周禮 ，黃旭明，張明興

1.廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院康復醫(yī)學科，廣東 廣州 510075；

2.清遠市連南自治縣人民醫(yī)院腦科，廣東 清遠 540000

我國于2019年12月發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒(2019-nCoV)感染性肺炎。傳統(tǒng)治療療效不明確，尋找新的有效藥物應成為治療研究的重點。目前研究發(fā)現(xiàn)20%SARS-CoV表位與SARS-CoV-2，即2019-nCoV完全匹配，這些引起SARS-CoV免疫炎性反應的B細胞和T細胞表位極有可能對2019-nCoV有效[1]。因此進行SARS-CoV冠狀病毒感染性肺炎的研究對于新型冠狀病毒肺炎的疫情控制有極大意義。

目前對冠狀病毒的研究多見于臨床實驗，體內(nèi)研究有助于闡明冠狀病毒感染的致病性，臨床尸檢結果都往往受經(jīng)藥物治療等影響，觀察不到單純病毒感染造成的損傷，動物模型能更真實地反映冠狀病毒感染情況及機制，更有利于篩選及研發(fā)藥物[2]?；仡?5 年前SARS-CoV 病毒流行亦引起肺部炎癥及重癥急性呼吸綜合征，兩種病毒均為同屬冠狀病毒，SARS-CoV的體內(nèi)研究較2019-nCoR 有著較成熟和安全的實驗條件，因此選擇其進行相應研究[3-4]。

在多次疫情中，中藥發(fā)揮了其特殊的作用，但其給藥方式及療效不確切。前期多項研究中也證實黃芩甙元(Baicalein)具有抗病毒及改善AD 大鼠神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎性反應的療效[5-6]，文獻報道黃芩有廣泛的生物活性，體內(nèi)外實驗證實其抗氧化可清除自由基，抑制人免疫缺陷病毒，治療白血病[7-9]。但目前臨床中多采取直接中藥制劑口服，應用于冠狀病毒中療效不穩(wěn)定，而脂質(zhì)納米粒(SLN)有緩釋和穩(wěn)定的生物特性，直接肺部給藥，肺泡吸收面積大血管網(wǎng)絡豐富，利于藥物吸收轉運[10-13]。本研究將Baicalein作為先導化合物進行結構修飾、納米包裝，在肺泡灌注基礎上予定位給藥，發(fā)現(xiàn)治療后大鼠反應較前靈敏，考慮肺泡灌注黃芩甙元載藥納米治療發(fā)揮抗病毒、抗免疫炎性反應的生理功能，該治療方式比單純肺泡灌注或口服給藥更有利于發(fā)揮作用。

本實驗制備SARS-CoV 大鼠模型，用肺泡灌注Baicalein載藥納米技術進行給藥治療，以行為學實驗、病理學及生化等多項研究，驗證其減輕免疫炎性反應的有效性及可行性，并揭示肺泡灌注Baicalein載藥納米技術改善冠狀病毒感染大鼠的呼吸窘迫綜合征作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 SPF 級雄性Lewis大鼠(6周齡)96 只，體質(zhì)量150～160 g，購于中山大學實驗動物中心，飼養(yǎng)及實驗按《實驗動物使用及實驗規(guī)程國家標準》及在P3+動物實驗室[許可證號SYXK (京)2019.0003]負壓隔離器中進行。所有實驗動物在本實驗室飼養(yǎng)環(huán)境中穩(wěn)定1 周后按研究動物倫理委員會(IAEC)動物實驗指南進行實驗。根據(jù)隨機數(shù)表法將Lewis 大鼠分為正常對照組、CoV 組、藥物治療組、安慰劑組，每組24 只。本研究使用的分離自冠狀病毒肺炎患者的病毒PUMC01 株，主要使用Vero 細胞進行培養(yǎng)傳代，經(jīng)RT-PCR 確定為SARS 病毒，TCID50為106pfu/mL。

1.2 主要試劑及儀器 Baicalein購自美國APE×BIO公司；戊巴比妥鈉購自中國中山大學實驗中心；山崳酸甘油酯購自法國GATTEFOSSE 公司；水溶性PVAc-203 購自北京正潔利達經(jīng)貿(mào)有限公司；甘油、磷酸酶抑制劑、無水乙醇、蘇木素-伊紅染液購自天津大茂化學試劑有限公司；二甲苯、中性樹膠購自國藥集團化學試劑有限公司；SARS 病毒抗體診斷試劑盒購自北京華大生物技術有限公司；蛋白磷酸酶抑制劑混合物購自上海貝博生物公司；細胞因子ELISA試劑盒購自晶美生物有限公司。主要實驗儀器：T型迷宮，酶標儀，電熱恒溫水浴箱，微量加樣器，手術器械，病理切片機，渦旋混合器，超低溫冰箱，脫色搖床，磁力攪拌器，高速攪拌機；Thermo Ascent FL熒光化學發(fā)光微孔板；ZetasizerNano ZS系列納米粒度及Zeta電位分析儀；高速離心機，光學顯微鏡等。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物處理方法 對照組常規(guī)喂養(yǎng)，余組進行CoV 攻毒。鼻噴霧法接種病毒105TCID50(1 mL 體積)。于感染后第3、7天檢測血清IgG抗體均為陽性，且抽樣活檢證書感染后肺部有相應病理變化。攻毒后7 d，隨機分成CoV組、治療組、安慰劑組；CoV組繼續(xù)研究觀察，治療組按設計劑量肺泡灌注Baicalein載藥納米[Baicalein 10 mg/(kg·d)]治療兩周，安慰劑組給予肺泡灌注PBS 灌注液治療兩周。各組大鼠取攻毒后0 d、3 d、7 d、14 d、28 d進行體征反應等評估，觀察比較各組皮毛、體重、食欲反應及“T”型迷宮實驗，上述時間點行咽拭子及肺組織病毒分離方法檢測病毒外排與復制的情況，于0 d、3 d、7 d、14 d、28 d每組各抽取模型動物安樂死后，肺組織勻漿上清細胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ及肺組織病理檢測等后續(xù)實驗。評估病程及治療前后各組的動物病理變化及免疫學改變。

1.3.2 載藥納米的制備 黃芩甙標準品購自衛(wèi)生部藥品檢定所；黃芩甙元標準品購自美國APExBIO公司；取0.5 g PVAc-203 和0.25 g 甘油加入到50 mL水中，在加熱攪拌溶解后冷卻。山崳酸甘油酯0.5 g及1 mg Baicalein 熔融成有機相后逐滴加入75℃的上述水相中，11 000 r/min攪拌保持75℃，用高速剪切法，剪切速率為24 000 r/min，剪切時間為10 min，呈乳狀液，4℃冰箱放置固化得平均粒徑分別為200 nm 的Baicalein 的納米水混懸液[11-12]。用HPLC 檢測納米制劑中黃芩甙元的含量，并作酶解前后的對比，可以準確而可靠地鑒定其保甙的效果，保證其內(nèi)在質(zhì)量[14-15]。

1.3.3 支氣管肺泡灌洗術 按經(jīng)典的灌洗操作方法進行設計[16-17]。灌洗液選取磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)，配置加入適量藥物或安慰劑后，氣管插管后進行在體操作的全肺灌洗技術，緩慢輕柔灌洗兩次，單次灌洗量3～5 mL，灌洗液每次在肺組織內(nèi)停留時間28 s[18-19]。

1.3.4 T 迷宮行為學實驗 實驗設計“T”型迷宮兩臂，正確臂亮燈并放置食物，為獎勵區(qū)，非正確臂盡頭不亮燈無食物，轉換開關變換正確臂區(qū)，進入亮燈區(qū)成功覓食，動物在實驗前進行連續(xù)3 d的訓練。第4日測試記錄15 次隨機變換正確臂，計算3 min 內(nèi)每只大鼠成功到達正確臂的時間。

1.3.5 病毒分離及抗體檢測 各組動物各時間點取肺臟組織標本0.5 mm3剪碎研磨成勻漿液，加于1.5 mL 離心管。離心6 000 r/min，10 min。將第一代上清24孔板內(nèi)接種于VERO細胞孵化傳代，三代后鑒定病毒。利用酶聯(lián)免疫法進行SARS-CoV 特異性抗體IgG 檢測，動物3%戊巴比妥鈉麻醉后，心尖插入針頭取血l mL分離血清，按試劑盒說明書進行操作。

1.3.6 肺組織勻漿上清細胞因子的測定 各組實驗動物在相應時間點取血后，分二批取材。第一批處死后取肺組織冰域研磨勻漿，加入DMEM液配成10%的肺組織勻漿，2 800×g離心10 min，取上清。利用ELISA試劑盒測定細胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ的水平。

千里之行，始于足下，重視一堂課的導入，是一堂課成功的關鍵。若選準、選活了“切入點”，則能有效地設置問題情景，激活學生的思維，迅速地使學生進入“角色”，從而充分調(diào)動學習的積極性，主動性，使學生學起來興趣盎然。俗話說：“好的開始是成功的一半”，因此，我非常重視課堂的導入設計，本文就是筆者的一點粗淺的體會。

1.3.7 病理組織學實驗 各組實驗動物第二批處死后取肺等組織，常規(guī)固定包埋、病理組織切片處理后，HE 染色，脫水封片，顯微鏡鏡檢觀察各組動物的肺組織學結構，并對相關圖像采集。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0 統(tǒng)計學軟件分析實驗數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用獨立樣本t 檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 建模評估 CoV組、治療組及安慰劑組動物均采用鼻腔噴霧接種病毒105TCID50(1 mL體積)。于攻毒處理后第0、3、7 天檢測血清IgG 抗體為陽性，感染后Lewis 大鼠具有精神萎靡、被毛粗亂，消瘦，活動減少，覓食量減少等表現(xiàn)，合造模成功檢測標準，完成造模，見表1。

表1 攻毒SARS-CoV后各組大鼠IgG滴度值

2.2 行為學檢查

2.2.1 動物行為學表現(xiàn) 攻毒處理后第1、3、7天CoV 組、治療組及安慰劑組感染后Lewis 大鼠具有精神萎靡、被毛粗亂、消瘦、活動減少、覓食量減少等表現(xiàn)，攻毒7 d 后，予肺泡灌注黃芩甙元載藥納米、肺泡灌注安慰劑治療。在實驗14 d、28 d兩個時間點，CoV組大鼠體質(zhì)量進行性下降，反應萎靡；治療組動物體質(zhì)量無繼續(xù)下降，活動及覓食量有明顯改善，大致恢復攻毒前水平；安慰劑組動物體質(zhì)量無繼續(xù)下降，活動稍增多，覓食量較前稍增多。

2.2.2 T 迷宮實驗 結果顯示在0 d 各組大鼠達正確臂端耗時大致相同，差異無統(tǒng)計學意義。3 d時，與對照組相比，治療組、CoV組、安慰劑組在迷宮中到達正確臂使用的時間增加，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。在7 d時，與對照組相比，治療組、CoV組、安慰劑組在迷宮系統(tǒng)達正確臂時間增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；治療組、CoV 組、安慰劑組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；7 d予肺泡灌注黃芩甙元載藥納米、肺泡灌注安慰劑治療。14 d時，CoV組大鼠在到達正確臂時間為(36.29±1.58)s，與對照組(17.04±1.68)s比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而通過治療14 d，治療物組大鼠到達食物臂端的時間為(22.05±1.14)s，耗時較同時間點CoV組的明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。安慰劑組大鼠到達食物臂端所花費的時間減少；與安慰劑相比，治療組大鼠到達食物臂端所花費的時間明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在28 d，與CoV組相比較，治療組、安慰劑組大鼠到達食物臂端所花費的時間明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 各組大鼠的T型迷宮實驗結果

2.2.3 病毒分離 CoV 組大鼠感染后3 d、7 d、14 d、28 d 的肺部病毒分離為陽性。治療組大鼠感染后3 d、7 d 肺部病毒分離均為陽性，治療干預后在14 d、28 d 病毒分離為陰性。安慰劑組感染后3 d、7 d肺部病毒分離均為陽性，治療干預后在14 d、28 d病毒分離仍為陽性。

表2 各組大鼠的病毒檢測匯總

2.2.5 肺勻漿上清細胞因子改變 在接種病毒前，各組大鼠肺組織勻漿上清中，TNF-α、IL-6、IFN-γ水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。在接種病毒后3 d，CoV 組、治療組、安慰劑組肺組織勻漿TNF-α、IL-6、IFN-γ水平均明顯高于對照組水平，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。接種病毒后7 d，CoV 組、治療組、安慰劑組肺組織勻漿TNF-α、IL-6、IFN-γ水平增高程度均較3 d 時更加明顯，與各自攻毒前水平有顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，與對照組相比有顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在14 d、28 d，各組細胞因子水平有所下降，其中CoV 組TNF-α、IL-6、IFN-γ水平接種后3 d 相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；治療組、安慰劑組動物的TNF-α、IL-6、IFN-γ水平下降明顯，與7 d 時各組的細胞因子水平相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖2～圖4。

2.2.6 肺組織病理學結果 在實驗取大鼠肺組織活檢，顯微鏡下提示在0 d 時各組大鼠肺組織無炎性浸潤等異常(圖5A)。攻毒后 3 d、7 d 時，Cov 組、治療組、安慰劑組動物的肺組織可見：支氣管上皮鱗狀化生及脫落、黏膜層黏液腺增生；肺間隔增寬并相互融合、血管擴張充血、周圍水腫伴大量炎細胞浸潤，肺泡腔內(nèi)存在纖維素樣滲出物。與3 d 時比較，7 d 時各組的炎性損傷加重，出現(xiàn)嚴重的肺泡損傷(圖5B)。14 d 時，對照組大致同前；CoV 組可見肺間隔斷裂，肺泡彌漫性破壞伴單核細胞浸潤，肺泡上皮細胞增生，有的融合形成多核肺細胞，相關周圍血管水腫明顯(圖5C)；治療組可見炎癥組織病變區(qū)縮小，淋巴細胞浸潤數(shù)量較前減少，肺泡內(nèi)滲出物減少，炎癥改變較前減輕；安慰劑組見肺組織局限性炎癥改變，與第7 天類似，并有肺間隔增厚增寬，肺間隔內(nèi)有出血及滲出，內(nèi)見大量單核細胞、組織細胞浸潤。28 d時，對照組大致同前；CoV組見肺泡結構被破壞，纖維結締組織增生，伴增厚的肺間隔內(nèi)有紅細胞及淋巴細胞浸潤(圖5D)；安慰劑組炎癥組織病變區(qū)縮小，肺間隔增厚，可見纖維結締組織增生，肺間隔內(nèi)見出血及滲出，其中可見少許單核細胞、組織細胞浸潤(圖5E)；治療組可見炎癥組織病變區(qū)明顯縮小，肺泡結構完整，無滲出，未見纖維結締組織增生(圖5F)。

圖2 各組大鼠攻毒后肺組織勻漿上清TNF-ɑ水平變化

圖3 各組大鼠攻毒后肺組織勻漿上清IL-6水平變化

圖4 各組大鼠攻毒后肺組織勻漿上清IFN-γ水平變化

圖5 各組大鼠大肺組織病理組織學改變(HE×100)

3 討論

據(jù)報道，冠狀病毒感染性肺炎患者以呼吸道癥狀為主，輔助檢查可見典型的胸部CT影像特征，給人類健康帶來了巨大的危害，因此，研究其病因及有效治療手段十分重要。本研究擬通過表位匹配的冠狀病毒模型進行相關研究，闡明新型冠狀病毒感染的發(fā)病機制及系統(tǒng)探討治療手段。

根據(jù)目前臨床流行病學研究報道指出，冠狀病毒感染性肺炎的臨床癥狀聚焦感染，為以肺部感染為主的全身性免疫炎性反應。本研究鼻噴霧法接種構建冠狀病毒感染性肺炎大鼠模型，觀察到病毒感染后7 d時，與對照組相比，CoV組大鼠出現(xiàn)明顯的精神萎靡、活動覓食減少、被毛粗亂、消瘦，行為學檢查提示在T迷宮中到達正確臂耗時顯著增加；CoV組大鼠肺組織分離出冠狀病毒血清SARS-CoV特異性抗體IgG檢測陽性，且隨著感染的時間延長而滴度增高，7～14 d時達峰值；肺組織病理學檢查見肺間隔增寬并相互融合、血管擴張充血、周圍水腫伴大量炎細胞浸潤等炎癥改變。14 d時，無治療的CoV組大鼠病理檢查提示肺部炎性損傷加重，與調(diào)研中冠狀病毒感染患者的癥狀相吻合。本研究也觀察了肺組織勻漿上清炎性相關細胞因子的表達情況。實驗結果亦顯示與正常對照組相比，CoV 組大鼠的肺勻漿上清中檢測出的IL-6、TNF-α、IFN-γ水平明顯增高，而與3 d 時比較，7 d 時CoV組大鼠的肺勻漿上清中IL-6、TNF-α、IFN-γ水平也被證實增高更加明顯。

目前臨床研究報告指出中藥及肺泡灌注在冠狀病毒感染的疫情控制中發(fā)揮了其特殊作用，多項研究發(fā)現(xiàn)黃芩甙元具有抗病毒及改善免疫炎性反應的療效，肺泡灌注清除肺泡黏液[19]。分組進行肺泡灌注載藥納米黃芩甙元技術治療有效性的探討，研究觀察到，在14 d、28 d 兩個時間點，無治療的CoV 組大鼠體重進行性下降，反應萎靡；治療組及安慰劑組大鼠體重無繼續(xù)下降，活動及覓食量有改善，其中治療組改善較安慰劑組明顯。行為學實驗亦提示在實驗7 d、14 d 時，治療組大鼠T 迷宮實驗中達正確臂耗時顯著少于CoV 組，且療效隨著時間發(fā)展得到進一步改善。病理學結果提示14 d 時，CoV 組肺部炎性損傷加重，治療組見炎癥組織病變區(qū)縮小，淋巴細胞浸潤數(shù)量及肺泡內(nèi)滲出物減少，安慰劑組仍可見肺組織呈局限性的大致同前的炎癥改變；28 d 時治療組可見炎癥組織病變區(qū)明顯縮小好轉，肺泡結構完整，無出血、滲出；而CoV 組可見病變區(qū)肺泡破壞并出現(xiàn)纖維結締組織增生，伴有出血、滲出等嚴重的破壞。安慰劑組亦有相應好轉，炎癥組織病變縮小，但可見肺間隔內(nèi)見出血、滲出、少許單核細胞等浸潤。上述研究結果證實冠狀病毒感染性疾病有淋巴細胞浸潤數(shù)量及肺泡內(nèi)滲出物增多等特征性病理改變；感染冠狀病毒后，應用肺泡灌注黃芩甙元載藥納米的治療方式，可有效減輕該炎性反應，改善大鼠的機能，通過內(nèi)源性抗氧化防御保護了器官組織的炎性損傷。冠狀病毒感染可造成肺泡黏液組織分泌增多等病理改變，而安慰劑組單純肺泡灌注清除肺泡黏液，療效不如治療組。

目前國內(nèi)外研究指出，冠狀病毒感染性肺炎的間質(zhì)性肺炎與免疫炎癥反應程度、冠狀病毒的感染及復制相關。本研究中，14 d時治療組肺部病毒分離轉陰，血清IgG抗體滴度在治療后即逐漸下降，在28 d時，滴度下降明顯，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。而安慰組單純肺泡灌注干預后病毒分離仍為陽性，在14 d、28 d 時，血清IgG 抗體滴度有所下降。另外，在14 d、28 d，治療組及安慰劑組的肺勻漿上清中IL-6、TNF-α、IFN-γ因子水平下降，在28 d 時，治療組上述因子水平與同組在3 d、7 d時相比，細胞因子水平明顯下降，改變是有統(tǒng)計學意義的；且在28 d時，與對照組相比，治療組上述因子水平差異無統(tǒng)計學意義。結果所示，經(jīng)肺泡灌注載藥納米黃芩甙元技術治療后，治療組的大鼠行為臨床狀態(tài)、肺部病變的改變與其肺組織勻漿上清的IL-6、TNF-α、IFN-γ水平改變相關。安慰劑組肺部炎癥減輕，勻漿上清細胞因子水平所下降，但治療組較安慰劑組有效。驗證肺泡灌注黃芩甙元載藥納米的治療方式通過內(nèi)源性抗氧化防御，減輕免疫炎性反應，并抑制了病毒的復制及存活，抑制了肺組織的應激損傷；而安慰劑組單純使用肺泡灌注技術可稀釋氣管肺泡分泌物、暢通氣道，無法從根本上清除病毒，療效不及治療組。

綜上所述，肺泡灌注載藥納米黃芩甙元技術通過減輕免疫炎性反應改善冠狀病毒感染大鼠的急性呼吸綜合征，對冠狀病毒感染性肺炎有明確治療效果的，值得應用推廣。這一發(fā)現(xiàn)為新型冠狀病毒的臨床藥物研發(fā)奠定了基礎，對新型冠狀病毒的發(fā)病機制的研究提供研發(fā)新思路。