣帶SWV 實(shí)驗(yàn)組21個病灶術(shù)前病灶邊緣帶SWV平均值為(5.01±0.34)m/s，術(shù)后1個月為(6.05±0.38)m/s，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-9.380，P<0.001)。

2.4 病灶邊緣帶MVD和纖維化程度 實(shí)驗(yàn)組消融灶邊緣帶MVD低于對照組，纖維化面積高于對照組(P均<0.001)，見表3、圖2。

表3 2組大鼠HAE病灶邊緣帶MVD及纖維化面積比較(±s)

表3 2組大鼠HAE病灶邊緣帶MVD及纖維化面積比較(±s)

組別MVD(個/高倍視野)纖維化面積(像素)實(shí)驗(yàn)組(n=21)18.28±3.70 997 003.86±58 322.75對照組(n=10)50.13±3.05623 747.50±70 086.68t值-23.61215.616P值<0.001<0.001

2.5 相關(guān)性 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1個月消融灶邊緣帶灰階比值與MVD呈正相關(guān)(r=0.541，P=0.011)，SWV值與Masson染色纖維化面積呈正相關(guān)(r=0.494，P=0.023)。

3 討論

泡球蚴通過向外芽生原頭節(jié)及囊液外漏方式向周圍肝組織浸潤，引起機(jī)體遲發(fā)型超敏反應(yīng)，最終形成假囊壁，即含有炎性細(xì)胞、微血管及纖維組織的周邊浸潤活性增殖帶，并向周邊侵襲[6]。

圖2 病灶邊緣帶MVD及纖維化程度 A、B.分別為實(shí)驗(yàn)組、對照組CD34免疫組織化學(xué)染色圖片(×400)； C、D.分別為實(shí)驗(yàn)組、對照組Masson染色圖片(×400)。實(shí)驗(yàn)組病灶邊緣帶MVD較對照組明顯減少，纖維化程度較對照組增高

HAE潛伏期長，早期常無明顯癥狀，出現(xiàn)癥狀時多已進(jìn)入晚期，肝臟嚴(yán)重受損，泡球蚴甚至已隨血液及淋巴轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)隔重要臟器，因此早期診治尤為重要。最新泡型肝包蟲病診療專家共識[7]已將消融作為早期HAE(直徑≤4 cm)的首選治療方法之一。MWA可使HAE病灶發(fā)生凝固性壞死，并阻斷病灶周邊浸潤帶微血流灌注，從而抑制泡球蚴向周邊侵襲，并切斷其營養(yǎng)支持，達(dá)到滅活目的[8]。評價熱消融治療肝癌效果時，常以組織內(nèi)有無微循環(huán)灌注作為影像學(xué)檢查判斷消融灶是否具有生物學(xué)活性的主要依據(jù)[9]。HAE浸潤性生長依賴新生血管，通過監(jiān)測HAE病灶周邊浸潤帶有無微血流灌注可評估消融灶內(nèi)是否有存活泡球蚴。

宋濤等[10]發(fā)現(xiàn)HAE病灶在CEUS中常表現(xiàn)為中央?yún)^(qū)全程“黑洞”，周邊區(qū)在動脈早期出現(xiàn)邊框樣增強(qiáng)，呈“快進(jìn)慢出” 灌注模式，且周邊環(huán)狀增強(qiáng)灰階強(qiáng)度與MVD呈正相關(guān)，故可采用CEUS監(jiān)測HAE病灶周邊浸潤帶微血流灌注狀態(tài)。應(yīng)用純血池造影劑SonoVue進(jìn)行CEUS，反映微血供狀態(tài)比CT、MRI更敏感，判斷HAE病灶活性與PET/CT結(jié)果一致性更好[11]。本研究中消融后1個月實(shí)驗(yàn)組病灶邊緣帶平均灰階比值較術(shù)前降低，提示術(shù)后周邊浸潤帶微血管灌注減少，病灶活性降低，且消融灶邊緣帶MVD低于對照組，表明應(yīng)用CEUS增強(qiáng)灰階強(qiáng)度可無創(chuàng)、準(zhǔn)確觀察大鼠HAE病灶周邊滋養(yǎng)微血管狀態(tài)，進(jìn)而評估MWA后病灶有無殘存或復(fù)發(fā)。

ARFI技術(shù)通過測量組織的SWV定量分析不同組織間軟硬度差異，現(xiàn)已廣泛用于評估肝纖維化。華國勇等[12]發(fā)現(xiàn)HAE病變周邊浸潤帶SWV值與病理所示纖維化程度呈正相關(guān)。本研究采用AFRI技術(shù)觀察消融前后大鼠HAE病灶邊緣帶纖維組織變化，發(fā)現(xiàn)術(shù)后1個月SWV較術(shù)前升高，提示術(shù)后大鼠消融灶邊緣纖維組織豐富。既往研究[13]報(bào)道，泡球蚴生長過程中，其邊緣浸潤帶微血管形成與纖維化交替共存，新生肉芽腫內(nèi)含豐富的新生血管及少量纖維組織，故邊緣帶活性更強(qiáng)。本研究中MWA后消融灶周邊浸潤帶微血流灌注減少、纖維化增多，此時邊緣帶活性降低，提示觀察上述兩方面能更全面地反映病灶的生物學(xué)活性。此外，本研究CEUS測得HAE病灶最大徑與ARFI測值無明顯差異，均大于二維超聲測值，與張玉英等[14]的結(jié)果相符，提示ARFI判斷消融范圍的價值與CEUS相當(dāng)。

綜上所述，CEUS聯(lián)合ARFI技術(shù)能較二維超聲更準(zhǔn)確地顯示大鼠HAE病灶周邊浸潤帶形態(tài)、寬度，可用于評估消融范圍，有助于更加徹底地清除病灶，且便于實(shí)時監(jiān)測病灶有無殘存及術(shù)后隨訪，對于MWA后早期評估療效有一定價值，而其對于監(jiān)測中長期療效的價值尚待進(jìn)一步觀察。