劉 雪，趙德義，曹建全，劉林林，徐晶晶，李偉安

（1.山東景芝酒業(yè)股份有限公司，山東景芝 262119；2.山東省釀造食品生物發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東景芝 262119）

釀酒酵母是酵母屬酵母的模式菌，廣泛應(yīng)用于白酒、葡萄酒行業(yè)[1]。目前，白酒行業(yè)普遍使用商品的活性干酵母來提高白酒出酒率。不同地區(qū)的本土酵母存在差異，從而影響酒的風(fēng)味與香氣。在葡萄酒生產(chǎn)中為了彰顯其地域獨(dú)特性，許多國家通過分離鑒定得到了適合本土葡萄酒產(chǎn)區(qū)的酵母菌株，應(yīng)用后取得了顯著效果。例如2010年Capece等[2]從西班牙各地區(qū)的葡萄園篩選了341株本土釀酒酵母，并將其中的兩株進(jìn)行了工業(yè)水平的發(fā)酵試驗(yàn)，得到了很好的應(yīng)用效果。在白酒的生產(chǎn)中也存在酵母菌種的地域性差異，但本土酵母的篩選和使用還處于起步階段，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，2014年孔宇[3]篩選了72株青稞酒本土釀酒酵母，并將其中對青稞酒產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)性能良好的酵母進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室固態(tài)組合培養(yǎng)，也取得了良好的應(yīng)用效果。

景芝酒業(yè)近幾年研究數(shù)據(jù)顯示，長期使用商業(yè)酵母會(huì)破壞發(fā)酵環(huán)境中的微生物生態(tài)平衡，造成微生物比例失調(diào)，進(jìn)而影響酒質(zhì)。為改善因商業(yè)酵母的使用帶來的系列問題，急需自本土環(huán)境中篩選1株優(yōu)勢釀酒酵母菌種來代替商業(yè)酵母在釀酒中的作用，保證出酒率的同時(shí)還可以平衡生態(tài)環(huán)境，使微生物之間互相協(xié)調(diào)，相互作用，提高產(chǎn)品品質(zhì)，為提高我省乃至全國白酒行業(yè)對釀酒酵母的認(rèn)識提供借鑒和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：發(fā)酵5 d、7 d、13 d的景芝酒醅樣品，儲(chǔ)存3個(gè)月以上的景芝中溫曲、景芝包包曲。

YPD培養(yǎng)基：1 % Yeast Extract(酵母膏)，2 %Peptone(蛋白胨)，2 % Dextrose (glucose)(葡萄糖)，若配制固體培養(yǎng)基還應(yīng)加入2%瓊脂粉，以115 ℃、15 min進(jìn)行滅菌；WL酵母培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；PCR使用的引物合成于上海生工生物工程有限公司。

儀器設(shè)備：DYY-6電泳儀，北京市六一儀器廠；C1000 PCR儀，美國伯樂；GELDOC XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad；數(shù)顯酸度計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理方法

稱取10 g樣品于90 mL滅過菌的生理鹽水中，室溫條件下，150 r/min，振蕩浸提30 min。吸取上清液，進(jìn)行梯度稀釋，取100 μL合適梯度的樣品涂布于WL鑒別培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)5 d，根據(jù)不同種屬酵母在WL平板上的菌落顏色和形態(tài)挑選菌落[4]。

1.2.2 初篩

將挑取的菌落在YPD培養(yǎng)基上進(jìn)行3次以上的劃線分離，得到單菌落，按照酵母單菌落在WL培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的形態(tài)特征進(jìn)行初步的形態(tài)分類[4]。

1.2.3 復(fù)篩

將初篩得到的菌種接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基活化24 h后，按照1%接種量接種到5 mL無菌水中進(jìn)行菌株饑餓處理7 d，然后接種到賴氨酸培養(yǎng)基中，27 ℃培養(yǎng)3～4周，觀察菌株生長情況，留取不能生長的菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.2.4 指紋圖譜分析

玻璃珠法提取酵母基因組DNA[5]，使用優(yōu)化的Interdelta引物[6]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：PCR Mix中加入模板1 μL，10 μmol/L引物各1 μL。反應(yīng)條件[6]：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性30 s，46 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增片段在2%的瓊脂糖凝膠上50～80 v電泳1 h，紫外成像儀上觀察并拍照，得到釀酒酵母指紋圖譜。

1.2.5 發(fā)酵性能測定

以相同的接種量（1×106CFU/mL）將分離得到的酵母接種至裝有100 mL大米糖液的250 mL三角瓶中，然后安裝用濃硫酸封閉的發(fā)酵栓，稱重，置于30 ℃培養(yǎng)箱中靜置恒溫培養(yǎng)，每隔12 h取出，振蕩稱重并記錄失重，當(dāng)12 h失重量小于0.2 g時(shí)，停止培養(yǎng)。

1.2.6 耐受性檢測

取1環(huán)酵母接種于裝有3 mL YPD的液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，無菌水調(diào)節(jié)酵母細(xì)胞數(shù)至1.0×106CFU/ mL，將篩選酵母與商業(yè)酵母按相同濃度同時(shí)接種到耐受環(huán)境中，培養(yǎng)48 h進(jìn)行酵母數(shù)量的測定，通過酵母菌數(shù)量比較不同菌株耐受性的差異。

1.2.7 分子生物學(xué)鑒定

玻璃珠法提取酵母基因組DNA，采用26S rDNA D1/D2基因的擴(kuò)增與測序進(jìn)行菌種的鑒定[7]。

1.2.8 應(yīng)用小試：實(shí)驗(yàn)室固態(tài)模擬發(fā)酵

分別將篩選的本土酵母和商業(yè)酵母按照相同的添加濃度添加到已拌入糧食和大曲的酒糟中，裝入發(fā)酵袋后放置于厭氧盒內(nèi)發(fā)酵88 d，發(fā)酵結(jié)束后對比分析酒醅的理化指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩

根據(jù)菌株在WL培養(yǎng)基上的形態(tài)特征將篩選得到的菌株分為22種類型，見表1。

由表1可知，景芝發(fā)酵環(huán)境中的酵母形態(tài)繁多，多達(dá)22種，其中第1、第8、第10、第19共4種形態(tài)的酵母數(shù)量最多，證明這4類酵母在酒醅和大曲中的數(shù)量上占有一定優(yōu)勢。

2.2 復(fù)篩

釀酒酵母不能夠?qū)①嚢彼嶙鳛槲ㄒ坏?，所以在以賴氨酸為唯一氮源的培養(yǎng)基上難以存活和生長，故通過賴氨酸培養(yǎng)基可對初步鑒定為釀酒酵母

的菌株進(jìn)行復(fù)篩[8]。將初篩得到的138株酵母進(jìn)行賴氨酸培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)有95株酵母不能正常生長為釀酒酵母，能夠正常生長的酵母便不作為下一步研究的對象。

表1 篩選酵母的形態(tài)分類

2.3 指紋圖譜

圖1為部分篩選酵母的指紋圖譜，泳道20為商業(yè)酵母所呈現(xiàn)的條帶，其他泳道為篩選的本土酵母條帶，由圖1可知，泳道1、2、3、4、7、12、13、15、19的條帶明顯與商業(yè)酵母的條帶不同，其他泳道條帶類似于商業(yè)酵母，不排除跟商業(yè)酵母是同一菌株，因此將指紋圖譜相同或相類似的菌株排除。通過Interdelta PCR指紋圖譜法，共計(jì)篩選獲得景芝本土酵母51株。

2.4 發(fā)酵性能測定結(jié)果

白酒出酒率主要受酵母菌的發(fā)酵力的影響[9]，對不同酵母發(fā)酵性能的考察，可以作為確定釀造過程中產(chǎn)酒酵母的重要指標(biāo)。研究中對基因型不同于商業(yè)酵母的51株釀酒酵母進(jìn)行了發(fā)酵力測定，測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中的33株酵母發(fā)酵力高于商業(yè)酵母，圖2所示為其中發(fā)酵力較高的幾株。

2.5 耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

窖池中的釀酒酵母會(huì)隨著發(fā)酵的進(jìn)行對所處環(huán)境條件越來越敏感，例如酒醅酸度、糖度、發(fā)酵溫度、乙醇濃度等，因此篩選能夠適用于這些極端環(huán)境的菌株十分重要。將發(fā)酵力高于商業(yè)酵母的本土酵母菌進(jìn)行耐受性（耐高溫、耐乙醇、耐酸、耐糖）測定，測試的耐受度是根據(jù)景芝本地釀造窖池中酒醅的極端條件而定，例如山東地區(qū)夏季窖池溫度最高不超過38 ℃，因此耐受溫度設(shè)為38 ℃，部分菌種的測定結(jié)果見表2。由表2可知，兩株商業(yè)酵母均為耐高溫、高度酒精、高糖、低酸的菌株，而篩選的本土酵母均不能耐受42 ℃高溫，但大部分篩選的酵母在38 ℃下都能正常生長，不影響在本地區(qū)的使用，除此之外同時(shí)具備耐高酒精、高糖、低酸的本土酵母共計(jì)篩選出有26株。

2.6 菌種鑒定結(jié)果

為了進(jìn)一步從基因水平上確定篩選酵母的種屬，提取篩選的本土酵母基因組DNA，進(jìn)行26S rDNA D1/D2基因的擴(kuò)增與測序，測序結(jié)果提交NCBI進(jìn)行Blast對比，結(jié)果顯示篩選酵母均為釀酒酵母。

表2 耐受性試驗(yàn)菌數(shù)生長對比結(jié)果 (×105 CFU/mL)

表3 固態(tài)模擬發(fā)酵酒醅的理化指標(biāo)

2.7 應(yīng)用小試結(jié)果

將篩選的本土酵母和商業(yè)酵母分別培養(yǎng)，按照相同的使用量添加到酒醅中，裝入發(fā)酵袋內(nèi)進(jìn)行固態(tài)模擬發(fā)酵88 d（濃香酒發(fā)酵周期），發(fā)酵結(jié)束后，分析酒醅的各項(xiàng)理化指標(biāo)，分析結(jié)果見表3。

由表3可知，使用本土酵母發(fā)酵后，酒醅水分與不添加酵母和添加商業(yè)酵母的兩組差異不大，但酒醅的酸度有所降低，平均為4.20H+mmol/10 g。實(shí)驗(yàn)組酒醅酒度最高可達(dá)5.28 %vol，比不添加酵母和添加商業(yè)酵母的兩組分別高出11.16 %和11.39 %，由此可以推測出使用本土酵母后出酒率并不會(huì)降低反而有所升高。酯類物質(zhì)分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組乳酸乙酯整體平均值比不添加酵母組高5.4%，比添加商業(yè)酵母組低1.94%，而己酸乙酯整體平均值分別高20.66 %和17.20 %，由此可以看出，使用本土酵母比使用商業(yè)酵母更能達(dá)到增己降乳的效果。劉寧等[10]在研究葡萄酒本土酵母對葡萄酒的影響中也發(fā)現(xiàn)，本土酵母確實(shí)在發(fā)酵產(chǎn)酒的基礎(chǔ)上會(huì)引起酒中酯類物質(zhì)的變化，與本文的研究結(jié)果有一致性。以上數(shù)據(jù)顯示本土酵母的優(yōu)勢明顯高于商業(yè)酵母，經(jīng)過進(jìn)一步生產(chǎn)試驗(yàn)后可在景芝本土推廣并逐漸取代商業(yè)酵母的使用。

3 結(jié)論

對本土釀酒酵母菌種資源的研究鑒定是優(yōu)良釀酒酵母菌種選種、育種、優(yōu)化的基礎(chǔ)，對保存我國優(yōu)良釀酒酵母菌種資源和開發(fā)工業(yè)菌種也具有重要意義[11]。為此，本研究對山東景芝本土釀酒酵母菌種進(jìn)行分離篩選，并對其發(fā)酵特性進(jìn)行研究，以期為本地優(yōu)良酵母菌種資源研究奠定基礎(chǔ)。本研究自山東景芝釀酒環(huán)境（發(fā)酵3 d、7 d、13 d的濃香酒醅、儲(chǔ)存3個(gè)月以上的中溫曲、儲(chǔ)存3個(gè)月的包包曲）中分別進(jìn)行分離篩選本土釀酒酵母，共計(jì)得到135株，利用WL培養(yǎng)基對酵母菌落形態(tài)進(jìn)行分類，共計(jì)22類，利用賴氨酸依賴培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩得到98株釀酒酵母，進(jìn)一步利用分子生物學(xué)基因圖譜分型，得到基因型不同于商業(yè)酵母的本土酵母51株，對其進(jìn)行發(fā)酵力對比測定實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有33株發(fā)酵力高于商業(yè)酵母，在此基礎(chǔ)上，耐受性（耐高溫、耐酸、耐糖、耐酒精）試驗(yàn)也較好的有26株。選取篩選的4株優(yōu)勢酵母經(jīng)過分子生物學(xué)方法鑒定發(fā)現(xiàn)確為釀酒酵母，將4株篩選的酵母進(jìn)行固態(tài)模擬發(fā)酵試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，篩選的本土釀酒酵母應(yīng)用效果良好。將本土釀酒酵母用于簾子麩曲制備，獲得的酵母麩曲菌數(shù)可達(dá)10億個(gè)/g，圓盤制曲可實(shí)現(xiàn)酵母數(shù)量25億個(gè)/g，為將來實(shí)現(xiàn)本土酵母的推廣使用奠定了基礎(chǔ)。