李美茹 楊爍爍 張洪琛 張?zhí)鞇? 吳興華 張會會

摘要：以紅線蟲（Limnodrilus hoffmeisteri）為材料，采用0.01 mol/L EDTA-2Na的0.9% NaCl溶液為浸提液提取有抑菌活性的多肽，以料液比、時間、pH值對紅線蟲抗菌肽提取條件進行3因素3水平正交試驗優(yōu)化提取工藝，并對處理結(jié)果進行多重比較。試驗結(jié)果表明，紅線蟲抗菌肽對大腸桿菌沒有抑菌效果，對金黃色葡萄球菌有一定抑制效果;影響浸提效果的主要因素為料液比，次要因素為浸提時間和pH值，提取的最優(yōu)處理組合：料液比1 g ∶ 15 mL，浸提時間8 h，浸提液pH值為7.2。

關(guān)鍵詞：紅線蟲;抗菌肽;抑菌效果;大腸桿菌;金黃色葡萄球菌

中圖分類號： Q516;S188 ?文獻標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0191-03

抗菌肽（antimicrobial peptides）是許多生物自身合成的小分子堿性多肽[1]，最早被誘導(dǎo)并純化的抗菌肽是惜古比天蠶（Hyalophora ceropia）產(chǎn)生的昆蟲抗菌肽——天蠶素[2]，昆蟲抗菌肽因其種類和品種繁多、分布廣泛而被研究得最多[3]?？咕木哂泻芏嗵匦?，如殺菌譜廣、耐熱[4-5]，對真菌、細(xì)菌、病毒有抑殺作用，對病原蟲以及異常增殖細(xì)胞有殺傷作用[6]，不易產(chǎn)生耐藥性，可以中和內(nèi)毒素，不會導(dǎo)致膿毒癥等特性[7]。不同來源的抗菌肽被廣泛應(yīng)用，如蔬菜保鮮、醫(yī)藥[8]、食品添加劑[9]、作為飼料添加劑替代抗生素[10]，甚至在抗腫瘤的研究上受到普遍關(guān)注[11]。植物、哺乳動物、兩棲動物、昆蟲、細(xì)菌及病毒均會產(chǎn)生抗菌肽[12]，但針對紅線蟲抗菌肽的研究可謂鮮見。紅線蟲一般稱為水蚯蚓或絲蚯蚓，常見于北方，屬于環(huán)節(jié)動物門中的水生寡毛類，身體顏色多為鮮紅色或暗灰色，外形與蚯蚓的幼體十分相似。它們大多數(shù)生活在江河的岸邊，或成群聚集在河底污泥表層，具有生殖周期短、群體產(chǎn)量高、個體較小、易于操作、價格低廉等特點，所以選取紅線蟲為試驗材料。本研究采用正交設(shè)計的方法優(yōu)化從紅線蟲中分離抗菌肽的條件，并對不同處理進行多重比較，以探索提取抗菌肽最佳工藝，并為紅線蟲抗菌肽利用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 紅線蟲（Limnodrilus hoffmeisteri），購自河北省廊坊市花鳥蟲魚市場;金黃色葡萄球菌（Stap Hylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli），均購自中國普通微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑 EDTA-2Na（AR，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠）、NaCl（AR，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）、蛋白胨（LR，天津市大茂化學(xué)試劑廠）、酵母浸粉（LR，天津市大茂化學(xué)試劑廠）、瓊脂粉（LR，北京普博欣生物科技有限公司）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）（AR，天津市大茂化學(xué)試劑廠）、過硫酸銨（AR，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）、甲差雙丙烯酰胺（AR，北京化工廠）、丙烯酰胺（AR，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS）（AR，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠）、磷酸二氫鈉（AR，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）、甲醇（AR，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）、冰醋酸（AR，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）、磷酸氫二鈉（AR，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠）、考馬斯亮藍G-250（BS，天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

所用培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基：10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，5 g NaCl，15 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水。

1.2 主要儀器設(shè)備

試驗主要設(shè)備有ZHJH-C1115C超凈工作臺（上海智成分析儀器制造有限公司）、TDL-40B離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）、BCD-KFA冰箱（青島海爾股份有限公司）、DW-86L386超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）、MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋[三洋電機株式會社（SANYO）]、ZDP-2270恒溫培養(yǎng)箱（上海智成分析儀器制造有限公司）、ALPHA1-2冷凍干燥機（德國CHRIST）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理 取適量的紅線蟲，用蒸餾水洗凈，吸干水分，平放于培養(yǎng)皿中攤開且保持適宜的厚度，將試驗材料置于-70 ℃的冰箱中冷凍。

1.3.2 紅線蟲抗菌肽提取工藝及粗提取 借鑒已有抗菌肽提取工藝，選用含0.01 mol/L EDTA-2Na的0.9% NaCl溶液為浸提液，考慮料液比、浸提時間、pH值3個因素對抗菌肽提取的影響，設(shè)計3因素3水平正交試驗（表1）。將冷凍后的紅線蟲取出放于研缽中加入液氮迅速研磨，待研磨充分后取 4 mL 研磨液于50 mL的離心管中，按照正交設(shè)計加入浸提液并置于4 ℃冰箱中浸提，每個處理重復(fù)3次。將上述研磨液浸提完成后在4 ℃、2 000 r/min 下離心20 min，取上清液冷凍干燥，獲得抗菌肽的粗提物。將上述提取的抗菌肽粗提物放置于1.5 mL離心管中，于-20 ℃冰箱中進行冷凍保存。

1.3.3 紅線蟲抗菌肽粗提物活性的檢測 采用牛津杯擴散法，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌為受試菌，用血球計數(shù)板計數(shù)法將2種菌配制成 107～108 CFU/mL 菌液，用移液槍各吸取100 μL置于LB平板中，采用涂布平板法將菌液涂布均勻。在涂布好的平板內(nèi)均勻地放置5個牛津杯，并在其中各加入100 μL的100 mg/mL抗菌肽粗提物溶液，并作陰陽性對照。其中，陰性對照為相應(yīng)的浸提液，大腸桿菌的陽性對照為20 U/mL慶大霉素，金黃色葡萄球菌的陽性對照為4 U/mL青霉素。把上述得到的平板在37 ℃條件下連續(xù)培養(yǎng) 24 h，觀察抑菌效果，測量抑菌圈的直徑，試驗重復(fù)3次，計算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽粗提物的抑菌效果

由圖1可以看出，紅線蟲抗菌肽粗提物在 100 mg/mL 濃度下對金黃葡萄球菌有明顯的抑制效果。由圖2可以看出，紅線蟲抗菌肽粗提物在含有大腸桿菌的LB培養(yǎng)基中并沒有出現(xiàn)相應(yīng)的抑菌圈，所以紅線蟲抗菌肽粗提物在100 mg/mL濃度下對大腸桿菌沒有抑菌效果。

2.2 影響紅線蟲抗菌肽提取工藝的因素

由表2可以看出，采用生物統(tǒng)計學(xué)中的直觀分析法對所得數(shù)據(jù)進行分析，料液比的R值為2.94，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了時間（0.83）和pH值（0.83）的R值，可見，料液比為影響紅線蟲抗菌肽抑菌活性的主要因素，浸提時間和pH值為影響紅線蟲抗菌肽抑菌活性的次要因素。天然多肽的提取方法多種多樣，如鹽溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取和有機溶劑提取等，但為保證抗菌肽粗提物抑菌活性而采取冷凍干燥的方法，所以限制采用有機溶劑、酸溶液提取的方法。

2.3 不同處理組合的抑菌效果

由表3可以看出，處理4～處理9均有明顯抑菌效果，處理7、8的抑菌圈直徑分別為11.67、11.83 mm，大于其他處理;其中處理7、8與青霉素抑菌直徑之比分別達到0.56、0.57（表2），最優(yōu)水平組合為A3B2C1（表3），正好為處理8，所以處理8為紅線蟲的最佳處理組合，即料液比1 g ∶ 15 mL，浸提時間為 16 h，浸提液pH值為6.8。

由表3還可以看出，處理9與其他處理間均無顯著差異，處理7、8和處理4、5、6有顯著差異，但處理7、8之間差異并不顯著，所以在實際應(yīng)用中，選用處理7作為優(yōu)化紅線蟲提取工藝。對比處理8、9發(fā)現(xiàn)，并不是浸提時間越長效果越好，相反浸提時間過長反而會引起抑菌效果減弱。

紅線蟲抗菌肽還可以進一步純化，經(jīng)過SDS-PAGE確定分子量，再進行抗菌譜測定，根據(jù)其抗菌譜可以嘗試在食品保鮮、農(nóng)藥、獸藥或醫(yī)藥領(lǐng)域進行應(yīng)用。

3 結(jié)論

本研究根據(jù)前人的工作基礎(chǔ)，首次以紅線蟲為試驗材料，考慮料液比、浸提時間、pH值，設(shè)計3因素3水平正交試驗，以浸提粗制品的抑菌活性為指標(biāo)，確定影響提取工藝的關(guān)鍵因素，優(yōu)化紅線蟲抗菌肽提取工藝。結(jié)果表明，紅線蟲抗菌肽粗提物對金黃色葡萄球菌有一定的抑制效果，但對大腸桿菌卻沒有明顯的抑制效果;影響紅線蟲抗菌肽抑菌效果的主要因素是料液比，次要因素是pH值和浸提時間，且提取的最優(yōu)處理組合為料液比 1 g ∶ 15 mL，浸提時間16 h、浸提液的pH值6.8。

參考文獻：

[1]馬文山，廖富蘋，范雪云，等. 細(xì)菌抗菌肽的研究進展及其應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通報，2008（3）：39-43，49.

[2]Boman H B. Inducible antibacterial defense system in Drasophial[J]. Natural，1972，237（5352）：232-235.

[3]李文楚. 昆蟲抗菌肽研究進展[J]. 廣東蠶業(yè)，2000，34（2）：51-59.

[4]黃自然，王少頤. 注射大腸桿菌誘導(dǎo)柞蠶蛹血淋巴產(chǎn)生抗菌物質(zhì)（簡報）[J]. 華南農(nóng)學(xué)院學(xué)報，1981，2（1）：65-68.

[5]Huang Z R，Zheng T H，Ling Y Z，et al. Inhibition effects of antibacterial peptided from the Chinese oak silkworm（Antheraea pernyi）pupae[J]. Science Bulletin，1987，32（9）：629-632.

[6]Dourado F S，Leite J R，Silva L P，et al. Antimicrobial peptide from the skin secretion of the frog Leptodactylus syphax[J]. Toxicom，2007，50（4）：572-580.

[7]馬清泉，董 娜，曹艷萍，等. 利用精氨酸和纈氨酸設(shè)計新型 α-螺旋抗菌肽[J]. 微生物學(xué)報，2011，51（3）：346-351.

[8]王宏亮，李 昂，那 杰. 抗菌肽在果蔬保鮮中的應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（3）：238-240.

[9]林碧敏，曹 庸. 抗菌肽在農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)的應(yīng)用[J]. 廣東蠶業(yè)，2013（3）：47-51.

[10]Lu J，Chen Z W. Isolation，characterization and anti-cancer activity of SK84，a novel glycine-rich antimicrobial peptide from Drosophila virilis[J]. Peptides，2010，31（1）：44-50.

[11]Shaykhiev R，Beisswenger C K，et al. Human endogenous antibiotic LL-37 stimulates airway epithelial cell proliferation and wound closure[J]. American Journal of Physiology（Lung Cellular and Molecular and Molecular Physiology），2005，33（5）：L842-L848.

[12]Choi J，Sabikhi L，Hassan A，et al. Bioactive peptedes in dairy productes[J]. Interantional Journary of Dairy Technology，2012，65（1）：1-12.