鐘順平，楊貴偉，劉應(yīng)華，楊貴樹(shù)，高利波*

(1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 6502012；2 勐臘縣勐侖鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南 西雙版納 666303)

豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)屬于皰疹病毒科-皰疹病毒屬成員，是一種有囊膜的線狀雙鏈DNA病毒，也是皰疹病毒科中抵抗力較強(qiáng)的一種。由PRV引起的豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是多種哺乳動(dòng)物共患的一種急性傳染病[1]。除了豬以外，其他動(dòng)物感染偽狂犬病病毒后，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎，死亡率極高。豬是偽狂犬病病毒的貯存宿主，發(fā)病后臨床癥狀因感染豬年齡不同而有差異。妊娠母豬會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)死胎及木乃伊胎等綜合癥候群；初生仔豬會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，如運(yùn)動(dòng)失調(diào)和麻痹等，最終衰竭而亡；成年豬多呈隱性感染，但可以引起呼吸道癥狀[2]。

隨著養(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展，云南省的豬病也越加復(fù)雜，為更好地了解和監(jiān)控云南省勐臘縣PRV野毒株的感染流行情況，本研究利用PCR對(duì)2019年該地區(qū)送檢的血液樣品進(jìn)行了相應(yīng)的病原檢測(cè)，為后續(xù)有效控制和凈化PR及進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

2019年云南省勐臘縣各個(gè)地區(qū)豬場(chǎng)送檢的811份血液樣品，包括5個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)的725份樣品和散戶的86份樣品。

1.1.2 主要儀器

移液器(DRAGON公司，KA0052521)、超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司，SW-CJ-1FD)、高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific公 司，75005440)、凝膠成像系統(tǒng)(天能科技有限公司，Tanon-1600)、電泳儀(北京六一儀器廠，DYY-7C)、普通PCR儀(BIO-RAD公司，580BR 12007)和恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司，HWS12)。

1.1.3 主要試劑

DNA提取試劑盒(百泰克生物技術(shù)有限公司)，2×Transhifi Super Mix Ⅱ(含Tag DNA聚合酶，RNaase Inhibitor、dNTP和ddH2O，北京全式金公司)，DNA Marker DL1000(大連寶生物公司)，瓊脂糖(GENE公司)；其他試劑由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室提供，試劑均為分析純。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI GenBank中公布的PRV基因序列(FJ797217、KJ717942和AY169694)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(表1)用于PCR檢測(cè)。引物由昆明碩擎生物公司合成。

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1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取

樣品預(yù)處理和DNA提取均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取的DNA于－20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增

將提取的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：2×Transhifi Super MixⅡ12.5 μL、ddH2O 10.5 μL、 上 游 引 物0.5 μL、下游引物0.5 μL和DNA 1.0 μL，總的反應(yīng)體系為25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)。取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物配制成體系后加樣到1.5%瓊脂糖凝膠孔中，120 V電壓下電泳30 min，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRV基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

PRV基因的擴(kuò)增結(jié)果同預(yù)期目的片段501 bp大小相符(圖1)，表明部分樣品呈PRV陽(yáng)性。在811份血液樣品中，337份樣品檢測(cè)為PRV陽(yáng)性，陽(yáng)性率為41.55%(337/811)。

2.2 不同豬場(chǎng)PRV的陽(yáng)性率

在規(guī)?；i場(chǎng)的725份血液樣品中，334份呈PRV陽(yáng)性，陽(yáng)性率為46.1%(334/725)，各豬場(chǎng)間的陽(yáng)性率差別較大，從35.4%～63.8%不等。散養(yǎng)戶豬群的PRV陽(yáng)性率為3.5%(3/86)。見(jiàn)表2。

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2.3 不同生長(zhǎng)階段豬群PRV的陽(yáng)性率

不同生長(zhǎng)階段豬群(哺乳仔豬、保育豬和育肥豬)的血液樣品共759份，采集自哺乳仔豬、保育豬和育肥豬的血液樣品分別為290份、193份和776份，陽(yáng)性率分別為57.9 %(168/290)、38.3% (74/193)和 28.6%(79/276)。各生長(zhǎng)階段豬群的陽(yáng)性率差異較大，介于28.6%～57.9%，見(jiàn)表3。

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2.4 不同性別豬群PRV的陽(yáng)性率

公豬和母豬的血液樣品分別為10份和42份，陽(yáng)性率分別為20%(2/10)和33.3%(14/42)，表明種公豬和母豬均有感染，見(jiàn)表4。

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3 討論

我國(guó)自1948年首次報(bào)道PR以來(lái)，已有多個(gè)地區(qū)報(bào)道了該病的流行，給無(wú)數(shù)豬場(chǎng)帶來(lái)了很大的經(jīng)濟(jì)損失。吳美芹等在對(duì)2010－2017年21個(gè)省市的豬血清樣品進(jìn)行豬偽狂犬病病毒野毒株gE抗體檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率在7.90%～45.4%[3]。中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心從2011－2016年的檢測(cè)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)gE的陽(yáng)性率在13.0%～64.3%[4]。中科基因公司2017年的PRV gE抗體檢測(cè)結(jié)果顯示豬場(chǎng)的陽(yáng)性率為77.0%，個(gè)體平均陽(yáng)性率為43.3%[5]。

本文用PCR共檢測(cè)了云南省勐臘縣5個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)的725份豬血液樣品和散養(yǎng)戶的86份豬血液樣品，發(fā)現(xiàn)PRV野毒株平均陽(yáng)性率為41.6%，說(shuō)明PR在云南省勐臘縣的豬場(chǎng)中已有一定程度的流行。各豬場(chǎng)的PRV陽(yáng)性率差別較大，豬場(chǎng)E的陽(yáng)性率最低，為35.4%，豬場(chǎng)B的陽(yáng)性率達(dá)63.8%，這可能與送檢血液樣品及各豬場(chǎng)的飼養(yǎng)管理和免疫程序等具體情況不同有關(guān)。據(jù)我們后續(xù)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，豬場(chǎng)B沒(méi)有接種過(guò)豬偽狂犬病疫苗，這應(yīng)該是該豬場(chǎng)陽(yáng)性率比其他豬場(chǎng)高很多的緣故。除豬場(chǎng)E外，4個(gè)接種過(guò)豬偽狂犬病疫苗的規(guī)模化豬場(chǎng)PRV陽(yáng)性率平均為48.8%。結(jié)合之前的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率有上升趨勢(shì)，鄭旺華等報(bào)道云南省西雙版納州兩個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)PRV抗原陽(yáng)性率僅為11.9%[6]。這可能與2011年以來(lái)我國(guó)豬群中相繼出現(xiàn)了致病性更強(qiáng)的豬偽狂犬病病毒變異毒株有關(guān)，變異毒株的抗原性發(fā)生變化使現(xiàn)有的gE基因缺失疫苗提供的保護(hù)作用不能發(fā)揮應(yīng)有的保護(hù)作用。

本次檢測(cè)散養(yǎng)戶豬群PRV的陽(yáng)性率僅為3.5%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于規(guī)?；i場(chǎng)的陽(yáng)性率(46.1%)。本次采樣的散養(yǎng)戶豬群均未接種過(guò)豬偽狂犬病疫苗，和之前的一些報(bào)道相比[7]，勐臘縣的散養(yǎng)戶豬群PRV陽(yáng)性率較低，這可能是因?yàn)榕c其他地區(qū)相比，勐臘縣散養(yǎng)戶的規(guī)模較小，養(yǎng)殖密度較低。從生長(zhǎng)階段看，勐臘縣不同生長(zhǎng)階段豬群都感染了PRV，但感染率不同，感染率由高到低依次為哺乳仔豬、保育豬、母豬、育肥豬和公豬，與國(guó)內(nèi)一些調(diào)查結(jié)果基本一致[5,8-9]。哺乳仔豬感染率高的原因主要是一些豬場(chǎng)忽視了對(duì)哺乳仔豬的免疫,隨著母源抗體的消失，哺乳仔豬及保育豬的易感性增加。

從不同性別豬群看，母豬的陽(yáng)性率為33.3%，高于公豬的陽(yáng)性率(20%)，這在一定程度上說(shuō)明了這一時(shí)期不同性別的豬對(duì)PRV的易感性存在差異。黃曉慧等應(yīng)用ELISA對(duì)安徽地區(qū)不同規(guī)?；i場(chǎng)2012－2015年采集的豬血清樣品進(jìn)行豬偽狂犬病病毒野毒株抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示母豬的陽(yáng)性率為27.46%，公豬的陽(yáng)性率為22.22%[8]?？傊?，勐臘縣豬群存在攜帶PRV的情況，且陽(yáng)性率相對(duì)較高，在當(dāng)前豬病防控的嚴(yán)峻形勢(shì)下，有必要加強(qiáng)對(duì)種豬群的疫病檢測(cè)，推行種豬場(chǎng)主要疫病的控制與凈化工作勢(shì)在必行。