王 培 楚天舒 閻 磊 劉 冰 朱 清 邵鳳民

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病[1]。隨著RA病情發(fā)展，關(guān)節(jié)軟骨和骨可能遭到破壞，最終引發(fā)關(guān)節(jié)畸形及功能喪失，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，給家庭和社會造成較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]?；こ衫w維細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)是滑膜襯里層細(xì)胞，RA的發(fā)生、發(fā)展與FLS侵襲和遷移密切相關(guān)。有研究表明，RA患者滑膜組織中的FLS可以通過產(chǎn)生大量的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)中的成分促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等過程，增強(qiáng)滑膜成纖維細(xì)胞的遷移和侵襲能力，進(jìn)而加速RA疾病的進(jìn)展[3,4]。E-cadherin屬于跨膜蛋白，對維持上皮結(jié)構(gòu)和極性方面具有重要作用，在EMT發(fā)生過程中上皮型標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)型標(biāo)志蛋白α-SMA、vimentin的表達(dá)上調(diào)。Smad1基因?qū)儆赟mads家族成員之一，參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。多項研究表明，Smad1與晚期癌癥分期和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5,6]。多項研究表明，Smad1與多種腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，包括肝癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等[7,8]。Zhang等[9]研究表明，RA患者滑膜組織和FLS中Smad1的表達(dá)水平明顯上調(diào)。然而，Smad1是否可對滑膜成纖維細(xì)胞的侵襲及遷移能力產(chǎn)生影響及其在RA發(fā)生和進(jìn)展中的作用尚未見報道。本研究通過在RA-FLS(MH7A細(xì)胞)中轉(zhuǎn)染Smad1小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，觀察敲減Smad1對MH7A細(xì)胞侵襲和遷移的影響及可能的作用機(jī)制。

材料與方法

1.材料:人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(MH7A細(xì)胞)購自日本Riken生物資源中心；胎牛血清購自美國Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自美國Hyclone公司；實驗所用引物購自上海生工生物工程有限公司；Smad1 siRNA序列(正向引物：5′-AAUACUUUGCUACUUACACAU-3′；反向引物：5′-GUGUAAGUAGCAAAGUAUUUG-3′)及對照序列(正向引物：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；反向引物：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司； Trizol試劑及Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；2×SYBR Green Master Mix試劑盒購自北京中科瑞泰生物科技有限公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、結(jié)晶紫購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；E-cadherin抗體、vimentin抗體、α-SMA抗體、Smad1抗體、GAPDH抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自美國Cell Signal公司；MMP-3抗體和MMP-13抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：MH7A細(xì)胞培養(yǎng)在含10%滅活的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放置在37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行傳代，取對數(shù)生長期的MH7A細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組：提前1天將對數(shù)增殖期的MH7A細(xì)胞種植到6孔板中，種植密度為4×105個/孔，在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長融合度約60%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)置轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染Smad1 siRNA序列的MH7A細(xì)胞)，陰性對照組(轉(zhuǎn)染對照siRNA序列的MH7A細(xì)胞)，同時設(shè)置空白對照組(不做轉(zhuǎn)染處理的MH7A細(xì)胞)，具體轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。將轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

4.qRT-PCR檢測Smad1基因mRNA表達(dá)情況：分別收集轉(zhuǎn)染48h后轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和空白對照組MH7A細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，檢測RNA的濃度和純度，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，使用2×SYBR Green Master Mix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系采用20μl，以GAPDH為內(nèi)參，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。Smad1 正向引物：5′-TTGATGTGCTTTGTGTGCCC-3′；反向引物：5′-CCACAGCAAAATTCCGCCAG-3′；GAPDH 正向引物：5′-AAGGGCCCTGACAACT-CTTT-3′；反向引物：5′-CTCCCCTCTTCAAGGGGTCT-3′。反應(yīng)程序：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 15s，40個循環(huán)。以相對定量法2-ΔΔCt分析各組MH7A細(xì)胞中Smad1基因mRNA相對表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次，取平均值。

5.Western blot法檢測Smad1蛋白表達(dá)情況：分別收集轉(zhuǎn)染48h后的各組MH7A細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液在冰上裂解細(xì)胞提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度，取30μg變性蛋白行12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，隨后封閉。分別加入1∶500稀釋的Smad1一抗和1∶8000稀釋的GAPDH一抗，4℃過夜雜交。TBST洗膜，加入1∶5000稀釋的二抗，室溫孵育1h。TBST洗膜3次，顯色，轉(zhuǎn)移至暗室曝光，標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值以Smad1條帶和GAPDH內(nèi)參條帶的比值確定，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用Image J軟件對圖像統(tǒng)計分析，計算各組MH7A細(xì)胞中Smad1蛋白相對表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次，取平均值。

6.Transwell實驗檢測MH7A細(xì)胞侵襲和遷移能力：分別取處于對數(shù)生長期的各組MH7A細(xì)胞，以不含血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓處理12h，收集細(xì)胞并制成1×106/ml的細(xì)胞懸液，取200μl細(xì)胞懸液接種于孔徑為8μm的Transwell小室的上室，在下室加入600μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。取出Transwell小室，擦去上室未穿膜的細(xì)胞，以4%多聚甲醛固定20min，結(jié)晶紫中染色10min，洗去染液，風(fēng)干，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野觀察并計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)，實驗重復(fù)3次。Transwell細(xì)胞侵襲實驗與細(xì)胞遷移實驗不同之處在于Transwell小室的上室預(yù)先以100mg/L的Matrigel基質(zhì)膠包被，其余步驟相同。

7.Western blot法檢測E-cadherin、vimentin、α-SMA、MMP-3和MMP-13蛋白表達(dá)情況：E-cadherin、vimentin、α-SMA、MMP-3和MMP-13一抗均以1∶1000稀釋，其余步驟同材料與方法5。

結(jié) 果

1.轉(zhuǎn)染Smad1 siRNA對MH7A細(xì)胞Smad1表達(dá)的影響:轉(zhuǎn)染48h后，qRT-PCR和Western blot法實驗結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染Smad1 siRNA的MH7A細(xì)胞中Smad1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖1和表1。

圖1 各組MH7A細(xì)胞中Smad1 mRNA和蛋白表達(dá)量A.Smad1 mRNA表達(dá)量；B.Smad1蛋白表達(dá)量;與陰性對照組比較，*P<0.05

表1 各組MH7A細(xì)胞中Smad1 mRNA和蛋白表達(dá)量比較

2.抑制Smad1對MH7A細(xì)胞EMT的影響：Western blot法檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染組MH7A細(xì)胞中vimentin和α-SMA表達(dá)水平均下調(diào)(P<0.05)， E-cadherin的表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)；而空白對照組和陰性對照組間各蛋白表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖2和表2。

3.抑制Smad1的表達(dá)對MH7A細(xì)胞侵襲和遷移的影響：Transwell實驗檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)；而空白對照組和陰性對照組間侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖3和表3。

圖2 Western blot法檢測各組MH7A細(xì)胞中E-cadherin、vimentin和α-SMA的表達(dá)

表2 抑制Smad1基因?qū)H7A細(xì)胞EMT的影響

圖3 Transwell實驗檢測MH7A細(xì)胞A.侵襲能力；B.遷移能力

表3 抑制Smad1基因?qū)H7A細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

4.抑制Smad1的表達(dá)對MH7A細(xì)胞中MMP-3和MMP-13表達(dá)影響:Western blot法檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染組MH7A細(xì)胞中MMP-3和MMP-13的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)；而空白對照組和陰性對照組細(xì)胞中MMP-3和MMP-13的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖4和表4。

圖4 各組MH7A細(xì)胞中MMP-3和MMP-13的表達(dá)

表4 抑制Smad1基因?qū)H7A細(xì)胞中MMP-3和MMP-13表達(dá)的影響

討 論

RA是一種全身自身免疫性疾病，長期以來，普遍認(rèn)為T細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞及其細(xì)胞因子在RA的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[10]。然而，近年來，從RA患者中分離的滑膜成纖維細(xì)胞的多項研究對這一概念提出了強(qiáng)烈的質(zhì)疑[11]。國內(nèi)外研究者從信號通路、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞侵襲和遷移等多個方面研究了滑膜成纖維細(xì)胞，結(jié)果顯示滑膜成纖維細(xì)胞在發(fā)育過程中起主導(dǎo)作用[12～14]。Smads蛋白是生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)的重要因子，當(dāng)Smads表達(dá)異常時會影響TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致疾病的發(fā)生[15]。Smad1是Smads蛋白家族重要成員之一，Chen等[16]的研究指出miR-345可通過靶向下調(diào)Smad1蛋白來抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。目前，關(guān)于Smad1是否可以抑制滑膜成纖維細(xì)胞的侵襲及遷移，進(jìn)而闡述其在RA發(fā)生、發(fā)展中的作用研究較少。本研究通過在MH7A細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Smad1 siRNA抑制Smad1基因的表達(dá)，通過Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，抑制Smad1的表達(dá)后MH7A細(xì)胞侵襲和遷移能力均明顯受到抑制，Yong等[7]研究也表明，抑制Smad1蛋白的表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

本研究還發(fā)現(xiàn)Smad1基因表達(dá)的抑制可以下調(diào)MH7A細(xì)胞中MMP-3和MMP-13蛋白的表達(dá)。MMPs蛋白質(zhì)是一系列酶，其降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有組分，可增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲[17]。其中，MMP-3和MMP-13是RA滑膜組織中兩種高表達(dá)蛋白[18]。MMP-3可以切割E-cadherin的生物活性片段，促進(jìn)上皮細(xì)胞溶解和釋放，促進(jìn)EMT的發(fā)生，誘導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動，在骨的破壞和軟骨各種組分的降解中起關(guān)鍵作用；MMP-13促進(jìn)RA的骨質(zhì)破壞[19]。本研究通過Western blot法檢測各組MH7A細(xì)胞中EMT標(biāo)志物E-cadherin、vimentin和α-SMA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，抑制Smad1的表達(dá)可下調(diào)vimentin和α-SMA的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，抑制EMT的發(fā)生。多項研究表明，EMT過程是腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，同樣可能影響RA侵襲和遷移過程[20,21]。Xiong等[22]發(fā)現(xiàn)RA患者滑膜成纖維細(xì)胞中miR-21表達(dá)的抑制可通過TGF-β1/Smad4/7信號通路抑制MMPs蛋白的表達(dá)，從而降低滑膜成纖維細(xì)胞的侵襲力。結(jié)合本研究結(jié)果，干擾Smad1基因后MH7A細(xì)胞中MMP-3和MMP-13表達(dá)降低，推測Smad1基因在RA滑膜組織中的高表達(dá)可能通過上調(diào)MMP-3和MMP-13蛋白的表達(dá)，促進(jìn)EMT過程，從而促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

綜上所述，抑制Smad1基因表達(dá)后，MH7A細(xì)胞中侵襲和遷移能力顯著減弱，其作用機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞中MMP-3、MMP-13蛋白表達(dá)進(jìn)而阻礙EMT過程有關(guān)。然而，Smad1基因通過調(diào)控MMPs的表達(dá)影響EMT過程，而EMT進(jìn)一步對RA-FLS侵襲和遷移影響的機(jī)制需進(jìn)一步探究，后續(xù)將在RA動物模型中進(jìn)行深入探究。隨著Smad1基因的深入探究，其可能成為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎基因治療的作用靶點。