戴意強(qiáng) 吳寒 單成俊 劉小莉 王英 臧泉 周劍忠 夏秀東

摘要：為提高藍(lán)莓出汁率和果汁中花色苷含量，以酶的種類、酶解時(shí)間、酶解溫度和酶的添加量為對象，研究其對藍(lán)莓出汁率和花色苷含量的影響。通過單因素試驗(yàn)研究藍(lán)莓出汁率和花色苷含量對各因素的依賴關(guān)系，并采用響應(yīng)曲面法進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，提高藍(lán)莓出汁率和花色苷含量的最佳工藝為酶解時(shí)間3 h，酶解溫度 54.5 ℃，酶的添加量4.8‰，在此條件下藍(lán)莓出汁率和花色苷含量分別為70.95%和44.94 mg/L。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓;出汁率;花色苷含量;響應(yīng)曲面;酶解工藝

中圖分類號： TS255.36 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0219-06

藍(lán)莓（Vaccinium uliginosum）屬于杜鵑花科越橘屬，原產(chǎn)于北美和歐洲地區(qū)[1]。藍(lán)莓被稱為“長壽水果”，具有很強(qiáng)的抗氧化能力，可以清除自由基，被人們認(rèn)為是所有水果和蔬菜中抗氧化劑的最大來源之一[2]。藍(lán)莓果實(shí)含有豐富的蛋白質(zhì)、食物纖維、糖分、維生素、礦物質(zhì)、花色苷等[3]。在常見含有花色苷的果蔬中，藍(lán)莓花色苷含量最高[4]，具有抗氧化、保護(hù)視力、預(yù)防治療癌癥、預(yù)防心腦血管疾病和提高記憶力等功能[5-10]。

藍(lán)莓的成熟正值夏季，且生產(chǎn)時(shí)間集中，果實(shí)不耐儲藏，因此常常被加工成果汁、果酒、果醬等制品。目前的果蔬加工業(yè)中，常常會加入酶類以提高果蔬汁的出汁率及內(nèi)容物的溶出，其中應(yīng)用最廣泛的是添加果膠酶[11]?，F(xiàn)有的研究普遍使用單一酶加入到果蔬中或者僅僅將出汁率作為指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)，本試驗(yàn)利用果膠酶和纖維素酶對藍(lán)莓進(jìn)行酶解，以出汁率和花色苷含量作為評價(jià)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面優(yōu)化，確定最佳的藍(lán)莓汁生產(chǎn)工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

藍(lán)莓來源于南京市溧水區(qū)白馬種植基地;果膠酶（≥40 units/mg solid）和纖維素酶（≥50 units/mg solid）購于上海藍(lán)季生物公司。

1.2 試劑與儀器

試劑：KCl，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);NaAc，南京化學(xué)試劑股份有限公司生產(chǎn)。

儀器：離心機(jī)3K15，SIGMA生產(chǎn);數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4，國華電器有限公司生產(chǎn);破壁多功能料理機(jī)，愛納福電器有限公司生產(chǎn);酶標(biāo)儀Epoch，美國伯騰儀器有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藍(lán)莓汁的制作工藝 藍(lán)莓→清洗→瀝干→破碎打漿→加酶→保溫酶解→離心（5 000 r/min，15 min）→收集上清→成品。

1.3.2 藍(lán)莓酶解單因素試驗(yàn) （1）酶的種類對藍(lán)莓出汁率及花色苷的影響。果膠酶和纖維素酶按 1 ∶ 1 的比例添加，添加量為3‰，酶解溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為2 h，考察酶的種類（不添加酶，添加果膠酶，添加纖維素酶，添加果膠酶和纖維素酶）對藍(lán)莓出汁率及花色苷的影響。（2）酶的添加量對藍(lán)莓出汁率和花色苷含量的影響。添加果膠酶和纖維素酶，酶解溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為2 h，考察酶的添加量（1‰、2‰、3‰、4‰、5‰）對藍(lán)莓出汁率和花色苷含量的影響。（3）酶解溫度對藍(lán)莓出汁率和花色苷含量的影響。添加果膠酶和纖維素酶，酶的添加量為3‰，酶解時(shí)間為2 h，考察酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）對藍(lán)莓出汁率和花色苷含量的影響。（4）酶解時(shí)間對藍(lán)莓出汁率和花色苷含量的影響。添加果膠酶和纖維素酶，酶的添加量為3‰，酶解溫度為50 ℃，考察酶解時(shí)間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對藍(lán)莓出汁率和花色苷含量的影響。

1.3.3 酶解效果指標(biāo)的測定 （1）出汁率的測定：分別稱取藍(lán)莓果漿和離心后收集的上清液，按以下公式計(jì)算出汁率：出汁率=上清液質(zhì)量/藍(lán)莓果漿質(zhì)量×100%。（2）花色苷的測定：參照蘭永麗的報(bào)道方法[12]進(jìn)行測定。取2份同一試樣0.1 mL，分別加入0.2 mol/L的KCl（pH值1.0）和0.2 mol/L的NaAc（pH值4.5）0.9 mL，靜止平衡1 h后，分別測定樣品在510 nm和700 nm處的吸光度。花色苷含量計(jì)算公式：花青素含量=ΔD×MM×D×1 000/ε。式中：ΔD代表[（D510 nm-D700 nm）pH1.0-（D510 nm-D700 nm）pH4.5]，mg/L;MM代表矢車菊素-3-葡萄糖苷分子質(zhì)量449.2;D代表稀釋倍數(shù);ε代表矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)26 900。

1.3.4 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 由單因素試驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以藍(lán)莓出汁率和花色苷含量為響應(yīng)值，選取酶的添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面試驗(yàn)，優(yōu)化藍(lán)莓汁制作的工藝參數(shù)，試驗(yàn)因素及水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶的種類對藍(lán)莓果漿出汁率及花色苷含量的影響 藍(lán)莓果實(shí)的細(xì)胞間層和細(xì)胞壁之間存在著果膠，果膠會影響、阻礙藍(lán)莓中有效成分的釋放[13]，而果膠酶的加入可以使藍(lán)莓渣中果膠物質(zhì)進(jìn)一步分解，提高出汁率和促進(jìn)花色苷等物質(zhì)的釋放。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)能抵抗微生物破壞和一些物理化學(xué)損傷，纖維素酶可以破壞木質(zhì)纖維素生物質(zhì)結(jié)構(gòu)，使得內(nèi)容物流出[14-15]。由圖1可知，與不添加酶相比，單獨(dú)添加一種酶后的藍(lán)莓出汁率無顯著增加，但果膠酶和纖維素酶聯(lián)合作用的藍(lán)莓出汁率顯著增加（P<0.05）。與不添加酶相比，通過添加果膠酶和纖維素酶，藍(lán)莓汁的花色苷含量顯著增加（P<0.05），這是因?yàn)楣z酶和纖維素酶使藍(lán)莓果膠和纖維素等物質(zhì)水解，進(jìn)而有效成分如花色苷充分溶出，且花色苷的含量與產(chǎn)品的顏色呈正相關(guān)[16]，有助于增強(qiáng)消費(fèi)者的認(rèn)同感。果膠酶和纖維素酶共同加入的藍(lán)莓出汁率和花色苷含量分別為63.45%和41.94 mg/L。因此選擇藍(lán)莓中添加果膠酶和纖維素酶有助于出汁率和花色苷含量的提高。

2.1.2 酶解時(shí)間對藍(lán)莓出汁率和花色苷含量的影響 由圖2可見，隨著酶解時(shí)間的增加，藍(lán)莓的出汁率和花色苷含量先持續(xù)增加后趨于平穩(wěn)。酶的作用促使藍(lán)莓果肉組織和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生了破壞，當(dāng)酶解時(shí)間為2.5 h時(shí)，出汁率和花色苷含量均達(dá)到最大值，分別為65.27%和41.90 mg/L，此時(shí)藍(lán)莓內(nèi)容物已基本溶出。

2.1.3 酶解溫度對藍(lán)莓出汁率和花色苷含量的影響 酶的最適溫度不僅能保持酶自身的熱穩(wěn)定性和維持自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，還能通過影響酶活性位點(diǎn)的親和力來影響酶的活性。由圖3可知，當(dāng)溫度從40 ℃上升至55 ℃時(shí)，藍(lán)莓的出汁率和花色苷含量顯著上升（P<0.05）;當(dāng)酶解溫度為55 ℃時(shí)，藍(lán)莓出汁率和花色苷含量分別為 65.45% 和 43.31 mg/L，相較于40 ℃時(shí)藍(lán)莓的出汁率和花色苷含量，分別上升了7.44%和13.24%。當(dāng)溫度上升至60 ℃時(shí)，藍(lán)莓出汁率顯著降低（P<0.05），但藍(lán)莓汁中花色苷含量保持平穩(wěn)，這是因?yàn)闇囟壬仙绊懥斯z酶和纖維素酶的活性，而適當(dāng)?shù)臏囟瓤梢蕴岣呋ㄉ盏娜艹雎?，抑制過氧化物酶、多酚氧化酶等可以降解花色苷的酶的活性。

2.1.4 酶的添加量對藍(lán)莓出汁率和花色苷含量的影響 將果膠酶和纖維素酶按1 ∶ 1的比例添加到藍(lán)莓果漿中，其對藍(lán)莓果汁出汁率和花色苷含量的影響如圖4所示。適當(dāng)?shù)拿柑砑硬粌H可以提高藍(lán)莓的出汁率，而且還可以釋放結(jié)合態(tài)花色苷，提高藍(lán)莓汁的顏色和抗氧化程度。隨著酶添加量的增加，藍(lán)莓的出汁率和花色苷含量先增加后趨于平穩(wěn)，這與張曉旭等的研究結(jié)果[17]一致。當(dāng)酶的添加量為4‰時(shí)，藍(lán)莓果漿的出汁率和花色苷含量分別為64.33%和41.11 mg/L。選擇酶的添加量為4‰時(shí)，既可以保證產(chǎn)品的得率和品質(zhì)，又可以減少生產(chǎn)成本。

2.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果 在單因素的基礎(chǔ)上，向藍(lán)莓汁的制作過程中添加果膠酶和纖維素酶，以藍(lán)莓的出汁率（Y1）和藍(lán)莓汁花色苷含量（Y2）作為試驗(yàn)設(shè)計(jì)的響應(yīng)值，酶的添加量（A）、酶解溫度（B）和酶解時(shí)間（C）為自變量，設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面試驗(yàn)，結(jié)果見表2。對表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到藍(lán)莓出汁率和花色苷含量的二次多項(xiàng)回歸方程為式（1）和式（2），其中Y1為出汁率，Y2是花色苷含量，A為酶解時(shí)間，B為酶解溫度，C為酶的添加量。

2.2.2 響應(yīng)曲面方差分析 模型的方差分析見表3和表4。P值大小衡量了模型的各個(gè)因素的顯著性水平。由表3可知，P<0.01，表明關(guān)于出汁率的模型高度顯著，F(xiàn)值為41.63，也表明二次模型高度顯著。在模型中，一次項(xiàng)A和二次項(xiàng)A2、B2影響顯著。失擬值為0.87，在α=0.01或α=0.05下不顯著，因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系極顯著（R2=0.98）。由表4可知，P<0.05，表明關(guān)于花色苷含量的模型顯著，F(xiàn)值為6.51，也表明二次模型顯著。在模型中，一次項(xiàng)B和二次項(xiàng)B2以及交叉項(xiàng)AB為影響顯著。失擬值為1.46，在α=0.01或α=0.05下不顯著，因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.89）。

通過方差分析，結(jié)合3個(gè)因素的平方值可以得到3個(gè)因素對出汁率的影響次序?yàn)槊附鈺r(shí)間>酶的添加量>酶解溫度，而3個(gè)因素對花色苷含量的影響次序?yàn)槊附鉁囟?酶解時(shí)間>酶的添加量。

2.2.3 響應(yīng)曲面交互作用分析 響應(yīng)曲面（等高線圖和3D圖）可以直觀地反應(yīng)試驗(yàn)中不同因素對藍(lán)莓出汁率和藍(lán)莓花色苷含量的影響，以及兩兩因素之間交互作用對藍(lán)莓出汁率和花色苷含量的影響。各因素之間的交互作用對藍(lán)莓出汁率和花色苷含量如圖5至圖10所示。

由圖5至圖7等高線圖可知，酶的添加量為4‰時(shí)，酶解時(shí)間一定，藍(lán)莓的出汁率隨著酶解溫度的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢;酶解溫度為55 ℃時(shí)，酶解時(shí)間一定，藍(lán)莓出汁率隨酶的添加量的增加而上升;酶解時(shí)間為2.5 h時(shí)，酶解溫度一定，藍(lán)莓的出汁率隨酶的添加量的增加而上升。由圖5至圖7的3D曲面平滑程度可知，酶解時(shí)間和酶解溫度、酶解時(shí)間和酶的添加量、酶解溫度和酶的添加量兩因素的交互作用不明顯。

由圖8至圖10等高線圖可知，酶的添加量為4‰時(shí)，酶解時(shí)間一定時(shí)，藍(lán)莓汁的花色苷含量隨酶解溫度的上升呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢;酶解溫度為55 ℃時(shí)，酶解時(shí)間一定時(shí)，藍(lán)莓汁的花色苷含量隨酶的添加量的增加呈現(xiàn)上升趨勢;酶解時(shí)間為2.5 h時(shí)，當(dāng)酶解溫度一定時(shí)，藍(lán)莓汁的花色苷含量隨酶的添加量的增加呈現(xiàn)上升趨勢。由圖8至圖10的3D曲面陡峭程度可知，酶解時(shí)間和酶解溫度兩因素交互作用明顯，酶解時(shí)間和酶的添加量、酶解溫度和酶的添加量兩因素的交互作用不明顯。

2.2.4 模型驗(yàn)證試驗(yàn) 通過 Design Expert 中心組合法的優(yōu)化分析可得最高出汁率和花色苷含量條件分別為酶解時(shí)間3 h、酶解溫度54.67 ℃、酶的添加量4.86‰和酶解時(shí)間3 h、酶解溫度54.41 ℃、酶的添加量5‰?？紤]到生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)成本，選取條件為酶解時(shí)間3 h、酶解溫度54.5 ℃、酶的添加量4.8‰。進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，其藍(lán)莓出汁率和花色苷含量分別為70.95%和44.94 mg/L，與預(yù)測值（70.27%和44.58 mg/L）相比，相對誤差分別為0.95%和0.80%，說明該響應(yīng)面模型與實(shí)際擬合結(jié)果較好，該模型可靠。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)相應(yīng)曲面試驗(yàn)，建立了藍(lán)莓出汁率和花色苷含量的二次多項(xiàng)式回歸模型，優(yōu)化藍(lán)莓出汁和花色苷提取的工藝參數(shù)。本試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合程度高，能夠?qū)Ψ磻?yīng)進(jìn)行預(yù)測，模型方差分析中，模型P<0.05，表明該模型顯著。模型給出的最優(yōu)工藝參數(shù)為酶解時(shí)間3 h、酶解溫度54.5 ℃、酶的添加量4.8‰，該條件下藍(lán)莓出汁率和花色苷含量分別為70.95%和44.94 mg/L。

參考文獻(xiàn)：

[1]Magro R P，Stroschoen S R，Da S M，et al. Characterization of blueberry fruits （Vaccinium spp.） and derived products[J]. Food Science and Technology，2014，34（4）：773-779.

[2]Prior R L，Cao G，Martin A，et al. Antioxidant capacity as influenced by total phenolic and anthocyanin content，maturity，and variety of vaccinium species[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46（7）：2686-2693.

[3]李亞東，張志東，吳 林. 藍(lán)莓果實(shí)的成分及保健機(jī)能[J]. 中國食物與營養(yǎng)，2002（1）：27-28.

[4]丁原春，范文廣，韓 雙，等. 不同發(fā)酵工藝對藍(lán)莓酒中花青素含量的影響[J]. 保鮮與加工，2014，14（6）：47-50.

[5]Li J，Solval K M，Alfaro L，et al. Effect of blueberry extract from blueberry pomace on the microencapsulated fish oil[J]. Journal of Food Processing and Preservation，2015，39（2）：199-206.

[6]Michel-Barba G M，Espinosa-Andrews H，García-Reyes A R，et al. Effect of blueberry extract，carriers，and combinations on the growth rate of probiotic and pathogenic bacteria[J]. International Journal of Food Sciences and Nutrition，2018，70（1）：1-8.

[7]陳 瑋，凌文華，呂小飛，等. 花青素對大鼠視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷保護(hù)作用[J]. 中國公共衛(wèi)生，2011，27（4）：464-465.

[8]陳 健，孫愛東，高雪娟，等. 藍(lán)莓花青素的提取及抗氧化性的研究[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（2）：126-129.

[9]Norton C，Kalea A Z，Harris P D，et al. Wild blueberry-rich diets affect the contractile machinery of the vascular smooth muscle in the sprague-dawley rat[J]. Journal of Medicinal Food，2005，8（1）：8-13.

[10]Ramirez M R，Izquierdo I，Raseira M B，et al. Effect of lyophilized vaccinium berries on memory，anxiety and locomotion in adult rats[J]. Pharmacological Research，2005，52（6）：457-462.

[11]Kemal S，Demir N，Acar J，et al. The use of commercial pectinase in the fruit juice industry，part 2：determination of the kinetic behaviour of immobilized commercial pectinase[J]. Journal of Food Engineering，2001，47（4）：271-274.

[12]蘭永麗. 石榴酒及石榴乳酸飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化及其風(fēng)味和抗氧化性研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2017.

[13]屈慧如，任建軍，賈有青，等. 果膠酶對葡萄籽粉抗氧化能力的影響[J]. 現(xiàn)代食品，2019（4）：58-60，67.

[14]Geddes，C C，Peterson J，Mullinnix M T，et al. Optimizing cellulase usage for improved mixing and rheological properties of acid-pretreated sugarcane bagasse[J]. Bioresource Technology，2010，101（23）：9128-9136.

[15]曹培杰，馬艷弘，崔 晉，等. 桑葚濃縮汁的制備工藝優(yōu)化及其抗氧化活性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（17）：204-209.

[16]郁晶晶，唐東芹，李 欣. 香雪蘭花瓣的花色苷組成[J]. 廣西植物，2019，40（5）：687-695.

[17]張曉旭，連培康，顧程程，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化大棗復(fù)合香料的提取及其在卷煙中的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（17）：186-189.