王 力，張凈宇，劉建華，趙海勇，溫 芳，游 洋，丁紅梅

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA)是一種常見的慢性退行性疾病，隨病程延長，膝關(guān)節(jié)功能會(huì)逐漸喪失，最終導(dǎo)致殘疾[1]。既往KOA早期治療以物理及藥物治療為主，旨在延緩病情進(jìn)展、減輕臨床癥狀，晚期則可考慮行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)。既往對藥物、物理治療無效，臨床評估病變尚無需行關(guān)節(jié)置換術(shù)者，關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)是其最為有效的治療手段，可清除軟骨碎屑、降解顆粒及各種炎性因子，并可調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)液酸堿度與滲透壓，改善關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境與軟骨營養(yǎng)供給，延緩病程進(jìn)展[2]。但關(guān)節(jié)軟骨屬透明軟骨，內(nèi)部無神經(jīng)、血管及淋巴管分布，未分化細(xì)胞無法進(jìn)入并修復(fù)損傷部位，且軟骨細(xì)胞包埋于致密的膠原-蛋白多糖基質(zhì)中，限制了細(xì)胞增殖和遷移能力，使得軟骨細(xì)胞基質(zhì)的合成能力受限，無法滿足組織修復(fù)需要。隨細(xì)胞生物理論和對KOA病因病理研究的不斷深入，使得干細(xì)胞技術(shù)治療KOA成為可能。自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(ABMSCs)因具有免疫抑制活性、多向分化潛能及易培養(yǎng)等特點(diǎn)，近年逐漸應(yīng)用于膝關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療[3]。研究顯示，ABMSCs具有高度自我更新能力和多向分化潛能，體外不同條件誘導(dǎo)下可分化為不同組織，有效修復(fù)受損軟骨組織[4]。但目前關(guān)于ABMSCs移植聯(lián)合關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)治療KOA的報(bào)道較少，故而本研究在行關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)基礎(chǔ)上聯(lián)合ABMSCs移植治療KOA，探討其臨床治療效果以及對患者疼痛、膝關(guān)節(jié)功能、炎性因子的影響。

1 對象與方法

1.1納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合KOA診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②Kellgren-Lawrence(K-L)分級(jí)Ⅱ～Ⅲ級(jí)；③單側(cè)患病；④具有關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)和ABMSCs移植治療適應(yīng)證；⑤無其他系統(tǒng)嚴(yán)重器質(zhì)性病變。

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn)：①膝關(guān)節(jié)嚴(yán)重畸形或存在關(guān)節(jié)游離體者；②合并風(fēng)濕及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎者；③合并嚴(yán)重肝腎功能不全、凝血功能異常者；④正接受藥物等其他方法治療者；⑤伴膝關(guān)節(jié)急性創(chuàng)傷或感染、局部皮膚破潰者；⑥有膝關(guān)節(jié)手術(shù)史者；⑦伴精神異常、認(rèn)知障礙者。

1.2對象及方法 選取我院2017年10月—2019年2月收治的110例KOA患者，其中男60例，女50例；年齡45～73(64.8±5.1)歲；病變側(cè)別：左膝37例，右膝73例；病程3個(gè)月～3年，平均(1.42±0.65)年；K-L分級(jí)：Ⅱ級(jí)32例，Ⅲ級(jí)78例。所有患者據(jù)治療方法不同分為觀察組57例和對照組53例。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。

1.3治療方法 兩組均行關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)，觀察組在此基礎(chǔ)上聯(lián)合ABMSCs移植治療。

1.3.1對照組：對照組予膝關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)，完善術(shù)前準(zhǔn)備，連續(xù)硬膜外麻醉，麻醉起效后患者取平臥位，常規(guī)消毒鋪巾，自患膝關(guān)節(jié)前內(nèi)、外做一約5 mm切口，后置入關(guān)節(jié)鏡，全面探查患膝關(guān)節(jié)，逐一清理關(guān)節(jié)病變組織，視病情情況松解或部分切除髕下肥厚脂肪組織與內(nèi)側(cè)滑膜嵌頓組織，部分切除炎癥較重的增生肥厚滑膜組織，同時(shí)處理合并的半月板損傷。術(shù)后用0.9%氯化鈉注射液充分沖洗關(guān)節(jié)腔，逐層縫合切口并無菌敷料包扎。

1.3.2觀察組

1.3.2.1血小板裂解液(PL)制備：關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)前1周抽取自體空腹靜脈血300 ml，1000 r/min離心10 min取上清，-20℃冰箱過夜后再于-80℃冰箱凍存12 h后取出，置于37℃水浴鍋中融化3 min，后以1000 r/min離心4 min所獲上清液即為PL。將獲得的PL中加入氯化鈣2 mg/ml和凝血酶28 U/ml，混勻后37℃培養(yǎng)6 d，1000 r/min離心5 min，獲得的上清液即為激活的PL液，置于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2ABMSCs分離培養(yǎng)：行關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)的同時(shí)，消毒患者髂后上棘，穿刺注射器抽取骨髓血60 ml。采用密度梯度離心法分離骨髓血中ABMSCs，采用貼壁培養(yǎng)法在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，2～3 d換培養(yǎng)液1次。培養(yǎng)第8日用0.25%胰蛋白酶消化后行傳代培養(yǎng)、純化，取第2代細(xì)胞分裝于-80℃冰箱冷凍備用。

1.3.2.3ABMSCs移植：觀察組在關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)后1個(gè)月行ABMSCs移植，關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)方法同對照組。移植術(shù)前1周于患膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射激活的PL液3 ml，移植術(shù)前3 d取凍存的第2代ABMSCs培養(yǎng)，移植當(dāng)日以0.25%胰蛋白酶收集ABMSCs，1000 r/min離心6 min棄上清后取激活的PL液3 ml重懸?；颊呷⊙雠P位，常規(guī)膝關(guān)節(jié)腔穿刺抽取關(guān)節(jié)積液，拔下注射器針管，留置針頭接裝有ABMSCs懸液的注射器，緩慢注入患膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)2 ml。注射完畢后無菌紗布按壓針眼3～5 min，俯臥位保持30 min，每5 min屈伸活動(dòng)膝關(guān)節(jié)8～10次。移植術(shù)后1周再次關(guān)節(jié)腔穿刺注射激活的PL液3 ml。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1療效評定[6]：治療后半年比較兩組療效。臨床控制：關(guān)節(jié)疼痛、腫脹等癥狀消失，關(guān)節(jié)功能基本恢復(fù)正常；顯效：關(guān)節(jié)疼痛、腫脹等癥狀顯著緩解，關(guān)節(jié)功能明顯好轉(zhuǎn)；好轉(zhuǎn)：關(guān)節(jié)疼痛、腫脹等癥狀有所緩解，關(guān)節(jié)功能有所好轉(zhuǎn)；無效：關(guān)節(jié)疼痛、腫脹等癥狀及關(guān)節(jié)功能均無好轉(zhuǎn)或加重?？傆行?(臨床控制+顯效+好轉(zhuǎn))例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4.2疼痛程度：治療前及治療后3、6個(gè)月，采用視覺模擬評分法(visual analogue scale， VAS)評價(jià)兩組疼痛程度，總分0～10分，得分越高表示疼痛程度越嚴(yán)重[7]。

1.4.3膝關(guān)節(jié)功能：治療前及治療后3、6個(gè)月采用Lysholm膝關(guān)節(jié)評分量表(Lysholm knee score scale， LKSS)評價(jià)兩組患膝關(guān)節(jié)功能恢復(fù)情況，總分100分，得分越高表示膝關(guān)節(jié)功能恢復(fù)越好[8]。

1.4.4關(guān)節(jié)液炎性因子：治療前及治療后3、6個(gè)月，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測兩組患膝關(guān)節(jié)液白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。

1.4.5治療后半年兩組并發(fā)癥

2 結(jié)果

2.1臨床療效比較 觀察組治療總有效率為91.23%高于對照組的71.70%(χ2=7.042，P=0.008)。見表1。

2.2治療前后疼痛VAS評分比較 兩組治療后VAS評分逐漸降低，治療后3、6個(gè)月VAS評分均較治療前降低，且觀察組治療后3、6個(gè)月VAS評分均低于對照組同時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 不同方法治療的膝骨關(guān)節(jié)炎兩組治療前后疼痛視覺模擬評分法評分比較分)

2.3治療前后LKSS評分比較 兩組治療后LKSS評分逐漸升高，治療后3、6個(gè)月LKSS評分均較治療前升高，且觀察組治療后3、6個(gè)月LKSS評分均高于對照組同時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 不同方法治療的膝骨關(guān)節(jié)炎兩組治療前后Lysholm膝關(guān)節(jié)評分量表評分比較分)

2.4治療前后關(guān)節(jié)液炎性因子比較 兩組治療后IL-1β、TNF-α逐漸降低，治療后3、6個(gè)月IL-1β、TNF-α均低于治療前，且觀察組治療后3、6個(gè)月IL-1β、TNF-α亦低于對照組同時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表4 不同方法治療的膝骨關(guān)節(jié)炎兩組治療前后關(guān)節(jié)液炎性因子比較

2.5并發(fā)癥發(fā)生情況 治療后半年，兩組均未出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫、發(fā)熱等局部感染和其他不適。

3 討論

KOA的發(fā)生與衰老、炎癥、超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)、骨質(zhì)增生、遺傳、肥胖、環(huán)境等多種因素有關(guān)，在上述因素影響下可致膝關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生慢性、無菌性、進(jìn)行性改變，關(guān)節(jié)活動(dòng)受到明顯限制，從而嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[9]。目前尚無有效藥物能阻止KOA病情進(jìn)展，隨病程進(jìn)展，最終需行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)，然而該術(shù)存在血栓、感染等風(fēng)險(xiǎn)且費(fèi)用昂貴，極大增加了患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)目前主要用于藥物治療無效且又不具有關(guān)節(jié)置換適應(yīng)證的KOA患者，可調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)液酸堿度與滲透壓，改善關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境與軟骨營養(yǎng)供給情況，延緩病程進(jìn)展[10]。但關(guān)節(jié)軟骨屬透明軟骨，內(nèi)部無神經(jīng)、血管及淋巴管分布，未分化細(xì)胞無法進(jìn)入并修復(fù)損傷部位，且軟骨細(xì)胞包埋于致密的膠原-蛋白多糖基質(zhì)中，限制了細(xì)胞的增殖和遷移能力，使得軟骨細(xì)胞基質(zhì)的合成能力受限，無法滿足組織修復(fù)的需要。隨著細(xì)胞生物理論和對KOA病因病理研究的不斷深入，使得干細(xì)胞技術(shù)治療KOA成為可能。

間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛分布于骨髓及脂肪組織中，具有向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞分化的潛能，且易于獲取[11]。梁建基等[12]對骨性關(guān)節(jié)炎患者采用關(guān)節(jié)腔注射ABMSCs治療，顯著改善了關(guān)節(jié)疼痛及僵硬癥狀，有效促進(jìn)了病變關(guān)節(jié)功能恢復(fù)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示ABMSCs可抑制骨關(guān)節(jié)炎模型動(dòng)物的炎性反應(yīng)，降低軟骨基質(zhì)降解速度，促進(jìn)新生軟骨生成與基質(zhì)分泌，減輕滑膜增生，抑制骨贅形成[13]。

研究表明，胰島素樣生長因子-1、白細(xì)胞介素-1等多種細(xì)胞因子參與了軟骨細(xì)胞的分裂、生長、成熟與老化過程，KOA的發(fā)生即是因上述細(xì)胞因子平衡被打破，使其朝軟骨分解的方向進(jìn)行所致[14]。我們在ABMSCs移植術(shù)前及術(shù)后注射PL液，可糾正關(guān)節(jié)軟骨合成與分解失衡，PL液中含有血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，可促進(jìn)局部血管形成，改善局部血液供應(yīng)，促進(jìn)ABMSCs向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果顯示：觀察組治療總有效率為91.23%高于對照組的71.70%；兩組治療后VAS評分逐漸降低，治療后3、6個(gè)月VAS評分均較治療前降低，且觀察組治療后3、6個(gè)月VAS評分均低于對照組同時(shí)間；兩組治療后LKSS評分逐漸升高，治療后3、6個(gè)月LKSS評分均較治療前升高，且觀察組治療后3、6個(gè)月LKSS評分均高于對照組同時(shí)間。研究顯示，退行性骨關(guān)節(jié)環(huán)境為酸性及低氧環(huán)境，其中含有大量的炎癥介質(zhì)，可引起軟骨破壞，抑制軟骨再生，影響ABMSCs的增殖和分化[15]。在KOA發(fā)病與發(fā)展過程中，IL-1β、TNF-α通過介導(dǎo)多種炎性反應(yīng)參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，誘發(fā)軟骨細(xì)胞凋亡與細(xì)胞外基質(zhì)降解，在關(guān)節(jié)軟骨破壞初始階段起很大作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，兩組治療后IL-1β、TNF-α逐漸降低，治療后3、6個(gè)月時(shí)IL-1β、TNF-α均顯著低于治療前，其中觀察組各項(xiàng)炎癥介質(zhì)水平與對照組同時(shí)點(diǎn)相比均有明顯降低。

綜上，ABMSCs移植聯(lián)合關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)治療KOA效果顯著，可顯著緩解患者疼痛，促進(jìn)患膝關(guān)節(jié)功能恢復(fù)，有效抑制患膝關(guān)節(jié)液炎癥介質(zhì)釋放，且安全性良好。