張意笠,程汝濱,黃 真,余水生,周樟平,鐘曉明,*

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,浙江杭州 310053;2.浙江九龍山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局,浙江遂昌 323300;3.遂昌縣科技局,浙江遂昌 323300)

結(jié)香(EdgeworthiachrysanthaLindl.)為瑞香科結(jié)香屬落葉灌木,主要分布于長(zhǎng)江流域以南以及河南、陜西等地[1]。據(jù)《藥用植物辭典》記載[2],結(jié)香的花蕾、根、莖皮均可入藥。結(jié)香花為結(jié)香的花蕾,別名打結(jié)花、金腰袋、夢(mèng)冬花等[1],具有養(yǎng)陰、安神、明目、祛障翳等功效。研究表明,結(jié)香花含有豐富的香豆素類、黃酮類、有機(jī)酸和甾體等化合物[3-5]。

近年來(lái),隨著人們對(duì)“綠色消費(fèi)”、“回歸自然”理念的重視,大眾對(duì)含有植物提取物產(chǎn)品的認(rèn)可度不斷提升,天然植物提取物的商業(yè)價(jià)值越來(lái)越高,國(guó)際上對(duì)植物提取物的需求量也越來(lái)越大[6-7]。黃酮類化合物作為一種多羥基酚類物質(zhì)的次生代謝產(chǎn)物,普遍存在于自然界中。植物黃酮類化合物具有廣泛的藥理活性,已在許多行業(yè)得到廣泛應(yīng)用[8-9]。目前提取結(jié)香花中黃酮類物質(zhì)的工藝主要有回流提取法、超聲波提取法、超臨界流體萃取法[10]等。徐玲[11]通過(guò)比較回流提取法、超聲波提取法和閃式提取法三種方法,結(jié)果顯示回流提取法操作簡(jiǎn)單且得率較高,通過(guò)正交試驗(yàn)得到最優(yōu)工藝下的黃酮得率為7.2 mg·g-1。但響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)香花總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究未見(jiàn)報(bào)道。

因此,為促進(jìn)結(jié)香花資源的開(kāi)發(fā)利用和深入研究,本研究以結(jié)香花為原料,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)Box-Behnken法優(yōu)化結(jié)香花中總黃酮的提取工藝,并從其清除DPPH自由基、ABTS自由基的能力初步研究結(jié)香花總黃酮抗氧化活性,旨在為更好地開(kāi)發(fā)利用結(jié)香花資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

結(jié)香花 采自浙江省麗水市遂昌縣高坪鎮(zhèn),經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源研究所陳孔榮副教授鑒定為瑞香科結(jié)香屬結(jié)香EdgeworthiachrysanthaLindl的花蕾;蘆丁對(duì)照品 上海源葉生物科技有限公司,批號(hào):T27F10Z81699;1,1-苯基-2-苦肼基自由基(DPPH) 上海源葉生物科技有限公司,批號(hào):W27F10E81251;2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) 酷爾化學(xué),批號(hào):54C1201V;L-抗壞血酸(VC) Sigma,批號(hào):WXBB4747V;無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、過(guò)硫酸鉀 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DZF數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;AL104電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海榮亞生化儀器廠;HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海宜昌儀器紗篩廠;UV-1800型紫外分光光度計(jì) 日本島津。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 結(jié)香花總黃酮的提取 結(jié)香花在60 ℃恒溫干燥箱中干燥至恒重,粉碎,過(guò)50目篩,得樣品粉末。稱取1.00 g,在一定的乙醇濃度、液料比、提取溫度和提取時(shí)間的條件下進(jìn)行回流提取,然后將得到的提取液抽濾,定容至50 mL容量瓶,備用。

1.2.2 總黃酮的測(cè)定

1.2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考文獻(xiàn)[12]并加以修改,精密稱取蘆丁對(duì)照品25.0 mg,加70%乙醇定容至25 mL容量瓶,搖勻,即得1.0 mg·mL-1對(duì)照品溶液。精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL對(duì)照品溶液于25 mL比色管中,各加水至6 mL,分別加入5% NaNO2溶液1 mL,混勻后靜置6 min,加10% Al(NO3)3溶液1 mL,混勻后靜置6 min,再加4% NaOH溶液10 mL,加水至刻度,混勻,靜置15 min,于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)。以吸光度(A)對(duì)蘆丁質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行回歸,得到回歸方程為A=0.2738X-0.0032(R2=0.9993)在0.02～0.12 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.2.2.2 結(jié)香花總黃酮的測(cè)定 準(zhǔn)確量取樣品溶液4.0 mL于25 mL比色管中,按照“1.2.2.1”中所述方法進(jìn)行操作,按下式計(jì)算總黃酮得率。

式中,Y為總黃酮得率(mg·g-1),C為結(jié)香花總黃酮的質(zhì)量濃度(mg·mL-1),V為測(cè)量總黃酮提取液體積(mL),N為稀釋倍數(shù),M為稱量的結(jié)香花干品質(zhì)量(mg)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響 固定液料比20∶1,提取溫度60 ℃,提取時(shí)間60 min,考察乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.3.2 液料比對(duì)總黃酮得率的影響 固定乙醇濃度80%,提取溫度60 ℃,提取時(shí)間60 min,考察液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.3.3 提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響 固定乙醇濃度80%,液料比30∶1,提取時(shí)間60 min,考察提取溫度50、60、70、80、90 ℃對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.3.4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 固定乙醇濃度80%,液料比30∶1,提取溫度80 ℃,考察提取時(shí)間30、60、90、120、150 min對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取溫度(C)、提取時(shí)間(D)作為影響因素,總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)(Y),應(yīng)用Box-Behnken中心組合進(jìn)行4因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.2.5 結(jié)香花總黃酮抗氧化活性的測(cè)定

1.2.5.1 DPPH自由基清除率測(cè)定 參考文獻(xiàn)[13]并加以修改,將最佳工藝條件下得到結(jié)香花總黃酮溶液配制成0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mg·mL-1質(zhì)量濃度的樣品溶液。取1 mL樣品溶液,加入5 mL 0.06 mmol·L-1DPPH乙醇溶液,充分混勻,在室溫下避光反應(yīng)30 min,于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。并以L-抗壞血酸(VC)作為陽(yáng)性對(duì)照(濃度為0.01、0.02、0.04 mg·mL-1),按以下公式計(jì)算清除率。

式中,A0為1 mL蒸餾水+5 mL DPPH乙醇溶液的吸光度;A1為1 mL樣品+5 mL DPPH乙醇溶液的吸光度;A2為1 mL樣品+5 mL無(wú)水乙醇的吸光度。

1.2.5.2 ABTS自由基清除率測(cè)定 參考文獻(xiàn)方法[14]并改進(jìn),將7 mmol·L-1的ABTS溶液與2.45 mmol·L-1的過(guò)硫酸鉀溶液1∶1混合均勻,在室溫避光的條件下靜置過(guò)夜,制成ABTS貯備液。在12～16 h之內(nèi)測(cè)定,測(cè)定時(shí)用蒸餾水稀釋,使其在734 nm波長(zhǎng)下的A值為0.700±0.020。

將最佳工藝條件下得到結(jié)香花總黃酮溶液配制成0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mg·mL-1質(zhì)量濃度的樣品溶液。取0.1 mL樣品溶液,加入3.9 mL ABTS貯備液,充分混勻,在室溫下避光反應(yīng)10 min,于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以L-抗壞血酸(VC)作為陽(yáng)性對(duì)照(濃度為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.20 mg·mL-1),按以下公式計(jì)算清除率。

式中,A0為0.1 mL蒸餾水+3.9 mL ABTS自由基工作液的吸光度;A1為0.1 mL樣品+3.9 mL ABTS自由基工作液的吸光度;A2為0.1 mL樣品+3.9 mL蒸餾水的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)平行測(cè)定3次,運(yùn)用響應(yīng)面分析軟件Design Expert 8.0.6及GraphPad Prism 7.0進(jìn)行相關(guān)圖表的繪制以及數(shù)據(jù)的處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度的影響 由圖1可知,總黃酮得率隨著乙醇濃度增大先升后降,并在乙醇濃度80%時(shí)達(dá)到最大值。這與錢(qián)慧琴等[15]的研究報(bào)道中乙醇濃度對(duì)于總黃酮得率影響的變化趨勢(shì)一致。這可能是因?yàn)橐掖紳舛葹?0%時(shí),結(jié)香花黃酮類物質(zhì)的溶出趨于飽和,隨著乙醇濃度增加,提取溶劑的極性相對(duì)降低,促進(jìn)結(jié)香花中極性小的成分溶出,從而使得總黃酮得率下降。因此選擇乙醇濃度70%～90%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)結(jié)香花總黃酮得率的影響

2.1.2 液料比的影響 由圖2可知,總黃酮得率隨著液料比的增大先升后略有下降,并在液料比30∶1時(shí)達(dá)到最大值。這與王慧芳等[16]研究中的液料比對(duì)總黃酮得率影響的研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)殡S著液料比的增大,增加了溶質(zhì)與溶劑的接觸面積,有利于黃酮類物質(zhì)溶出;當(dāng)液料比為30∶1時(shí),黃酮類化合物的溶出逐漸趨于平穩(wěn);繼續(xù)增加液料比,非黃酮類雜質(zhì)溶出增多且還會(huì)造成資源的浪費(fèi)。因此,選擇液料比20∶1～40∶1進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 液料比對(duì)結(jié)香花總黃酮得率的影響

2.1.3 提取溫度的影響 由圖3可知,總黃酮得率隨著溫度的升高先升后下降,并在提取溫度80 ℃時(shí)達(dá)到最大值。這與秦晶晶等[17]的研究報(bào)道中提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響的變化趨勢(shì)一致。當(dāng)溫度升高,分子的熱運(yùn)動(dòng)加劇,總黃酮的溶出越多,得率越高。當(dāng)溫度升高到一定程度后,黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)遭到破壞,使得率有所下降。因此選擇提取溫度70～90 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 提取溫度對(duì)結(jié)香花總黃酮得率的影響

2.1.4 提取時(shí)間的影響 由圖4可知,總黃酮得率隨著時(shí)間的增加先升后下降,并在提取時(shí)間90 min時(shí)達(dá)到最大值,這表明在90 min時(shí)總黃酮已提取完全,隨著提取時(shí)間增長(zhǎng),可能會(huì)使一些熱不穩(wěn)定成分在長(zhǎng)時(shí)間提取中遭到破壞,導(dǎo)致總黃酮得率下降。因此選擇提取時(shí)間60～120 min進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 提取時(shí)間對(duì)結(jié)香花總黃酮得率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以乙醇濃度、液料比、提取溫度和提取時(shí)間為自變量,以總黃酮得率為響應(yīng)值,采用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)4因素3水平,結(jié)果見(jiàn)表2,得到總黃酮得率關(guān)于乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取溫度(C)和提取時(shí)間(D)的二階多項(xiàng)式方程:

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Y=22.57-0.10A+1.44B+0.5C-0.23D+0.30AB+1.94AC+0.60AD+0.64BC-0.43BD-0.84CD-1.80A2-1.66B2-1.97C2-2.24D2

表3 方差分析

2.2.3 交互作用分析 為評(píng)價(jià)兩兩交互作用對(duì)總黃酮得率的影響并確定各因素的最佳水平范圍,分別繪制各因素交互作用影響的響應(yīng)曲面,如圖5。響應(yīng)曲面的形狀反映了兩因素的交互效應(yīng),曲面走勢(shì)越陡峭,表明兩因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著[18-19]。由圖5可知,乙醇濃度和提取溫度(圖5B),液料比和提取溫度(圖5D)以及提取溫度和提取時(shí)間(圖5F)兩者交互作用顯著,表現(xiàn)為響應(yīng)面曲線走勢(shì)陡峭。

圖5 各因素對(duì)總黃酮得率的3D響應(yīng)面圖

2.2.4 最佳條件預(yù)測(cè)及驗(yàn)證試驗(yàn) 響應(yīng)面結(jié)果分析可知,最佳提取條件為乙醇濃度81.68%,液料比35.29∶1,提取溫度83.25 ℃,提取時(shí)間85.74 min,預(yù)測(cè)總黃酮得率為23.04 mg·g-1?？紤]到實(shí)際操作,最終將其確定為乙醇濃度80%,液料比35∶1,提取溫度83 ℃,提取時(shí)間85 min。此條件下對(duì)建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),獲得的結(jié)香花總黃酮得率的實(shí)際測(cè)得值為22.76±0.03 mg·g-1,預(yù)測(cè)值為23.04 mg·g-1,誤差為1.23%,小于3%,因此證實(shí)了預(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確可靠。

2.3 抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 DPPH自由基清除率 由圖6可知,當(dāng)結(jié)香花總黃酮質(zhì)量濃度在0.20～2.00 mg·mL-1范圍內(nèi),對(duì)DPPH自由基的清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而增大,且兩者存在一定的量效關(guān)系。經(jīng)Graphpad Prism 7計(jì)算得結(jié)香花總黃酮提取物和VC對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50值分別為0.75 mg·mL-1、12.21 μg·mL-1。由此可見(jiàn),結(jié)香花總黃酮對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力,但與VC相比能力較弱。

圖6 結(jié)香花總黃酮和VC的DPPH自由基清除能力

2.3.2 ABTS自由基清除率 由圖7可知,當(dāng)結(jié)香花總黃酮質(zhì)量濃度在0.20～2.00 mg·mL-1范圍內(nèi),對(duì)ABTS自由基的清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而增大,且兩者存在一定的量效關(guān)系。經(jīng)Graphpad Prism 7計(jì)算得結(jié)香花總黃酮提取物和VC對(duì)ABTS自由基的半數(shù)清除率IC50值分別為0.98 mg·mL-1、61.12 μg·mL-1。由此可見(jiàn),結(jié)香花總黃酮對(duì)ABTS自由基具有一定的清除能力,但與VC相比能力較弱。

圖7 結(jié)香花總黃酮和VC的ABTS自由基清除能力

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面法建立結(jié)香花總黃酮提取工藝的回歸方程,得到最佳提取條件為:乙醇濃度80%,液料比35∶1,提取溫度83 ℃,提取時(shí)間85 min,此條件下,結(jié)香花總黃酮得率為22.76±0.03 mg·g-1,相比徐玲[11]在正交工藝優(yōu)化下的得率7.2 mg·g-1有了明顯的提升。體外抗氧化活性研究表明,結(jié)香花總黃酮對(duì)DPPH和ABTS自由基具有一定清除能力。本研究可為結(jié)香花總黃酮的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供有效支持,為其在食品、藥品、保健品等領(lǐng)域開(kāi)發(fā)天然抗氧化劑提供一定的理論依據(jù)。韓佳[20]研究也發(fā)現(xiàn),結(jié)香花提取物的萃取部位均具有不同的抗氧化活性,其中乙酸乙酯萃取物的鐵還原能力最強(qiáng),氯仿萃取物的清除超氧陰離子自由基能力最強(qiáng),石油醚萃取物的清除羥基自由基和亞硝酸鹽的能力最強(qiáng)。目前遂昌地區(qū)的結(jié)香以干花作為藥用,主要銷(xiāo)往安徽亳州等藥材市場(chǎng),加工成品以及深度開(kāi)發(fā)少,其價(jià)格波動(dòng)較大,經(jīng)濟(jì)附加值不高。因此加強(qiáng)結(jié)香花的基礎(chǔ)研究工作,優(yōu)化其提取的工藝和方法,開(kāi)發(fā)以結(jié)香花及其提取物為主的系列產(chǎn)品,可拓寬結(jié)香在食品、保健品以及化妝品方面應(yīng)用,推進(jìn)結(jié)香花產(chǎn)品化,有助于遂昌地區(qū)結(jié)香資源的可持續(xù)發(fā)展,打造健康養(yǎng)生農(nóng)業(yè),建立產(chǎn)業(yè)綜合體[21]。