李慧峰，冉 昆，王 濤

（山東省果樹研究所，山東 泰安271000）

山東蘋果屬植物資源豐富，除少數(shù)野生種外，大部分為栽培種，種間雜種較多，類型多樣，變異幅度大[1]，種質(zhì)資源鑒定工作難度較大。目前蘋果屬植物的分類鑒定主要基于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法，此方法對(duì)鑒定人員素質(zhì)要求較高，需要有豐富的植物學(xué)知識(shí)及嚴(yán)格的實(shí)踐訓(xùn)練[2]，所以限制了蘋果屬植物資源分類工作的開展。隨著分子技術(shù)發(fā)展，在DNA 水平上建立高效、準(zhǔn)確的鑒定方法已成為可能，其中分子標(biāo)記技術(shù)便是重要手段之一。

SRAP(sequence related amplified polymorphism) 標(biāo)記以獨(dú)特的雙引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增基因的開放式閱讀框特定區(qū)域，是基于不同個(gè)體DNA 序列的啟動(dòng)子、內(nèi)含子、間隔區(qū)長度的差異而表現(xiàn)出多樣性的顯性分子標(biāo)記，相對(duì)于其他分子標(biāo)記更容易得到選擇序列條帶，已被廣泛應(yīng)用于新疆石榴[3]、山楂[4]、梨[5]、新疆野蘋果[6]、柑橘[7]、枇杷[8]、桃[9]等果樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系、指紋圖譜等方面研究，并取得良好的效果。關(guān)于蘋果屬植物遺傳多樣性研究多基于SSR 標(biāo)記技術(shù)[10-11]，鮮見利用SRAP 標(biāo)記在構(gòu)建地方蘋果屬植物指紋圖譜的報(bào)道。針對(duì)山東的地方蘋果屬植物資源分類研究相對(duì)滯后的現(xiàn)狀，本研究選取59 份地方蘋果資源，利用SRAP 技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析，構(gòu)建指紋圖譜，旨在為山東省蘋果屬植物資源鑒定及數(shù)據(jù)平臺(tái)開發(fā)提供基礎(chǔ)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

2018～2019 年試驗(yàn)在國家蘋果工程技術(shù)中心進(jìn)行。供試的59 份資源取自于山東省果樹研究所蘋果資源圃（表1）。每份資源取幼嫩葉3～4 片，混合后用錫箔紙包好，置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，液氮冷凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 供試材料基因組DNA 提取 采用改良CTAB 法[12]提取基因組DNA，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用紫外吸收法檢測(cè)DNA 濃度并稀釋成50 ng·μL-1，貯存于-20℃冰箱中備用。

1.2.2 SRAP-PCR 采用LI 等[13]發(fā)表的引物，由青島派森諾基因生物技術(shù)有限公司合成（表2）。正向引物15條，反向引物16 條，組合得到240 對(duì)引物。隨機(jī)選用5 號(hào)、9 號(hào)、55 號(hào)3 份樣品進(jìn)行引物篩選，共選出擴(kuò)增條帶清晰、豐富、穩(wěn)定的25 對(duì)引物組合用于后續(xù)試驗(yàn)。PCR 體系和擴(kuò)增產(chǎn)物的純化體系參照李秀等[14]建立的體系，略有改動(dòng)。取擴(kuò)增產(chǎn)物10μL 進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)以2000 bp DNA Ladder Marker 作為分子量標(biāo)記，100V 恒壓電泳40～60 min，通過紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)電泳膠圖進(jìn)行人工讀帶，對(duì)擴(kuò)增條帶按有（1）或無（0）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，建立二元數(shù)據(jù)矩陣。統(tǒng)計(jì)多態(tài)性條帶數(shù)、總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶比率P（Percentage of polymorphic sites）。利用Botstein 公式計(jì)算多態(tài)性信息含量（PIC）；利用 POPGENE version 1.32 軟件計(jì)算觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s 遺傳多樣性指數(shù)（H）和Shannon 信息指數(shù)（I），運(yùn)用NTSYS pc version 2.10e 軟件進(jìn)行聚類分析（UPGMA 法）和構(gòu)建聚類圖，計(jì)算遺傳距離（GD）及遺傳相似系數(shù)（GS）。從25 對(duì)引物組合擴(kuò)增的圖譜中篩選出多態(tài)性好、清晰、鑒別效率高的圖譜，構(gòu)建59 份蘋果種質(zhì)資源數(shù)字指紋圖譜，根據(jù)指紋圖譜出現(xiàn)的概率公式P＝1/2n，計(jì)算圖譜的置信概率。

表1 供試的59 份蘋果資源Table 1 Material of 59 Malus germplasm

表2 SRAP 引物序列Table 2 The sequence information of SRAP primers

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性

PIC 值是衡量引物合適程度的重要指標(biāo)，可以反映引物揭示信息量的多少，PIC 值越高代表包含的信息量越大，當(dāng)PIC＞0.5 時(shí)，引物為高度多態(tài)性信息引物[2]。在組合的240 對(duì)引物中，有25 對(duì)能擴(kuò)增出較多特異性條帶且條帶清晰，同時(shí)檢測(cè)到的 PIC 值為0.5201～0.9510，表明這 25對(duì)引物均為高度多態(tài)性信息引物，可以用于蘋果資源遺傳多樣性研究。圖1 為引物Me10～Em4對(duì)59 份供試材料的SRAP-PCR 擴(kuò)增圖譜。

利用25 對(duì)引物對(duì)59 份蘋果資源進(jìn)行SRAP擴(kuò)增，共擴(kuò)增出176 條清晰條帶，DNA 片段長度在 100～2 000 bp；不同引物的擴(kuò)增帶數(shù)從 4～10 條不等，引物Me5-Em3 擴(kuò)增的條帶最多，為10 條，平均每對(duì)引物獲得DNA 譜帶7.04 條；在176 條擴(kuò)增帶中，多態(tài)性條帶158 條，多態(tài)性比率為89.77%（表3），表明供試資源具有較高的遺傳多樣性。

2.2 聚類分析

59 份樣品間存在不同程度的遺傳差異，呈現(xiàn)出較為豐富的遺傳多樣性。聚類結(jié)果顯示，樣品間的相似性系數(shù)為0.6540～0.9829，平均為0.7060。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.7010 時(shí)，59 份供試蘋果材料可以分為3 大類群（圖3）：第Ⅰ類群僅包括1 份資源，其為產(chǎn)于泰山極頂?shù)奶┥胶Ｌ?，說明泰山海棠與其他資源的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；第Ⅱ類群包括 29 份資源，在相似系數(shù)為 0.7480 處，可以進(jìn)一步劃分為 IIa、IIb、IIc、IId 和 IIe 共 5 個(gè)亞類，以海棠、楸子等類型為主，包括少量的花紅（M.asiatica）類型；第Ⅲ類群也包括29 份資源，在相似系數(shù)為0.7480 處，可將其分為Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc、Ⅲd、Ⅲe、Ⅲf、Ⅲg 和Ⅲh 共 8 個(gè)亞類。Ⅲa 亞類包括 5 份蘋果資源和 1 份大果型花紅（M.asiatica）資源，其中1 號(hào)資源與30 號(hào)資源親緣關(guān)系最近，因二者為芽變關(guān)系。Ⅲb 亞類包括3 份花紅資源和1 份大果型海棠。其余亞類群主要是花紅資源、海棠和楸子資源。聚類結(jié)果顯示，位于Ⅲc 亞類的中國綿蘋果3 號(hào)資源花彩和4 號(hào)資源紅彩聚在一起，表明二者親緣關(guān)系很近。

圖1 引物Me10-Em4 對(duì)59 份材料的電泳圖譜Figure 1 The electrophoretogram of 59 samples amplified by primer Me10-Em4

表3 SRAP 引物組合和擴(kuò)增結(jié)果Table 3 Results and polymorphism of SRAP primer combinations

圖3 基于SRAP 標(biāo)記的59 份蘋果材料的UPGMA 聚類圖Figure 3 UPGMA dendrogram of 59 samples based on SRAP marker

2.3 指紋圖譜

從25 對(duì)引物組合擴(kuò)增的譜帶中，篩選出了多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的48 條譜帶，使之?dāng)?shù)字化，構(gòu)建的59 份山東地方蘋果屬植物指紋圖譜（圖4）。根據(jù)P=1/2n可知，帶型全部相同的概率為3.55×10-25，置信概率達(dá)99.99%。

圖4 SRAP 標(biāo)記構(gòu)建的59 份蘋果資源指紋圖譜Figure 4 Molecular finger printing of 59 Malus germplasms set up by SRAP marker

3 討論與結(jié)論

SRAP 標(biāo)記具有簡(jiǎn)便、高現(xiàn)共顯性、易得到分離條帶、高產(chǎn)率等優(yōu)點(diǎn)，在遺傳育種學(xué)領(lǐng)域已有廣泛的應(yīng)用[15]，是一個(gè)評(píng)價(jià)遺傳多樣性、品種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育的有效工具[16]。另外，SRAP 標(biāo)記與RAPD 標(biāo)記相比，其引物數(shù)量雖少，但由于SRAP 標(biāo)記正、反向引物具有通用性，所以引物的利用率非常高；與AFLP 相比，沒有酶切、連接與擴(kuò)增雜交等繁雜步驟；與其他一些分子標(biāo)記技術(shù)相比，SRAP 標(biāo)記引物設(shè)計(jì)較容易、操作方便[17]。因此，SRAP 分子標(biāo)記優(yōu)勢(shì)更突出。本試驗(yàn)結(jié)果顯示25 對(duì)多態(tài)性引物共擴(kuò)增出DNA 條帶176 條，其中多態(tài)性條帶158 條，在PPB 方面，有9 對(duì)引物組合基因組擴(kuò)增條帶的多樣性達(dá)到了100%，多態(tài)性比率為89.77%，說明SRAP 標(biāo)記在蘋果屬植物基因組中具有豐富的多態(tài)性。Ne、H、I 作為SRAP 引物多態(tài)性評(píng)價(jià)的重要參數(shù)，在本研究中表現(xiàn)良好，其平均值分別達(dá)到了1.49、0.28 和0.43。作為評(píng)價(jià)分子標(biāo)記多態(tài)性的重要指標(biāo)，本研究中的PIC 均值為0.88，遠(yuǎn)大于0.5，說明本研究篩選所得的引物組合為高度多態(tài)性信息引物，綜合評(píng)價(jià)認(rèn)為SRAP 標(biāo)記在蘋果屬植物種質(zhì)中具有較高的鑒別能力，更能提供種質(zhì)差異的遺傳信息。

根據(jù)UPGMA 聚類分析結(jié)果，選取遺傳相似系數(shù)0.7010 進(jìn)行分類，59 份供試蘋果材料可以分為3 大類群。第Ⅰ類群為原產(chǎn)山東的野生資源泰山海棠，第Ⅱ大類群以海棠和楸子為主，含有少量的小果型花紅，第Ⅲ大類群主要以蘋果、花紅為主，含有少量的海棠和楸子。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.7480 時(shí)，第Ⅱ大類群、第Ⅲ大類群又分別可以劃分出若干小的類群，蘋果（M.domestica）聚在一起，中國綿蘋果（M.domestica subsp.chinesis）、大部分的花紅（M.asiatica）聚在一起，大部分的海棠（M.micromalus）與楸子（M.prunifolia）交互聚在一起，聚類結(jié)果總體上與李育農(nóng)[18]蘋果屬植物分類標(biāo)準(zhǔn)相一致。少量的花紅（M.asiatica）以及海棠（M.micromalus）、楸子（M.prunifolia）沒有完全區(qū)分開來，可能主要因?yàn)檫@些栽培種均形成于種間雜交，遺傳背景較為復(fù)雜所致。

本研究中采用了25 對(duì)引物組合的方式來鑒定供試樣品，有效的克服了單一引物擴(kuò)增出的特征條帶少、鑒別效率低的問題，有效的將所有樣品進(jìn)行了區(qū)分。建立的指紋圖譜，置信率達(dá)99.99%，進(jìn)一步表明利用SRAP標(biāo)記在鑒別親緣關(guān)系復(fù)雜蘋果屬植物資源過程中具有高效性。種質(zhì)資源是果樹品種選育重要基因源。但是，我國蘋果育種領(lǐng)域普遍存在育種目標(biāo)單一、核心親本被反復(fù)使用、育種材料間的親緣關(guān)系較近、遺傳背景狹窄等嚴(yán)重問題，導(dǎo)致我國一直缺乏具有國際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的品種。面對(duì)現(xiàn)代育種的新形勢(shì)，采用地理遠(yuǎn)緣、親緣關(guān)系遠(yuǎn)緣的親本進(jìn)行雜交已經(jīng)成為業(yè)界共識(shí)，因此全力保護(hù)地方資源、充分挖掘地方資源的遺傳潛力，將會(huì)是一項(xiàng)十分重要的基礎(chǔ)工作。但是，由于種種原因，山東地方資源正在遭受嚴(yán)重破壞，資源損失嚴(yán)重，據(jù)資料顯示[19]，僅2011～2014 年山東沂水崔家峪蘋果資源就由12 份減少到2 份，其他地區(qū)情況也不容樂觀。因此，采用現(xiàn)代技術(shù)盡快建立蘋果資源有效鑒定技術(shù)體系，為保護(hù)地方資源提供技術(shù)支撐，已刻不容緩。