馬 健，李 嬌，姜 晶

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院/設(shè)施園藝省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/遼寧省設(shè)施園藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110161)

生物在基因組進(jìn)化和適應(yīng)環(huán)境的過程中，有功能的基因會存在串聯(lián)重復(fù)而形成一類串聯(lián)重復(fù)基因。研究發(fā)現(xiàn)，植物基因組中串聯(lián)重復(fù)事件發(fā)生頻率較高，這帶來了植物基因組中基因拷貝數(shù)的增加和等位基因的變異[1]。在擬南芥和水稻基因組中，串聯(lián)重復(fù)機(jī)制對脅迫耐受性和膜功能基因的擴(kuò)張有很大的影響[2-3]。NBS-LRR抗病基因家族在茄科和十字花科植物中都存在串聯(lián)重復(fù)，這對家族進(jìn)化起著非常重要的作用[4]。對于復(fù)雜的功能串聯(lián)重復(fù)序列－串聯(lián)重復(fù)基因的研究，可以揭示植物的重要性狀及表型相關(guān)的基因／基因家族的形成機(jī)制或演化規(guī)律。

小熱激蛋白(sHSPs)最為人所知的是對細(xì)胞應(yīng)激的早期反應(yīng)，作為不依賴ATP 的分子伴侶，可延遲有害蛋白質(zhì)聚集體的形成，以響應(yīng)應(yīng)激源[5]。sHSPs 的分子量大小均在12～42kDa 之間，因此也將其稱為HSP20。該家族成員包含ACD 結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域是以具有典型的β-sandwich 結(jié)構(gòu)的低聚物組成的一個(gè)空心球，作為分子伴侶的功能，有助于蛋白質(zhì)折疊和防止其靶蛋白的聚集[6]。此外，sHSPs 本身非常敏感，它們的活性以及它們的蛋白質(zhì)水平會被細(xì)胞所處環(huán)境激活[7]。最初sHSPs 是在熱應(yīng)激過程中上調(diào)的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)并且組成型表達(dá)。sHSPs 在熱激蛋白中含量最為豐富，與植物耐熱性關(guān)系密切，正常生長條件下，大多數(shù)sHSPs 在植物組織中不積累，而在熱激或其他脅迫下，sHSPs 含量迅速增加。研究表明，高溫脅迫下sHSPs 能自發(fā)形成大小為200～300kDa 的同源寡聚體，并與其他分子伴侶相互作用，幫助受損蛋白重新折疊[8]。在分子水平上，sHSPs 基因可對細(xì)胞活性進(jìn)行瞬時(shí)的重新編程，其特征是伴隨熱激蛋白(HSP)的合成進(jìn)而停止合成正常蛋白質(zhì)。HSP 的一個(gè)共同特征是它們以劑量依賴性方式進(jìn)行積累，足以達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的水平。HSP 基因的表達(dá)主要受轉(zhuǎn)錄水平控制，并且需要轉(zhuǎn)錄水平機(jī)制與特定轉(zhuǎn)錄因子相互作用，熱應(yīng)激因子(HSF)在控制HS 反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[9]。位于5′末端的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列包括HS 響應(yīng)元件(HSEs)和AT-rich 區(qū)域分別負(fù)責(zé)基因的熱誘導(dǎo)性和感應(yīng)熱誘導(dǎo)性。已有關(guān)于擬南芥和水稻的sHSPs 基因家族基因表達(dá)數(shù)據(jù)表明，雙子葉植物和單子葉植物之間的I 類細(xì)胞質(zhì)sHSPs 基因成員具有明顯的時(shí)空分布特異性[10-11]。

番茄sHSPs 基因家族42 個(gè)成員中存在有兩組串聯(lián)重復(fù)基因，其中分別是SlHSP49.3/Sl-HSP39.4 和SlHSP17.7A/SlHSP17.6A/SlHSP17.6B/SlHSP17.6C[5,13]。其中 SlHSP17.7A/SlHSP17.6A/SlHSP17.6B/SlHSP17.6C 的基序排列高度一致，而這組氨基酸序列具有高度保守性的串聯(lián)基因簇的功能尚不清楚。本研究系統(tǒng)分析番茄中四個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因Sl-HSP20 基因的表征和特性，根據(jù)基因的5′末端富含對激素響應(yīng)的順式作用元件，比較該基因簇在激素處理、糖分響應(yīng)的差異以及該基因簇在番茄果實(shí)發(fā)育和成熟階段的共表達(dá)基因，以期為進(jìn)一步分析sHSPs 的進(jìn)化起源及其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試Micro-Tom 番茄，取自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜分子生物學(xué)番茄課題組。種子催芽時(shí)分別在水浴鍋55℃熱激20 min，待水溫降為室溫后于28℃恒溫箱培養(yǎng)，早晚控水洗種。培養(yǎng)48h 后，待70%以上的種子露白后，播于50 孔穴盤。培養(yǎng)于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院蔬菜分子生物學(xué)組培室，溫度25℃，光周期為16h/8 h(晝/夜)，光照強(qiáng)度 120 μmol·m-2·s-1。

1.2 方法

1.2.1 番茄SlHSP20 基因簇的鑒定及理化性質(zhì) 利用tBLASTn 程序在番茄基因組中鑒定SlHSP20 基因簇成員，Solyc06g076520，Solyc06g076540，Solyc06g076560 和 Solyc06g076570(分別命名為 SlHSP17.7A，SlHSP17.6A，SlHSP17.6B 和SlHSP17.6C)。運(yùn)用ExPASy(http://expasy.org/)在線工具預(yù)測鑒定番茄SlHSP20 基因簇氨基酸序列蛋白質(zhì)長度、分子質(zhì)量等理化性質(zhì)。根據(jù)SGN(http://solgenomics.net/)鑒定染色體定位、染色體分布、分子量、等電點(diǎn)和β 折疊數(shù)量等。

1.2.2 番茄SlHSP20 基因簇系統(tǒng)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建及基序分析 將獲得的番茄SlHSP20 基因簇的氨基酸序列保存為FASTA 格式文件，通過MEGA6.0 軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)對基因簇進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。模式采用“Poisson correction”，缺口設(shè)置為“Pairwise Deletion”，校驗(yàn)參數(shù)為 Bootstrap=1000，去除 bootstrap 支持率低于60%的節(jié)點(diǎn)。利用ClustalX 軟件對番茄SlHSP20 成員進(jìn)行多重序列比對，并人工校正。利用MEME(http://meme-suite.org/)軟件分析番茄SlHSP20 基因家族成員基序類型和排列順序，獲得番茄SlHSP20 基因家族基序特點(diǎn)。

1.2.3 番茄SlHSP20 基因簇染色體定位分析 根據(jù)獲得番茄SlHSP20 基因組信息，利用番茄基因組數(shù)據(jù)(SGN,http://solgenomics.net，release v2.50)和軟件MapChart 2.3 定位分析番茄SlHSP20 基因簇染色體。

1.2.4 番茄SlHSP20 基因簇順勢作用元件分析 分析啟動子區(qū)域順式作用元件，從NCBI 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中下載番茄SlHSP20 基因簇ATG 上游2.0kb 序列作為啟動子序列，利用在線工具PLANT CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行順式作用元件分析。

1.2.5 SlHSP20 基因簇在番茄中表達(dá)分析 根據(jù)番茄表達(dá)數(shù)據(jù)庫(http://ted.bti.cornell.edu/)分析SlHSP20 基因簇在不同組織及果實(shí)生長發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)量。在番茄轉(zhuǎn)錄組綜合分析在線網(wǎng)站(http://tomexpress.toulouse.inra.fr/query) 中以SlHSP20 基因簇為誘餌使用對數(shù)標(biāo)度的轉(zhuǎn)錄計(jì)數(shù)值和r 絕對值≥0.98 的閾值的皮爾遜相關(guān)系數(shù)進(jìn)行基因的共表達(dá)分析[12]。

1.2.6 激素和外源糖誘導(dǎo)SlHSP20 基因簇表達(dá)分析 取果實(shí)綠熟期的番茄果實(shí)，用不銹鋼打孔器取果肉(直徑4 mm，厚度2 mm)，進(jìn)行果肉孵育試驗(yàn)，果肉圓片(包含果實(shí)維管束)放入20 mL 基礎(chǔ)緩沖液(MES 50 mmol·L-1pH5.5)，含 CaC125 mmol·L-1，MgC125 mmol·L-1，EDTA 5 mmol·L-1，抗壞血酸 5 mmol·L-1和甘露醇 200 mmol·L-1中平衡 30 min 后，在緩沖液中做以下處理：分別加入 IAA 50 mg·L-1、GA 50 mg·L-1、ABA 50 μmol·L-1、MeJA 50 μmol·L-1、ETH 50 μmol·L-1、SA 50 μmol·L-1、果糖(F) 50mg·L-1、葡萄糖(G) 50mg·L-1、蔗糖(S) 50mg·L-1，在室溫下孵育8h 和24h。取果肉圓片，用濾紙吸干表面水分，液氮速凍保存(-80℃冰箱)，用于后續(xù)基因表達(dá)分析。

總RNAs 的提取使用天根公司的植物總RNA 提取試劑盒(Tiangen，中國)，具體步驟參照制造商的說明。總cDNAs 的獲得使用天根公司的Fast King RT Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，具體步驟參照制造商的說明。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒 (Tiangen，中國)，sHSPs 基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物使用Primer Express 軟件設(shè)計(jì)，并委托鴻訊生物公司合成，純合方式為OPC 級，質(zhì)量為2 OD。使用儀器為Bio-Rad CFX ManagertTM Software 實(shí)時(shí)定量PCR 儀，具體步驟參照制造商的說明。選擇內(nèi)參基因?yàn)锳ctin，所有反應(yīng)進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，做陰性對照并且添加溶解曲線來驗(yàn)證PCR 產(chǎn)物的特異性。

SlHSP17.6A 正向引物 5′-GAAGGAGGAAGTGAAAGT-3′和反向引物 5′-ATCCATCTTTGCGTTCTC-3′，SlHSP17.6B 正向引物 5′-TTTGCCAACACACGAATA-3′和反向引物 5′-GTAACAGTAAGCACTCCG-3′，SlHSP17.6C 正 向引物 5′-ATTAGGCTTCACAGTTTC-3′和 反向引物 5′-AGTAACAGTAAGCACTCC-3′，SlHSP17.7A 正向引物 5′-TTTGCCAACACACGAATA-3′和反向引物 5′-AGTAACAGTAAGCACTCC-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄串聯(lián)重復(fù)SlHSP20基因簇鑒定

利用tBLASTn 在番茄基因組中鑒定4 個(gè)SlHSP20 基因，分析番茄基因簇中4 個(gè)串聯(lián)基因的氨基酸長度、分子質(zhì)量、不穩(wěn)定指數(shù)及等電點(diǎn)等，根據(jù)氨基酸的分子量大小分別對基因簇成員命名為：SlHSP17.6A、SlHSP17.6B、SlHSP17.6C 和SlHSP17.7A?；虼爻蓡T均具有典型的β 折疊結(jié)構(gòu)的保守ACD 結(jié)構(gòu)域。根據(jù)基因組序列分析顯示番茄SlHSP20 蛋白大小一致，番茄 SlHSP20 基因簇(SlHSP17.6A、SlHSP17.6B、SlHSP17.6C 和SlHSP17.7A) 蛋白編碼154 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量變化范圍為17.6～17.7kDa，其中SlHSP17.7A 分子量最大，為17.7kDa，番茄sHSPs 基因簇成員等電點(diǎn)變化為5.57～5.84 之間，等電點(diǎn)最低的是SlHSP17.6C，等電點(diǎn)為5.57，等電點(diǎn)最高的是SlHSP17.6B、SlHSP17.7A，等電點(diǎn)為5.84，說明番茄基因簇SlHSP20 蛋白為酸性(表1)。

表1 番茄SlHSP20 基因簇成員的鑒定Table 1 The identification of SlHSP20 gene members in tomato

根據(jù)同源性序列分析發(fā)現(xiàn)，基因簇成員基因序列具有高度的相似性，同源性達(dá)到95.74%。堿基序列比對發(fā)現(xiàn)4 個(gè)串聯(lián)重復(fù)的基因具有相同的基因結(jié)構(gòu)，均不含內(nèi)含子，且CDS 序列與基因序列基本一致(圖1)。根據(jù)番茄SlHSP20 基因簇成員染色體的定位情況可知，在番茄第6 條染色體上發(fā)現(xiàn)4 個(gè)串聯(lián)重復(fù)的基因(SlHSP17.6A、SlHSP17.6B、SlHSP17.6C 和 SlHSP17.7A)形成了 1 個(gè)基因簇。

圖1 番茄SlHSP20 基因簇成員序列比對Figure 1 Sequence alignment of tomato SlHSP20 gene cluster members

2.2 番茄SlHSP20的4 個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因系統(tǒng)進(jìn)化及基序分析

對番茄SlHSP20 基因簇成員的進(jìn)化樹分析顯示，SlHSP17.6A、SlHSP17.6B、SlHSP17.6C 和SlHSP17.7A 定位于CI 類亞族(細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核)，說明這4 個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因編碼的蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中。根據(jù)SlHSP20基因簇進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)SlHSP17.6A、SlHSP17.6B、SlHSP17.6C 和SlHSP17.7A 為4 個(gè)平行同源基因?qū)?圖2)。運(yùn)用MEME 軟件在番茄sHSPs 蛋白中檢測到SlHSP20 保守基序個(gè)數(shù)為5 個(gè)，其基因簇成員的基序類型及排列順序高度一致，并且SlHSP17.6A、SlHSP17.6B、SlHSP17.6C 和SlHSP17.7A 基序類型相同和排列順序一致(圖2)，由圖3 可知在其基序中包含 8 個(gè)保守的 β 折疊結(jié)構(gòu)(β2～β9)。

圖2 番茄SlHSP20 基因簇進(jìn)化樹分析及蛋白基序類型Figure 2 Charging module circuit diagram

圖3 番茄SlHSP20 基因簇基序及保守結(jié)構(gòu)域β 鏈分析Figure 3 Analysis of motif and β-chain region of conserved domain in tomato SlHSP20 gene cluster

根據(jù)氨基酸同源性分析，基因簇成員具有高度的同源性(圖4 和表2)。所有的SlHSP20 在C 端均具有共同保守的熱激序列,熱激序列又分為保守序列I 和保守序列II，中間有不同長度的親水結(jié)合域。保守序列I 都含有共同的M 殘基：Pro-X(14)-Gly-Val-Leu；保守序列II 的相似氨基酸殘基為：Pro-X(14)-X-Val/Leu/Ile-Val/Leu/Ile；保守序列 I 和 II 是植物 sHSPs 所共有的[7]。

圖4 番茄SlHSP20 基因簇氨基酸序列的多序列比對及保守結(jié)構(gòu)域分析Figure 4 Multiple sequence alignment and conserved domain analysis of tomato SlHSP20 gene cluster

2.3 番茄SlHSP20基因簇順式作用元件分析

對番茄SlHSP20 的4 個(gè)串聯(lián)重復(fù)片段基因的啟動子序列進(jìn)行分析，截取番茄 SlHSP20 基因簇(SlHSP17.6A、SlHSP17.6B、SlHSP17.6C、SlHSP17.7A)ATG 上游2000bp 序列，運(yùn)用PLANTCARE 網(wǎng)站作順式作用原件功能預(yù)測，ABRE，ARE，CGTCA-motif，TGACG-motif，CAT-box，LTR，MBS，TGA-element，site，GARE-motif與生物脅迫相關(guān)，4 個(gè)串聯(lián)基因均含有脫落酸應(yīng)答元件(ABRE)，茉莉酸應(yīng)答元件(CGTCA-motif)，抗氧化應(yīng)答元件(ARE)，其中 SlHSP17.7A、SlHSP17.6B 和 SlHSP17.6C含有低溫脅迫應(yīng)答元件(LTR)，SlHSP17.7A 和SlHSP17.6A 含有干旱脅迫應(yīng)答元件(MBS)，而SlHSP17.7A、SlHSP17.6A 和SlHSP17.6C 含有生長素應(yīng)答元件 (TGA-element)，SlHSP17.6A 含有防御和壓力應(yīng)答元件 (TC-rich repeats)，SlHSP17.6B 和SlHSP17.6C 含有赤霉素應(yīng)答元件(GARE-motif)。SlHSP20 基因簇成員在響應(yīng)非生物脅迫和抗性脅迫過程中起到了明顯的作用，說明該基因簇在響應(yīng)生物進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用[7]。

表2 番茄SlHSP20 基因簇氨基酸序列兩兩比對Table 2 Comparison of amino acid sequence of SlHSP20 gene cluster in tomato %

表3 番茄SlHSP20 基因簇啟動子順式響應(yīng)元件種類Table 3 Type of cis-response element in the promoter of SlHSP20 gene cluster

2.4 串聯(lián)重復(fù)SlHSP20基因簇在番茄中的表達(dá)分析

通過番茄基因數(shù)據(jù)庫(http://ted.bti.cornell.edu/)分析SlHSP20 基因簇在不同組織及果實(shí)生長發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)量（圖5）。SlHSP17.6A、SlHSP17.6B、SlHSP17.6C 和SlHSP17.7A 在葉根和花器官中表達(dá)量均很低，但在果實(shí)發(fā)育與成熟時(shí)期表達(dá)量呈現(xiàn)明顯的差異。在果肉部位SlHSP17.6A 表達(dá)較低，而SlHSP17.6B 和SlHSP17.6C在綠熟期(MG_35DPA)到紅熟期(Red_44DPA)表達(dá)量逐漸增強(qiáng)，而SlHSP17.7A 在果實(shí)綠熟期后一直處于較高的表達(dá)水平。在果實(shí)的外果皮和種子部位SlHSP17.7A、SlHSP17.6A、SlHSP17.6B 和SlHSP17.6C 隨著果實(shí)的發(fā)育和成熟表達(dá)量也隨之增強(qiáng)，其中SlHSP17.6A 較其他3 個(gè)基因的表達(dá)要弱。相比較而言，SlHSP17.7A 在果實(shí)中的表達(dá)量相對于SlHSP17.6A，SlHSP17.6B，SlHSP17.6C 明顯提高，其中在綠果期中SlHSP17.7A 的表達(dá)量是SlHSP17.6A 的表達(dá)量的20 倍。

圖5 SlHSP20 基因簇在番茄生長發(fā)育中的表達(dá)分析Figure 5 Expression analysis of SlHSP20 gene cluster in tomato

根據(jù)基因表達(dá)的相似性分析基因表達(dá)產(chǎn)物可能的相互作用關(guān)系，了解基因間相互作用網(wǎng)絡(luò)，利用轉(zhuǎn)錄組綜合分析在線網(wǎng)站(http://tomexpress.toulouse.inra.fr/query)信息，分析SlHSP20 基因簇成員在番茄果實(shí)發(fā)育過程中的共表達(dá)差異 （圖6）。SlHSP20 基因簇4 個(gè)成員在果實(shí)發(fā)育的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中處于不同的作用區(qū)間。其中Solyc06g076570 (SlHSP17.7A) 可能的正相關(guān)互作基因有11 個(gè)，負(fù)相關(guān)互作基因2 個(gè)；Solyc06g076560(SlHSP17.6C)可能的正相關(guān)互作基因有4 個(gè)，負(fù)相關(guān)互作基因1 個(gè)；Solyc06g076540(SlHSP17.6A)可能的正相關(guān)互作基因有1 個(gè)，Solyc06g076520(SlHSP17.6B)可能的負(fù)相關(guān)互作基因有1 個(gè)。研究結(jié)果表明SlHSP20 基因簇成員氨基酸序列雖高度同源，但其結(jié)合的互作基因的蛋白產(chǎn)物卻不同，說明氨基酸的不同可能導(dǎo)致蛋白的空間構(gòu)型改變進(jìn)而影響了其功能的差異。

2.5 激素對番茄果實(shí)SlHSP20基因簇的表達(dá)分析

通過PLANTCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/)在線分析軟件中分析其順式作用元件。結(jié)果表明，SlHSP17.6A、SlHSP17.6B、SlHSP17.6C 和 SlHSP17.7A，這 4 個(gè) SlHSP20 基因的啟動子含有 12 種已知響應(yīng)逆境脅迫的若干相關(guān)作用元件，其中一半以上為響應(yīng)激素相關(guān)的順式作用元件，尤其是參與響應(yīng)脫落酸(ABA)、生長素(IAA)、赤霉素(GA3)、乙烯(ETH)和茉莉酸甲酯(MeJA)。這說明 SlHSP20 在番茄對逆境脅迫的應(yīng)激反應(yīng)中起著重要作用。果實(shí)發(fā)育成熟過程中，生長素、脫落酸等發(fā)揮重要作用。為了探究激素對番茄果實(shí)特異SlHSP20 基因的調(diào)控作用，本研究利用番茄果實(shí)圓片進(jìn)行了激素處理。通過外源施加脫落酸(ABA)、生長素(IAA)、赤霉素(GA3)、乙烯(ETH)、水楊酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)等激素處理，對 4 個(gè)串聯(lián) SlHSP20 基因的表達(dá)變化進(jìn)行分析(圖7)。

結(jié)果表明，在激素處理的綠熟期果實(shí)圓片中，ETH 能夠顯著誘導(dǎo)SlHSP17.6A 的表達(dá)，其表達(dá)量與對照相比增加了近60%；而ABA 可顯著抑制SlHSP17.6A 的表達(dá)，其表達(dá)量下降約6 倍；其他激素處理對SlHSP17.6A的表達(dá)影響不大。SlHSP17.6B 在IAA 和MEJA 處理后表達(dá)受到明顯誘導(dǎo)，其中IAA 處理后SlHSP17.6B 相對表達(dá)量增加約6 倍，MEJA 處理后表達(dá)量增加約3 倍；在ABA 處理后，SlHSP17.6B 表達(dá)量降低63%；而其他激素處理下SlHSP17.6A 的表達(dá)沒有顯著變化。SlHSP17.6C 在ABA、ETH 和SA 處理后表達(dá)量受到明顯抑制，它們分別下降約為96%、81%和91%。SlHSP17.7A 在GA 和IAA 處理后，表達(dá)量顯著升高，分別增加約2.5 倍和6倍；而ABA、ETH 和SA 可顯著抑制SlHSP17.7A 的表達(dá)，受抑制程度分別下降約98%、51%和83%。以上結(jié)果表明，雖然SlHSP20 基因簇成員在序列上高度同源，但在番茄果實(shí)成熟期受激素調(diào)控的表達(dá)形式卻明顯不同。SlHSP20 基因簇能夠響應(yīng)脫落酸、生長素、赤霉素、茉莉酸甲酯、乙烯和水楊酸等激素的調(diào)控，說明其在相關(guān)激素調(diào)控通路上發(fā)揮著重要作用，并且在不同的外源激素處理下基因簇成員展現(xiàn)出明顯的差異性。

2.6 糖對番茄果實(shí)SlHSP20基因簇成員的表達(dá)調(diào)控

課題組前期對番茄的HSP20 基因家族成員的啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)，SlHSP20 基因簇的4 個(gè)成員均含有一定數(shù)量的糖響應(yīng)元件有SURE(糖響應(yīng)元件)和W-box(蔗糖誘導(dǎo)蛋白元件)[5]。因此本研究進(jìn)一步分析外源葡萄糖、果糖和蔗糖處理對番茄綠熟期果實(shí)圓片SlHSP20 基因簇成員的表達(dá)影響。由圖8 可知，綠熟期果糖處理8h后，SlHSP17.6A 表達(dá)量明顯增加，其相對表達(dá)量增加約 2.5 倍，而 SlHSP17.6B，SlHSP17.6C，SlHSP17.7A 均受明顯抑制。在葡萄糖處理后，SlHSP20 基因簇成員的表達(dá)均受到明顯抑制。在蔗糖處理后，SlHSP17.6A 表達(dá)量沒有顯著變化，而SlHSP17.6B，SlHSP17.6C 和SlHSP17.7A 的表達(dá)量也顯著降低。研究結(jié)果表明，雖然基因簇成員具有著高度的同源性，但在對糖的響應(yīng)下基因簇成員表現(xiàn)出明顯不同的基因表達(dá)水平變化。

表4 SlHSP20 基因簇在番茄果實(shí)發(fā)育過程中共表達(dá)基因的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of gene cluster co-expressed SlHSP20 gene cluster during the development of tomato fruit

圖6 SlHSP20 基因簇在番茄果實(shí)發(fā)育過程中的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析Figure 6 Co-expression network analysis and expression of SlHSP20 gene cluster in the development of tomato fruit

圖7 激素對番茄果實(shí)SlHSP20 基因簇的表達(dá)影響Figure 7 Effects of hormones on the expression of SlHSP20 gene cluster in the fruits of tomato

圖8 糖對番茄果實(shí)SlHSP20 基因簇成員的表達(dá)影響（A.果糖;B.葡萄糖;C.蔗糖）Figure 8 Effect of sugar on expression of SlHSP20 gene cluster in tomato fruit(A.Fructose; B.Glucose; C.Sucrose)

3 討論與結(jié)論

本研究CI 類小熱激蛋白(sHSP)定位于番茄第6 條染色體上的無內(nèi)含子的基因簇SlHSP20，屬于低分子質(zhì)量的HSP20 家族。其數(shù)量和細(xì)胞定位的復(fù)雜性是高等植物熱激響應(yīng)的獨(dú)特特征[7,9]。其中基因的復(fù)制轉(zhuǎn)化和倒置被認(rèn)為是不同sHSP 基因起源的主要機(jī)制[7]。到目前為止，所有測序的基因組中都有基因重復(fù)的痕跡，并且基因重復(fù)被看做是導(dǎo)致生物進(jìn)化進(jìn)程復(fù)雜化的依據(jù)[14-16]。根據(jù)番茄數(shù)據(jù)庫Sl4.0 版本對SlHSP20 基因簇4 個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明該基因簇在番茄基因組中以兩兩相反的方向編碼CI 類家族sHSP，其ORF 的長度完全相同，基因串聯(lián)排列。該基因簇具有序列高度相似性的事實(shí)表明他們是通過基因重復(fù)或者倒置而產(chǎn)生的。

對SlHSP20 基因簇中串聯(lián)的4 個(gè)基因的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該基因簇成員均具有保守的ACD 結(jié)構(gòu)，且結(jié)構(gòu)中帶有典型的β-sandwich 結(jié)構(gòu)，這與前人在模式作物擬南芥、水稻的sHSPs 家族成員分布特點(diǎn)相同[10-11]?；虼爻蓡T具有高度同源的cDNA 序列和氨基酸序列，通過系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)SlHSP20 基因簇成員定位于細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核的CI 類亞族。分析番茄SlHSP20 基因簇的進(jìn)化關(guān)系發(fā)現(xiàn)基因簇成員間存在直系同源關(guān)系。這些結(jié)果說明SlHSP20 基因簇成員之間存在著廣泛的同源性和相似性，為深入研究SlHSP20 基因的功能提供了理論基礎(chǔ)。

GOYAL 等[2]曾對該段基因簇中的3 個(gè)基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，但其結(jié)果中3 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄方向相同，這與最新注釋的番茄數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)不符。本研究結(jié)果表明，該基因簇是在番茄基因組第六染色體中以兩兩相反的方向編碼CI 類家族sHSP。因此本研究根據(jù)新的基因注釋轉(zhuǎn)錄方向分析了5’-UTR 側(cè)翼區(qū)域順式作用元件，并利用綠熟期的果實(shí)圓片進(jìn)行了激素處理。結(jié)果表明，SlHSP20 基因簇成員的表達(dá)對激素的響應(yīng)都不同。事實(shí)上，真核生物中基因調(diào)控的主要機(jī)制是轉(zhuǎn)錄的激活，這主要是由于順式調(diào)控元件與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的結(jié)果。因此，在對基因簇成員進(jìn)行啟動子序列的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，在4 個(gè)基因的啟動子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了幾種（脫落酸，乙烯，茉莉酸，水楊酸，赤霉素和各種非生物和生物脅迫以及糖相關(guān)）的調(diào)控元件，這些元件與響應(yīng)不同的脅迫誘導(dǎo)和影響基因表達(dá)有關(guān)[5,17]?；虻墓脖磉_(dá)分析網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果也表明，SlHSP20 基因簇成員的可能互作蛋白亦不同。SlHSP17.6A 互作的Solyc04g070990 編碼PHD-finger 蛋白，是一類在基因轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)狀態(tài)調(diào)控方面有重要作用的鋅指蛋白[17]。與SlHSP17.6B 互作的Solyc02g081400、Solyc03g043850、Solyc06g062690 的基因分別編碼胞內(nèi)蛋白酶PfpI 家族蛋白、細(xì)胞色素c 氧化酶亞基VIa 家族蛋白、核小體組裝蛋白等，主要作為伴侶蛋白和抗氧化因子等發(fā)揮作用。而與SlHSP17.6C 互作的可能基因產(chǎn)物類別更為廣泛，包括Solyc03g111010(編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、Solyc00g005050（編碼阿拉伯乳聚糖糖蛋白）、Solyc02g093490（編碼SAGA-相關(guān)因子）等多條途徑發(fā)揮作用。這說明高度同源的SlHSP20 基因簇成員，其在植物體中的功能或參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能也存在不同。但對于SlHSP20 基因簇成員的功能尚需通過基因編輯等手段進(jìn)行深入的研究。