吳艾玲

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都 610039）

啤酒是中國乃至世界上最受歡迎的含酒精飲料之一[1-3]，隨著消費(fèi)升級，消費(fèi)者更加追求產(chǎn)品品質(zhì)，對于原材料、生產(chǎn)工藝等要求提升，高端啤酒對消費(fèi)者吸引力增加。消費(fèi)升級必然帶來產(chǎn)品升級的需求，豐富的產(chǎn)品線也可以提升企業(yè)的競爭優(yōu)勢[4]。

酵母是一種單細(xì)胞微生物，是在食品行業(yè)應(yīng)用較為廣泛的微生物，其中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是酵母菌中最重要、應(yīng)用最廣泛的一類，是發(fā)酵工業(yè)重要的微生物。在啤酒發(fā)酵過程中，酵母產(chǎn)生的酶將糖發(fā)酵生成酒精、CO2和其他一些影響啤酒風(fēng)味和香氣的代謝副產(chǎn)物，如酯類（特別是揮發(fā)性酯類[5]）、高級醇、有機(jī)酸等[6]。這些物質(zhì)與酒花特有的香味混合使啤酒產(chǎn)生特殊的味道和口感。酵母菌種在發(fā)酵過程中直接影響發(fā)酵時(shí)間、降糖速度、雙乙酰還原速度、發(fā)酵度等[7]，而這些因素直接影響到啤酒品質(zhì)和企業(yè)生產(chǎn)成本。

提高啤酒發(fā)酵度、啤酒質(zhì)量的關(guān)鍵在于酵母的選擇，這是優(yōu)化啤酒釀造工藝，提升啤酒品質(zhì)的最根本、最有效的途徑。啤酒酵母的選育途徑主要有誘變[8-10]、雜交[10]、原生質(zhì)體融合法[10-11]、基因工程育種[10，12]。本文詳細(xì)介紹了酵母對釀造過程和啤酒品質(zhì)帶來的影響并綜述了國內(nèi)外利用酵母選育來優(yōu)化釀造過程及提升啤酒品質(zhì)的不同方法，以期能為啤酒企業(yè)優(yōu)化啤酒釀造過程及提高產(chǎn)品質(zhì)量提供新方法。

1 酵母對啤酒帶來的影響

酵母屬于兼性厭氧菌，在有氧和無氧環(huán)境下都能生存。酵母作為啤酒釀造的主要原料之一，它能將麥芽汁中的糖分發(fā)酵成啤酒，產(chǎn)生酒精、二氧化碳及其他中間代謝產(chǎn)物。因此，不同的酵母菌種有不同的生理特性，其本身的特性會(huì)對啤酒釀造過程和成品啤酒帶來很大影響。

1.1 殘?zhí)?/h3>

啤酒發(fā)酵過程中麥芽三糖不能被有效利用是啤酒發(fā)酵緩慢、殘?zhí)呛窟^高的主要原因。不同釀酒酵母菌株的麥芽糖代謝能力存在明顯差異,對啤酒發(fā)酵度有顯著影響。因此，代謝麥芽糖的能力可以作為對酵母菌株品質(zhì)好壞的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)之一[13]。

酵母利用麥芽糖和麥芽三糖需要通過麥芽糖滲透酶和麥芽三糖滲透酶的作用運(yùn)輸?shù)浇湍阁w內(nèi)。Sergio等[14]在2008年證明，帶有MAL21、MAL31或MAL41基因（編碼麥芽糖滲透酶）的酵母菌株無法有效的利用麥芽三糖（在VII號染色體上具有正常MAL11基因的酵母菌株沒有在其基因座處編碼AGT1通透酶的mal1g等位基因，因此無法利用麥芽三糖，MAL21和MAL31與其有高同源度），只有AGT1編碼的滲透酶能夠調(diào)節(jié)低親和力的轉(zhuǎn)運(yùn)麥芽三糖的行為。因此，AGT1編碼的滲透酶是酵母高效吸收和利用麥芽三糖的關(guān)鍵。Sergio等認(rèn)為，導(dǎo)致釀酒酵母在以淀粉為基礎(chǔ)的工業(yè)過程(如釀造)中不完全或延遲消耗麥芽三糖的原因仍然存在爭議。Kristoffer等[15]發(fā)現(xiàn)沒有缺失STA1的菌株能夠利用麥芽三糖等低聚麥芽糖，還對糖化能力差的菌株的STA1開放閱讀框和上游序列進(jìn)行了排序，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母中糖化能力差的菌株的STA1啟動(dòng)子缺失了1162-bp，因此降低STA1的表達(dá)能力。結(jié)果表明，STA1編碼的葡萄糖淀粉酶在麥汁發(fā)酵過程中發(fā)揮了核心作用，

1.2 風(fēng)味化合物（表1、表2）

表1 酵母代謝產(chǎn)生的主要風(fēng)味化合物

高級醇是啤酒釀造過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物之一，也是啤酒關(guān)鍵風(fēng)味化合物之一。啤酒中大約80 %的高級醇在主發(fā)酵期間由于酵母代謝產(chǎn)生，即是酵母在合成細(xì)胞蛋白質(zhì)時(shí)形成。高級醇含量超過100 mg/L會(huì)使啤酒口味和受歡迎程度明顯降低[23]。高級醇類、酯類和鄰二酮類(VDKs)是由酵母產(chǎn)生的關(guān)鍵元素，高級醇類和酯類是可口的啤酒的主要成分，鄰二酮類會(huì)造成異味。由于這些副產(chǎn)物將決定啤酒的最終品質(zhì)，因此Eduardo[24]對釀酒酵母產(chǎn)生的酯類和高級醇類相關(guān)的研究進(jìn)行了論述。Matsche等[25]對兩種不同菌株（加州啤酒酵母和德國啤酒/科爾士酵母）進(jìn)行發(fā)酵分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)香葉醇和香茅醇的濃度在兩種酵母的頂部發(fā)酵液中有顯著差異。

表2 不同酵母代謝產(chǎn)生風(fēng)味化合物特征

在發(fā)酵過程中，溫度的變化會(huì)嚴(yán)重影響酵母的生長及其代謝速率。因此，酵母需要有對環(huán)境的適應(yīng)性，通過改變代謝狀態(tài)來應(yīng)對溫度變化。提高主發(fā)酵溫度可以縮短發(fā)酵周期，但酵母將產(chǎn)生大量的酯類、高級醇等揮發(fā)性物質(zhì)，嚴(yán)重影響啤酒的風(fēng)味[26]。

降低啤酒中雙乙酰的濃度是啤酒釀造過程中一個(gè)昂貴而耗時(shí)的環(huán)節(jié)。由于雙乙酰在啤酒中通常是不需要的，所以去除雙乙酰是啤酒發(fā)酵過程的主要目標(biāo)之一[27]。雙乙酰是一種具有黃油味的鄰二酮，是啤酒發(fā)酵過程中由酵母氨基酸合成途徑得到的產(chǎn)物所形成的鄰二酮(VDK)(雙乙酰前體物質(zhì)α-乙酰乳酸是在酵母細(xì)胞纈氨酸合成途徑內(nèi)形成,然后滲透到細(xì)胞外經(jīng)非酶作用氧化脫羧形成雙乙酰[28]），對啤酒的風(fēng)味和香氣有重要影響。隨后，宋玉梅等[29]發(fā)現(xiàn)，鋅離子作為促進(jìn)揮發(fā)性酸醛類以及雙乙酰等物質(zhì)產(chǎn)生的重要金屬離子，其對風(fēng)味代謝物質(zhì)也有影響。他們研究了酵母菌株YJ02，發(fā)現(xiàn)酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅與大部分脂類代謝產(chǎn)物呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，與醛類、醇類呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)。除了產(chǎn)生的有機(jī)物對啤酒風(fēng)味帶來影響，酵母成熟周期產(chǎn)生并在出芽周期中被吸收的H2S會(huì)掩蓋啤酒中的理想風(fēng)味。Kaneo等[30]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)H2S的濃度大于0.005 mg/L的感官閾值時(shí)，會(huì)產(chǎn)生異味，對啤酒質(zhì)量有不好的影響。

風(fēng)味穩(wěn)定性是啤酒最重要的質(zhì)量指標(biāo)之一，而風(fēng)味的穩(wěn)定性與酵母的抗氧化性相關(guān)，活的啤酒酵母通過自身代謝就會(huì)產(chǎn)生大量抗氧化物質(zhì)，其本身就是優(yōu)良的抗氧化劑[31]。谷胱甘肽（GSH）具有抗衰老的作用，有助于提升啤酒的穩(wěn)定性，其通常是釀酒酵母發(fā)酵代謝得到[32]。

1.3 后期操作

除了酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生風(fēng)味化合物外，其特性對啤酒后期操作也會(huì)帶來影響。啤酒的工業(yè)生產(chǎn)以高溫巴氏滅菌法結(jié)束，這個(gè)過程的目的是使作為發(fā)酵劑的酵母和潛在的腐敗微生物失活，從而延長啤酒的保質(zhì)期。因此，酵母孢子的耐熱性影響了最后成品啤酒滅菌的效果，從而影響了其保質(zhì)期限。Elham等[33]對啤酒中酵母子囊孢子的耐熱性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同的釀酒酵母菌株具有相似的孢子熱阻，將有助于設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)臒岚褪蠝缇鷹l件。釀酒酵母糖化變種被稱為超衰減酵母，由于其具有發(fā)酵啤酒中殘留碳水化合物的能力，這會(huì)導(dǎo)致二次發(fā)酵從而使二氧化碳(CO2)增加，其后果包括啤酒的噴涌和酒瓶的破裂[34-35]。盡管如此，Hutzler等[36]發(fā)現(xiàn)不同類型的釀酒酵母在批量釀造方面具有很高的潛力，也可用于二次發(fā)酵或混合發(fā)酵，以生產(chǎn)具有特殊風(fēng)味和或低碳水化合物含量的啤酒。

1.4 發(fā)酵速率

縮短啤酒發(fā)酵時(shí)間，提高發(fā)酵速率有利于降低生產(chǎn)成本，也可以提高啤酒企業(yè)競爭力。酵母特性對啤酒發(fā)酵速率也會(huì)有一定影響。

早在1984年，Saita等[37]發(fā)現(xiàn)銨離子作為蛋白質(zhì)合成的底物，刺激了糖酵解，提高了釀酒酵母的發(fā)酵速率。Mayu等[38]研究發(fā)現(xiàn)，腺苷甲硫氨酸（Sadenosylmethionine，SAM）參與了糖酵解和酒精發(fā)酵的控制，外源腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）可提高麥芽糖合成培養(yǎng)基和高比重麥汁的發(fā)酵速率，它與底部發(fā)酵啤酒酵母的發(fā)酵速率有特定的關(guān)系。研究表明，腺苷激酶基因ADO1的缺失導(dǎo)致了酵母細(xì)胞中腺苷甲硫氨酸的積累，從而提高了在15 ℃高糖合成培養(yǎng)基中的發(fā)酵速率。

2 優(yōu)化方法

如今，啤酒行業(yè)的競爭越發(fā)激烈，優(yōu)化啤酒的發(fā)酵工藝是提升競爭力的關(guān)鍵。酵母是啤酒釀造的原料之一，而啤酒產(chǎn)生的風(fēng)味化合物含量取決于酵母的代謝，因此科學(xué)家通過基因工程手段和傳統(tǒng)育種對酵母進(jìn)行選育從而改善了影響啤酒質(zhì)量的不利因素。

2.1 基因工程法

基因工程方法是指人為地在體外將外源目的基因插入載體，構(gòu)成重組DNA分子并將重組DNA分子轉(zhuǎn)移受體細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)，從而獲得具有新遺傳性狀或產(chǎn)生新的基因產(chǎn)物的受體細(xì)胞。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展及啤酒酵母基因組的不斷闡明，為改善啤酒質(zhì)量，人們對啤酒酵母菌種改良展開了大量的研究。

為降低成品啤酒的殘?zhí)呛?，Liu等[39]將葡萄糖淀粉酶基因(GLA)整合到菌株基因組的α-乙酰乳酸合成酶基因（ILV2）上，從而構(gòu)建重組巴斯德酵母菌株。發(fā)酵試驗(yàn)初步證實(shí)，與原始菌株相比，重組菌株發(fā)酵的麥芽汁中的雙乙酰和殘余糖濃度分別降低了65.6%和34.2%。在工業(yè)操作下，重組菌株的發(fā)酵啤酒的成熟時(shí)間也降低了。Kristoffer等[15]針對STA1啟動(dòng)子中缺失的1162-bp開發(fā)了一個(gè)新的PCR引物，根據(jù)STA1啟動(dòng)子中缺失的情況來區(qū)分高糖化性和低糖化性菌株。針對啤酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生風(fēng)味化合物，母茜[12]采用一種啤酒酵母工業(yè)菌株的總DNA為模板，采用自克隆技術(shù)得到新菌株，同材料菌株相比，其產(chǎn)生的雙乙酰含量降低。Zhang等[40]利用工業(yè)啤酒酵母菌株S5作親本菌株，以構(gòu)建ATF1（編碼乙醇乙?；D(zhuǎn)移酶）過表達(dá)和BAT2（編碼胞漿支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶）缺失突變體。經(jīng)檢測得到，與親本菌株相比，工程菌株的產(chǎn)酯和高級醇含量有顯著增加。隨后石婷婷等[41]通過同源重組敲除4倍體啤酒酵母α-乙酰乳酸合成酶部分基因(ILV2)構(gòu)建缺失一個(gè)和兩個(gè)ILV2等位基因的突變株QI2-1和QI2-2，經(jīng)過啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)后得出此方法不會(huì)對酵母生長和啤酒發(fā)酵造成不利影響，并且顯著降低了雙乙酰的含量，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。孫中貫等[42]通過構(gòu)建GAP1一個(gè)等位基因敲除菌株和GAP1兩個(gè)等位基因敲除菌株，考察GAP1基因缺失對釀酒酵母高級醇代謝能力及發(fā)酵性能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高級醇合成能力得到不同程度的減弱，重組菌株符合啤酒發(fā)酵的基本要求，具有一定的實(shí)際應(yīng)用潛力，但重組菌株對麥芽糖的利用能力減弱，在未來的研究中還應(yīng)該解決這個(gè)問題。

最近Farhana[43]研究得出CRISPR-PCD和CRISPR-PCRep是新型的基因組工程方法，為釀酒酵母的育種和基因組功能研究提供了一種更快速的操縱多染色體區(qū)域的手段。這給未來優(yōu)化基因工程手段對酵母進(jìn)行改造提供了新方法。

Mayu等[38]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期調(diào)控是影響啤酒酵母發(fā)酵活性的主要因素。釀酒酵母基因中的RIM15和CLN3是具有功能性的，因?yàn)榕c野生菌株相比，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的RIM15干擾物和CLN3DPEST突變株具有更高的發(fā)酵速率。真貝酵母基因中RIM15和CLN3的影響是不確定的。在未來的研究中，確定這些基因如何影響底部發(fā)酵啤酒酵母的發(fā)酵性能將是非常值得去探索的。

2.2 傳統(tǒng)育種方法

酵母細(xì)胞產(chǎn)生的各種芳香化合物的濃度和相對比例對啤酒的質(zhì)量至關(guān)重要?？茖W(xué)家們通過雜交手段對酵母進(jìn)行選育。Jan等[44]對301種不同的酵母進(jìn)行了研究，他們將最好的產(chǎn)香菌株定向雜交產(chǎn)生了46個(gè)種內(nèi)雜種。研究得出，通過非轉(zhuǎn)基因的方法，大規(guī)模的近交育種可以獲得直接用于商業(yè)用途的優(yōu)質(zhì)工業(yè)酵母，它們可以用來釀造新型果味啤酒，或幫助獲得更美味的低酒精啤酒。隨后Stijn等[45]通過對精挑細(xì)選的釀酒酵母(S.cerevisiae)(6株)和真貝酵母(S.eubayanus)(2株)進(jìn)行大規(guī)模的機(jī)器輔助選育，培育出了31種新型種間雜交酵母。它們的芳香型與目前應(yīng)用的啤酒酵母產(chǎn)生的芳香型顯著不同。其中，雜交菌株H29產(chǎn)生了高濃度的乙酸異戊酯、乙酸乙酯、異戊醇和苯基乙酸乙酯，且該菌株的乙醛產(chǎn)量相對較低，這會(huì)提高啤酒的穩(wěn)定性。但最后檢測到啤酒產(chǎn)生了輕微的硫磺味，這一點(diǎn)還需要未來進(jìn)行更深的研究。劉春鳳[17]采用常壓室溫等離子體誘變技術(shù)（ARTP）對啤酒工業(yè)酵母M14進(jìn)行誘變處理，再采用戒酒硫-甲吡唑雙抑制劑平板對得到的誘變菌株進(jìn)行篩選，復(fù)篩后經(jīng)高濃乙醛馴養(yǎng)后得到乙醛含量降低的目的菌株。

葡萄糖阻遏效應(yīng)是麥芽三塘不能被有效利用的原因之一。李紅等[46]通過在以麥芽糖或麥芽三糖為唯一碳源并添加有2-DOG或N-乙酰-D-葡糖胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母，從長出的菌落中篩選出抗2-DOG或N-乙酰-D-葡糖胺的突變菌株，即抗葡萄糖阻遏效應(yīng)菌株，通過初篩以及復(fù)篩，選擇出快速發(fā)酵酵母菌株。郝紅煒等[18]將空間釀酒酵母ST28（由地面釀酒酵母GT28帶入太空返回的誘變菌株）通過YEPD培養(yǎng)基分離純化篩選出1株釀酒酵母ST28-61，在主發(fā)酵過程中產(chǎn)生的雙乙酰含量較少，低于了國家標(biāo)準(zhǔn)，因此不需要后發(fā)酵工藝過程，能夠解決我國釀造啤酒發(fā)酵周期較長的問題。汪志君等[47]采用紫外誘變方法對啤酒酵母進(jìn)行處理，用乳酸平板、麥芽汁-碳酸鈣平板、TTC上層平板進(jìn)行顯色分離，最終得到1株高級醇和雙乙酰產(chǎn)量降低的菌株。Chen等[48]利用非基因工程手段，經(jīng)過兩輪的紫外誘變和特定的平板篩選方法得到了1株突變體，測定發(fā)酵液中GSH的含量和DPPH自由基清除率，得出突變體的抗氧化能力明顯提高。隨后李磊等[49]采用過氧化氫刺激lager型啤酒酵母，Tadpoling法（類似微型平板稀釋涂布法）用于酵母的選育，最終獲得1株抗氧化能力提高且活力穩(wěn)定性較高的啤酒酵母菌株。這是因?yàn)榛畹钠【平湍妇哂泻芎玫倪€原活性，其本身就是優(yōu)良的抗氧化劑。因此，篩選或選育綜合抗啤酒風(fēng)味老化能力提高的優(yōu)良啤酒酵母菌株將成為有效解決啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性問題和延緩啤酒老化的途徑之一。但目前提高酵母抗氧化能力手段較為單一，且酵母抗氧化機(jī)制相關(guān)理論研究仍處在起步階段，因此選育高抗氧化活性酵母的方法還值得進(jìn)一步的改進(jìn)和研究[49]。

Maduka等[50]從斯里蘭卡的棕櫚酒中分離得到18種釀酒酵母菌株。與對照菌株相比，它們在40 ℃，100 g/L葡萄糖的分批發(fā)酵培養(yǎng)基上生長產(chǎn)生的酒精濃度相對較高。其中有5種菌株能在45 ℃環(huán)境下產(chǎn)生酒精。而Serena等[51]則從非釀酒環(huán)境中（葡萄汁、面包、葡萄酒和蘋果酒）分離得到12種菌株，通過實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵篩選，得到DBVPG 1058菌株最適合用于釀造啤酒。這些菌株產(chǎn)生了可觀的酯類和高級醇類濃度，表明它們有潛力成為以獨(dú)特口味為特征的啤酒新型酵母。一些酯類物質(zhì)超過了感官標(biāo)準(zhǔn)值，表明所選的酵母菌株可以生產(chǎn)出帶有啤酒花和焦糖味的果味啤酒。

3 展望

對于食品和飲料工業(yè)中使用的轉(zhuǎn)基因生物的嚴(yán)重關(guān)注仍然是任何商業(yè)化的主要障礙。因此在未來的研究中，在規(guī)避基因工程技術(shù)帶來的風(fēng)險(xiǎn)的同時(shí)，也要大力發(fā)展非基因工程手段進(jìn)行酵母選育以及生物技術(shù)的應(yīng)用。

近年來，科學(xué)家們應(yīng)用固定化細(xì)胞技術(shù)來對啤酒釀造過程進(jìn)行優(yōu)化[52-53]。因?yàn)樵谶B續(xù)發(fā)酵過程中細(xì)胞活力的喪失，在低發(fā)酵溫度下酵母發(fā)酵能力的減弱，以及需要連續(xù)的繁殖和產(chǎn)品的連續(xù)過濾來分離細(xì)胞是現(xiàn)在啤酒釀造過程中存在的現(xiàn)象。固定化細(xì)胞生產(chǎn)啤酒的主要優(yōu)點(diǎn)是提高了發(fā)酵生產(chǎn)力[54]。因此，在這樣一個(gè)競爭激烈的市場中，固定化細(xì)胞技術(shù)(ICT)可以節(jié)省發(fā)酵時(shí)間從而提高啤酒生產(chǎn)力。

挑選優(yōu)良的酵母菌種不僅可以保證啤酒的質(zhì)量和口感，還能縮短發(fā)酵時(shí)間，大大提高了啤酒工業(yè)的競爭力。但在選育過程中仍然存在產(chǎn)生的不良影響。因此在未來還需要對釀酒酵母的基因組進(jìn)行更深層的研究，從而得到更優(yōu)良的產(chǎn)品，降低生產(chǎn)成本，提升市場競爭力。