王家皓 賁蕾潔 符茜 張揚 鄭麗雪

摘要：以南苜蓿為原料，通過復合酶解協(xié)同乙醇法提取其葉片中的總黃酮。采用響應面分析法優(yōu)化其最佳提取工藝，進一步考察南苜蓿葉總黃酮對大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制性能，再通過對羥基自由基的清除能力、DPPH自由基的清除能力測定其抗氧化性能。結(jié)果表明最佳提取工藝為：復合酶用量3.0%，酶解時間15.7 min，酶解溫度39.0 ℃。在此條件下，南苜蓿葉總黃酮得率達到（1.9±0.3）%。抑菌試驗結(jié)果表明，南苜蓿葉總黃酮對大腸桿菌ATCC 25922最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，簡稱MIC）為 0.15 mg/mL，對金黃色葡萄球菌ATCC 25923 MIC為0.20 mg/mL。南苜蓿葉總黃酮對羥基自由基和DPPH均表現(xiàn)出一定的清除能力，當樣品濃度為1.0 mg/mL時，清除率分別為54.75%、88.48%，對DPPH自由基、羥自由基半數(shù)抑制濃度IC50分別為0.368、0.947 mg/mL。

關(guān)鍵詞：南苜蓿;葉片;總黃酮;提取工藝;復合酶解法;抑菌活性;抗氧化活性;清除率;最低抑菌濃度;半數(shù)抑制濃度

中圖分類號： TS201.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0201-05

南苜蓿是豆科苜蓿屬的一二年生草本植物，別稱草頭、金花菜，主要分布于我國江浙一帶[1]。它在我國有悠久的栽培歷史，最早作為綠肥和飼料引用栽培[2]。南苜蓿對生長環(huán)境要求不高，所以其產(chǎn)量很大，而且生長快速。南苜蓿具有清熱涼血、治療黃疸、降低膽固醇含量[3]等多種養(yǎng)生調(diào)理作用，營養(yǎng)價值極高，其嫩芽中蛋白質(zhì)含量在28.5%以上，富含18種氨基酸以及豐富的維生素、礦物質(zhì)、微量元素等，具有高蛋白、高膳食纖維、低脂肪特征，加之口感清爽、甘甜，廣泛用于蔬菜食用[4]。

目前，針對南苜蓿的研究主要有3個方面：一是種質(zhì)資源評價與遺傳多樣性研究[5-6];二是功能因子生理活性研究[7-8];三是化學成分提取鑒定。晏小云等從南苜蓿乙醇提取物中發(fā)現(xiàn)以芹菜素為代表的黃酮功能因子，但其生理作用機制尚不清楚，研究相對不夠深入[1]。本研究首次采用復合酶解協(xié)同乙醇法提取南苜蓿葉（主要食用部位）中的總黃酮，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應面分析法對提取工藝進行優(yōu)化，進一步分析其抗菌及抗氧化性能，為蘇南地區(qū)南苜蓿資源的綜合開發(fā)利用奠定一定的理論基礎(chǔ)與試驗數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

主要試驗材料有南苜蓿（常熟當?shù)?0月產(chǎn)）、蕓香苷標準品、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、果膠酶、纖維素酶、無水乙醇、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、磷酸鹽緩沖液、綠礬（FeSO4·7H2O）、鄰二氮菲、三氯乙酸、三氯化鐵、抗壞血酸，均購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

主要試驗儀器有PL602E/02型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、DHG-9037A型恒溫干燥箱（上海浦東榮豐科學儀器有限公司）、HH-11-2-S型水浴鍋（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、722-UV型紫外分光光度計（上海高致精密儀器有限公司）、HK-20B 1000g型粉碎機（廣州市旭朗機械設(shè)備有限公司）、SHB-IIA型離心機（臨海市永昊真空設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗菌種

試驗菌種主要有大腸桿菌（Escherichia coli） ATCC 25922、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） ATCC 25923，菌種保藏于常熟理工學院生物與食品工程學院發(fā)酵工程中心。

1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g 氯化鈉，1 L蒸餾水，pH值為7.2～7.4。

1.5 試驗方法

1.5.1 南苜蓿預處理 將南苜蓿葉置于70 ℃烘箱內(nèi)干燥至恒質(zhì)量，取出用粉碎機粉碎，過20目篩網(wǎng)，得到南苜蓿葉粉末，用袋子密封好放在通風干燥處避光保藏，備用。

1.5.2 標準曲線的制備 參考余勇等的方法[8]制作蕓香苷標準曲線。以蕓香苷濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制出標準曲線。本試驗中得到線性回歸方程為y=12.595x-0.006 8，r2=0.998 7，表明在一定范圍內(nèi)吸光度與濃度的線性關(guān)系良好。

1.5.3 南苜蓿葉總黃酮的提取 稱取2.5 g干燥后的南苜蓿葉粉末置于50 mL燒杯中，先加復合酶液25 mL，放入一定溫度的水浴鍋中酶解一定時間，之后轉(zhuǎn)移至80 ℃水浴鍋中滅酶10 min，取出后用乙醇加至50 mL，再放入40 ℃水浴鍋中提取10 min，取出后用真空抽濾機抽濾，濾液即為含有南苜蓿總黃酮的提取液。

1.5.4 南苜蓿葉總黃酮含量的測定 吸取0.5 mL南苜蓿葉總黃酮提取液置于25 mL比色管中，按“1.5.2”節(jié)下方法測吸光度。根據(jù)蕓香苷標準曲線回歸方程，計算南苜蓿葉總黃酮的含量，然后計算得率。

總黃酮得率=C×25×50×100V×m×1 000×100%。

式中：C表示待測液總黃酮含量，mg/mL;V表示吸取的提取液的體積，mL;m表示提取用的樣品質(zhì)量，g。

1.5.5 單因素試驗 選取復合酶添加量、酶解溫度、酶解時間等3個因素，考察各因素對南苜蓿葉總黃酮得率的影響。在進行單因素試驗時，固定復合酶添加量為1%、酶解溫度為40 ℃、酶解時間為 10 min，分別改變所對應的設(shè)定因素，復合酶添加量為1%、2%、3%、4%、5%;酶解溫度為30、35、40、45、50 ℃;酶解時間為5、10、15、20、25 min。

1.5.6 響應面試驗 根據(jù)前期的單因素試驗結(jié)果進行試驗設(shè)計，然后進行響應面分析，確定最佳提取工藝。試驗因素水平及相關(guān)情況見表1。

1.5.7 抑菌活性測定 采用梯度稀釋分析的方法確定南苜蓿葉總黃酮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）[11]。

在無菌操作條件下，將各濃度梯度的南苜蓿葉總黃酮提取液各吸取2 mL，分別置于不同培養(yǎng)皿中，加入預先準備好的LB培養(yǎng)基，充分混勻，凝固后在平板中分別加入0.2 mL大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌懸液，涂布均勻，以無菌水和5%苯甲酸鈉為陰性和陽性對照，將平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個濃度做平行試驗3次。以不長菌的最低濃度作為南苜蓿葉總黃酮的MIC。

1.5.8 抗氧化活性的測定

1.5.8.1 對DPPH·自由基清除能力的測定 將提取得到的南苜蓿葉總黃酮溶液配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同含量的樣品溶液，參照Cai等的方法[10]進行DPPH·自由基清除能力測定。

1.5.8.2 對羥基自由基清除能力的測定 將提取得到的南苜蓿葉總黃酮溶液配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同含量的樣品溶液，參照許建本等的方法[11]進行羥基自由基清除能力的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 復合酶添加量的影響 在本試驗中，復合酶質(zhì)量之比為1 g ∶ 1 g，由圖1可知，當增加復合酶使用量時，南苜蓿葉總黃酮得率逐漸上升;當在復合酶添加量為3%時，南苜蓿葉總黃酮得率最高，為1.49%;但隨著復合酶添加量增加，得率沒有持續(xù)升高反而出現(xiàn)了下降，這可能是因為酶添加量過多，此時底物完全被酶包圍，植物細胞壁中的纖維素和果膠在酶的作用下產(chǎn)生的水解產(chǎn)物對黃酮類物質(zhì)的吸附性較強[12]，所以復合酶添加量過多反而會使南苜蓿葉總黃酮得率降低。

2.1.2 復合酶酶解溫度的影響 由圖2可知，當溫度小于40 ℃時，隨著溫度的升高，南苜蓿葉總黃酮得率增大，是因為溫度升高，分子運動速度加快，使得細胞內(nèi)成分更容易溶出[13];當溫度大于40 ℃時，隨溫度升高，南苜蓿葉總黃酮得率減小，這是因為酶本質(zhì)上是蛋白質(zhì)， 酶蛋白會因為溫度升高而變性失活，因而浸提效果變差[14]。

2.1.3 復合酶酶解時間的影響 由圖3可知，總黃酮得率在酶解時間為15 min時最佳，達到1.45%，在酶解時間為 5～15 min內(nèi)，南苜蓿葉總黃酮得率隨著酶解時間的延長而變高;之后隨著酶解時間進一步延長，得率有下降趨勢。

2.2 響應面分析法優(yōu)化南苜蓿葉總黃酮提取工藝

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析 通過對各試驗點的響應值進行回歸分析，得到總黃酮得率（y）回歸模型方程為：y=1.99+0.003 75A+0.045B-0.061C-0.078AB+0.001AC-0.013BC-0.2A2-0.17B2-0.31C2。南苜蓿葉總黃酮提取工藝的響應面分析結(jié)果和回歸方程方差結(jié)果分析見表2、表3。

由表3可知，該模型P值=0.000 2<0.01，屬于差異極顯著模型;而失擬項的P值為0.802 3>0.05，差異不顯著，說明該模型能夠預測試驗結(jié)果的分析;模型的確定系數(shù)R2值為0.967 8，R2adj為 0.926 4，說明該試驗所建立的模型擬合良好。

由3個影響因素的F值大小可以得出，各因素對南苜蓿葉總黃酮得率的影響大小分別為酶解溫度>酶解時間>復合酶添加量。模型中因素一次項酶解溫度（C）對南苜蓿葉總黃酮得率有顯著影響，二次項A2、B2、C2對南苜蓿葉總黃酮得率有極顯著影響，交互項中的復合酶添加量（A）與酶解時間（B）對南苜蓿葉總黃酮得率影響顯著，其余項均不顯著。說明各因素對南苜蓿葉黃酮得率的影響并不是簡單的線性關(guān)系，而是存在一定的交互作用。

2.2.2 交互作用分析 根據(jù)響應面回歸方程與方差分析、試驗模型，建立響應面試驗3D結(jié)構(gòu)模型圖和等高線圖，結(jié)果見圖4至圖6。

由圖4至圖6可知，兩兩因素的交互作用對南苜蓿葉總黃酮得率影響作用的3D模型開口均是向下的，即當2個因素水平均提高時，南苜蓿葉總黃酮得率都升高;當達到一個最高值即峰值時，南苜蓿葉總黃酮得率達到最大;當2個因素水平繼續(xù)升高，南苜蓿葉總黃酮得率則開始下降。通過Design Expert 8.0.6軟件的計算可得最佳提取工藝方案為：復合酶用量為3.0%，酶解時間為15.7 min，酶解溫度為 39.0 ℃，此時的得率為1.99%。

2.2.3 最佳提取方案驗證試驗 為驗證響應面試驗模型的準確性與可靠性，根據(jù)上述響應面試驗得到的酶輔助乙醇提取南苜蓿葉總黃酮的最佳提取方案，設(shè)定考察因素水平為：復合酶添加量3.0%，酶解時間15.7 min，酶解溫度39.0 ℃，對南苜蓿葉進行酶解輔助乙醇提取總黃酮化合物，得到南苜蓿葉總黃酮得率為（1.9±0.3）%，與響應面試驗結(jié)果相符，說明此響應面模型得到的南苜蓿葉總黃酮提取工藝在實踐中同樣可行。

2.3 抑菌活性的分析

由表4可知，南苜?？傸S酮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制效果，按照最低抑菌濃度測試方法標準進行分析，南苜蓿葉總黃酮對大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.15 mg/mL，南苜蓿葉黃酮對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.2 mg/mL。

2.4 南苜蓿葉總黃酮抗氧化活性的測定

2.4.1 對DPPH·自由基清除能力的測定 由圖7可以看出，在0.2～1.0 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，南苜蓿葉總黃酮的濃度與DPPH·的清除率成正比，即越高清除率越強。根據(jù)Excel 2010軟件分析，南苜蓿葉總黃酮對DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50為0.368 mg/mL，維生素C對DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50為0.108 mg/mL。

2.4.2 對羥自由基清除能力的測定 由圖8可知，質(zhì)量濃度范圍在0.2～1.0 mg/mL時，南苜蓿葉總黃酮清除羥基自由基的能力隨著濃度的增加而增加，但最大值不超過60%;而維生素C對于羥基自由基的清除能力基本維持在70～90%之間。根據(jù)Excel 2010軟件分析，南苜蓿葉總黃酮對羥自由基的IC50為0.947 mg/mL，維生素C對羥自由基的IC50為0.049 mg/mL?？寡趸囼灲Y(jié)果表明，南苜蓿葉總黃酮對羥基自由基和DPPH·均表現(xiàn)出一定的清除能力，但效果不如維生素C。

3 結(jié)論與討論

以常熟本地產(chǎn)的南苜蓿葉為原料，首次采用復合酶酶解協(xié)同乙醇法提取其中的總黃酮，在單因素試驗的基礎(chǔ)之上，采用響應面分析法對總黃酮提取工藝進行優(yōu)化，并對南苜蓿葉總黃酮的抗氧化活性及抑菌作用進行初步探索，為系統(tǒng)、合理、全面地開發(fā)南苜蓿資源建立科學依據(jù)。試驗結(jié)果表明，南苜蓿葉總黃酮的最佳提取工藝方案：復合酶添加量為3.0%，酶解時間為15.7 min，酶解溫度為39.0 ℃，在此工藝條件下，南苜蓿葉黃酮得率達到（1.9±0.3）%。抑菌試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，南苜蓿葉總黃酮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等2種菌均有明顯的抑制作用，對大腸桿菌的MIC為0.15 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC為 0.2 mg/mL。體外抗氧化試驗結(jié)果表明，南苜蓿葉總黃酮對羥基自由基和DPPH均表現(xiàn)出一定的清除能力，但效果不如維生素C。

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