盛同玲，李亞楠，李建鑫，胡 鈺，陶 霞，陳立江，梁 嘯

(遼寧大學(xué) 藥學(xué)院，沈陽 110036)

馬齒莧(PortLacaoleraceaL.)，又名馬齒菜、五行草、螞蚱菜，是馬齒莧科馬齒莧屬植物全草[1].既可入藥，又可食用，是我國衛(wèi)生部劃定87種藥食同源的野生植物之一.馬齒莧為一年生草本，全株無毛.莖平臥或斜倚，伏地鋪散，多分枝，圓柱形，長10～15 cm淡綠色或帶暗紅色.馬齒莧以其干燥地上部分入藥，性味酸寒，具有清熱解毒，涼血止血之功效.清熱解毒，散血消腫.治熱痢膿血，熱淋，血淋，帶下，癰腫惡瘡，丹毒，痕疬.用于濕熱所致的腹瀉、痢疾，常配黃連、木香.內(nèi)服或搗汁外敷，治癰腫.亦用于便血、子宮出血，有止血作用[2].

三萜類化合物是馬齒莧中的主要活性成分之一[1-3].之前的藥理學(xué)文獻(xiàn)指出馬齒莧中的這些三萜類化合物具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗糖尿病、降低血糖、保護(hù)肝臟、抗?jié)僛4].因此，馬齒莧中三萜類化合物的提取與檢測對于了解馬齒莧藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以及質(zhì)量控制是必要的.目前，僅有一篇文獻(xiàn)采用高效液相-質(zhì)譜(UPLC-PDA)測定馬齒莧中羽扇豆醇的含量[5]，然而,上述方法非常的耗時而且靈敏度和專屬性較差，不適合在中藥這種復(fù)雜系統(tǒng)測定多個三萜類化合物.超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)作為一種最現(xiàn)代分離和檢測的方法已經(jīng)越來越被人們所關(guān)注.它具有較短的分析周期、較好的分離效能、更好的峰型、較低的溶劑消耗、極高的靈敏度及高通量等特點(diǎn).此外，串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)及多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)技術(shù)由于其高選擇性，已經(jīng)被證明非常適合對分析物的檢測.UPLC-MS/MS技術(shù)可以同時測定多種含量相對較低的三萜類化合物.

在傳統(tǒng)的提取方法中，植物中三萜類化合物的提取通常采用熱回流提取法(HRE)，浸入提取法 (IE)和超聲波提取法 (USE)[6].然而，隨著能源價格上漲和二氧化碳排放對環(huán)境的影響，人們擁有極大的興趣開發(fā)新技術(shù)(用最小的溶劑量和更少的能量)用于天然產(chǎn)物的提取.最近，微波提取法(MWE)已經(jīng)成為作為一種從植物中提取三萜類化合物的趨勢[7-8].在我們的研究中，使用四種不同的提取方法來比較黃酮類化合物的提取率[9].

本文中一個MWE-UPLC-MS/MS方法被用于5個三萜類化合物的提取和定量，包括：熊果酸(1)，2α,19α-二羥基熊果酸(2)，3α,19α-二羥基熊果酸(3)，19α,14-二羥基熊果酸(4)，3-乙酰氧基油桐酸(5)，化合物1～5的結(jié)構(gòu)如圖1所示.該方法不僅可用于不同產(chǎn)地及不同采摘期的馬齒莧，而且也可以應(yīng)用于提取和測定其他復(fù)雜系統(tǒng)中的三萜類化合物[10].

圖1 五個三萜化合物結(jié)構(gòu)

1 實(shí)驗(yàn)儀器與藥材

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

UPLC-MS系統(tǒng)(Waters公司)；UPLC-MS系統(tǒng) (ESI離子源)(AB Sciex公司)；Analyst software (versions 1.5.1) (AB Sciex公司)；XP-205十萬分之一分析天平、XP-204萬分之一分析天平(METTLER TOLEDO公司)；HH-2 數(shù)字顯示恒溫水浴鍋(常州國華儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-210(瑞士BUCHI公司)；超聲提取器(昆山超聲儀器有限公司)；微波提取器(廣州和竺生物科技有限公司)；XW-80 型渦旋混合器 (江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)；Waters ACQUITY UPLC BEH C18 (100×2.1 mm, 1.7 μm)色譜柱、Waters ACQUITY ；UPLC HSS T3 (100×2.1 mm, 1.7 μm) 色譜柱、Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18(100×2.1 mm, 1.7 μm) 色譜柱(Waters公司)；微孔濾膜0.22 μm(密理博公司)；微孔濾膜0.45μm (Agilent公司)；離心管15 mL/50 mL(coning公司)；容量瓶5 mL/10 mL/25mL/50mL/100mL(Brand公司)；移液器10 μL/20 μL/100 μL/200 μL/1 000 μL/5 000 μL (Eppendorf公司)；玻璃儀器(蜀牛).

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 材料名稱

用于提取的甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷(天津化工公司)為分析級；超純水(密理博公司)；用于分析的乙腈和甲酸(Fisher公司)為色譜級；用于分析的50%甲酸水、甲酸銨、乙酸、乙酸銨(Sigma-Aldrich公司)為色譜級.

1.2.2 對照品名稱

熊果酸(1) 、2α,19α-二羥基熊果酸(2) 、3α,19α-二羥基熊果酸(3) 、19α,14-二羥基熊果酸(4) 、3-乙酰氧基油桐酸(5) 均為自制(質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%).

1.3 藥材

藥材的收集來自于中國的不同區(qū)域(遼寧沈陽、吉林白城、黑龍江榆樹、安徽蕪湖、四川樂山、湖北宜昌、河北滄州)及不同采摘期(河北1-4分別采摘于3、6、8、11月份)，經(jīng)沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院生藥教研室路金才教授鑒定為馬齒莧(PortLacaoleraceaL.).

2 提取工藝及測定指標(biāo)

2.1 提取工藝

取馬齒莧地上部分1 g用于不同提取方法(熱回流提取法、浸入提取法、超聲波提取法和微波提取法)的考察.

2.1.1 熱回流提取法

將1 g藥材放于50 mL玻璃燒瓶中，加入10 mL甲醇，放入80 ℃的水浴中，回流提取2次，每次2h.

2.1.2 浸入提取法

將1 g藥材放于50 mL錐形瓶中，加入10 mL甲醇，在室溫下浸泡提取2次，每次2 h.

2.1.3 超聲提取法

將1 g藥材放于50 mL 錐形瓶中，加入10 mL甲醇，放入在60 ℃水浴中，在40 kHz的頻率下超聲提取2次，每次30 min.

2.1.4 微波提取法

將1 g藥材放于50 mL密閉容器中，采用單因素實(shí)驗(yàn)考察優(yōu)化提取條件(提取溶劑、提取溫度、提取時間、固液比).

所有的提取物都被濃縮，干燥，之后用50%的乙腈水溶解、稀釋、定容在50 mL的容量瓶中，溶液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，可用于進(jìn)樣，進(jìn)樣3 μL[11-12].

2.2 測定指標(biāo)

2.2.1 UPLC條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100×2.1 mm, 1.7 μm)

流動相：乙腈-0.05%甲酸水溶液(V/V)梯度洗脫

梯度洗脫：采用二元梯度洗脫系統(tǒng)，溶劑A(乙腈)-溶劑B(0.05%甲酸水溶液)，梯度程序見表1.

表1 梯度洗脫程序

柱溫：30 ℃;流速：0.3 mL/min;進(jìn)樣量：3 μL

按照實(shí)驗(yàn)的要求收集了12批不同產(chǎn)地批次的藥材.見表2.

2.2.2 MS條件

采用電噴霧離子源(ESI)在負(fù)離子模式下檢測.

離子噴霧電壓：-4.5 kV;渦輪噴射溫度：550 ℃;噴霧器和輔助氣體：氮?dú)?霧化氣體壓力：50 psi;加熱輔助氣壓力：50 psi;氣簾氣壓力：30 psi;掃描方式：MRM;每個化合物的MRM離子對、優(yōu)化了的去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)及碰撞單元出口電壓(CXP)詳見表3.

表2 產(chǎn)地和質(zhì)量

表3 桔梗中五種三萜的保留時間，MRM躍遷，去簇電位(DP)，碰撞能(CE)和碰撞細(xì)胞出口電位(CXP)

2.3 結(jié)果和討論

2.3.1 提取方法的優(yōu)化

為了獲得滿意的提取率，使用Anhui樣品對四種不同溶劑提取方法進(jìn)行了評估.通過5個三萜類化合物的提取率評估了熱回流提取法、浸入提取法、超聲提取法和微波提取法.結(jié)果表明采用微波提取法(提?。?0 ℃，固液比：20 mL/g，提取時間10 min)的提取率顯著高于其他方法，而且微波提取法還擁有更短的提取時間的優(yōu)勢.結(jié)果見圖2. 因此，微波提取法被選擇成為提取方法[13].

通過5個三萜類化合物的提取率評估了不同的提取溶劑(二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、30%乙醇水(V/V)、70%乙醇水(V/V)和水).結(jié)果表明甲醇是最有效的提取溶劑.結(jié)果見圖3.

為了進(jìn)一步的優(yōu)化微波提取法，考察了提取溫度(60、70、80 ℃)、固液比(20、30、40 mL/g)、提取時間(8、10、12 min)等參數(shù)[14].結(jié)果表明，微波提取法的最優(yōu)條件為以甲醇作為提取溶劑，提取溫度為70 ℃，提取時間為10 min，固液比為30 mL/g時，提取率最高.結(jié)果見圖4.

圖2 提取程序的評估：(A)提取方法的評估(MWE：甲醇，70 ℃，10 min，20 mL /g，其他提取方法參見“實(shí)驗(yàn)”)

圖3 提取程序的評估：(B)不同溶劑的評估

圖4 MWE程序的優(yōu)化(萃取溫度，溶劑與固體之比和萃取時間)

2.3.2 UPLC條件的優(yōu)化

對不同種類的流動相進(jìn)行了測試.與甲醇相比，乙腈所用分析時間較短及峰型更好.幾個流動相添加劑,包括甲酸、冰醋酸、氨和醋酸銨,被用來優(yōu)化分析物的分離度、峰型和質(zhì)譜電離強(qiáng)度.最終，0.05%甲酸被選作為流動相添加劑,因?yàn)樗苁狗治鑫锏碾x子強(qiáng)度更高和產(chǎn)生一個更好的分離效能.

三種色譜柱被考察，包括Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100×2.1 mm, 1.7 μm)；Waters ACQUITY UPLC HSS T3 (100×2.1 mm, 1.7 μm)；Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18(100×2.1 mm, 1.7 μm).最終選擇Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100×2.1 mm, 1.7 μm)作為分析色譜柱，因?yàn)槿祁惢衔锏耐之悩?gòu)體在該色譜柱上擁有最佳的分離度、更佳對稱峰的形狀,及更短的色譜分離時間.5個三萜類化合物的的總離子流圖見圖5.

圖5 五個三萜的標(biāo)準(zhǔn)混合物的總離子色譜法

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 校正曲線

制備5個化合物的乙腈儲備溶液，稀釋至適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量濃度用以建立校正曲線，按上述色譜條件測定，記錄色譜峰面積.以峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明該方法在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.結(jié)果見表4.

2.4.2檢測限(LOD)和定量限(LOQ)

稀釋5個三萜類化合物的乙腈儲備溶液成一系列適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量濃度，檢測限和定量限測量的信噪比(S / N)分別大約為3和10.檢測限和定量限均分別小于1.211和4.335 ng/mL, 說明該方法檢測這5個三萜類化合物的具有較高的靈敏度[15].結(jié)果見表4.

2.4.3 精密度

精密度是通過日內(nèi)精密度和日間精密度來評價的.采用用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來作為精密度的衡量指標(biāo).選用樣品Anhui作為提取和分析的對象，日內(nèi)精密度是一天內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，日間精密度是連續(xù)進(jìn)樣3 d.日內(nèi)和日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均分別低于2.56%和2.73%，說明該方法適合于定量測量這5個三萜類化合物.結(jié)果見表5.

2.4.4 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度測試是通過回收率實(shí)驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)的.準(zhǔn)確稱取九份0.5 g包含5個三萜類化合物的藥材樣品.9份樣品分別加入三種不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)(大約相當(dāng)于0.5、1.0和1.5倍樣品的質(zhì)量濃度)，然后進(jìn)行該樣本提取，使用最佳樣品提取過程如上所述.回收率通過測得量與加入量的比計算得到.所有分析物的整體回收率范圍從95.1%到104.4%,且回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于2.79%，這說明該方法可以準(zhǔn)確的測定這些分析物的含量.結(jié)果見表5.

2.4.5 重現(xiàn)性

重現(xiàn)性是由分析Anhui樣品得到的.三份樣本，分別提取每個0.5 g,每份進(jìn)樣3次.重復(fù)性的結(jié)果顯示相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于2.84%.結(jié)果見表 5.

綜上所述，該方法的驗(yàn)證結(jié)果顯示良好的線性、靈敏度、精確度、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度.

表4 五個馬齒莧三萜的UPLC-ESI-MS / MS分析的校準(zhǔn)參數(shù)

表5 UPLC-ESI-MS / MS分析馬齒莧的五個三萜的精密度、準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和回收率

2.5 定量分析

在最優(yōu)的條件下，同時檢測十個不同批次馬齒莧中含5個三萜類化合物的量.采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析.不同批次馬齒莧中含5個三萜類化合物的總量見圖6.不同批次馬齒莧中5個三萜類化合物的量見表5.定量結(jié)果表明化合物1和3在所有測試樣品中含量較高.樣品Anhui中化合物1、3及5的量高于其他樣品，樣品Heibei-4中化合物2在所有測試樣品中最高.樣品Liaoning中化合物4在所有測試樣品中最高.我們的研究結(jié)果表明，不同生產(chǎn)區(qū)域的樣品中5個三萜類化合物的差別很大.

圖6 不同來源馬齒莧中含五個三萜的總量(n=3，μg/ g)

3 結(jié) 語

本文開發(fā)的MWE-UPLC-MS/MS方法只需要10 min就可以提取馬齒莧中的5個三萜類化合物，在11 min內(nèi)就可對這些三萜類化合物進(jìn)行定量分析.此外該方法也可大量減少溶劑消耗.驗(yàn)證數(shù)據(jù)表明，微波提取法結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)是十分可靠和穩(wěn)定的.這些藥物活性成分的測定為馬齒莧質(zhì)量評估及臨床應(yīng)用提供了很有價值的信息.

表6 來自不同來源的西洋參中含五個三萜的量(n=3，μg/ g)