朱平平,單 楊,2,3,4,*,夏金蘭,聶珍媛

(1.湖南大學(xué)研究生院隆平分院,湖南長沙 410125;2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,湖南長沙 410125;3.湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,湖南長沙 410125;4.果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南長沙 410125;5.中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院,湖南長沙 410083)

我國是世界上柑橘第一生產(chǎn)大國,2017年全國柑橘總產(chǎn)量高達(dá) 3.8×107t,并且呈逐年遞增趨勢[1-2],柑橘工業(yè)涉及到全國19個省(市、區(qū))100多個柑橘大縣[3]。柑橘類水果果肉甘醇多汁,糖類、有機(jī)酸、維生素、蛋白質(zhì)等成分含量較為豐富[4-5]。有機(jī)酸具有抗菌活性,檸檬酸有助于人體對鈣和磷的吸收,柑橘含有的氨基酸種類比較齊全,并可以調(diào)節(jié)身體各項(xiàng)指標(biāo)的非蛋白質(zhì)氨基酸[6-9]。柑橘不僅具有美容養(yǎng)顏的功效,還具有改善睡眠、抗過敏、預(yù)防腫瘤等醫(yī)用價值[10-11],受到廣大消費(fèi)者的青睞。全球柑橘貿(mào)易以加工制品為主,加工量占年產(chǎn)量的42%以上,基本為柑橘果汁。我國柑橘主要以初級產(chǎn)品在國內(nèi)鮮銷,柑橘果汁發(fā)展相對滯后,橙汁消費(fèi)量的80%以上依賴進(jìn)口,占我國進(jìn)口果汁總量及總額的70%以上[12]。柑橘屬水果副產(chǎn)品生產(chǎn)過程中,產(chǎn)生的苦味導(dǎo)致口感不佳,對產(chǎn)品購買率產(chǎn)生了極大的負(fù)面影響,嚴(yán)重制約著我國柑橘加工業(yè)的發(fā)展。

柑橘類水果副產(chǎn)品產(chǎn)生苦味主要由兩大類化合物造成,一類是類黃酮化合物,以柚皮苷為主；一類是三萜類化合物的衍生物,主要是檸檬苦素類似物。檸檬苦素是主要存在于柑橘屬水果種子里的一類三萜類化合物[13-14],在1841年,首次從柑橘中分離提取出來[15-18]。檸檬苦素的苦味閾值在水溶液中為1.0 mg/L,在果汁中為3.4 mg/L,近似于柚皮苷苦味閾值20倍,雖然檸檬苦素與柚皮苷相比含量相對較少,但苦味較濃[19]。

目前,國內(nèi)外學(xué)者針對檸檬苦素的脫苦方法進(jìn)行了大量的研究,主要的方法有膜分離脫苦、超臨界CO2脫苦、自然脫苦、酶法脫苦等[20]。雖然現(xiàn)行的脫苦方法有很多,生物脫苦法卻是當(dāng)前改善問題的首選方法,其中酶法脫苦具有針對性強(qiáng)、成效好、對風(fēng)味和營養(yǎng)成分無損壞等優(yōu)點(diǎn),所以酶法脫苦是目前最有應(yīng)用前景的方法。但酶法脫苦相關(guān)研究工作較少,存在高效菌株缺乏、成本高、效率低等問題。本實(shí)驗(yàn)將通過傳統(tǒng)的篩選方法選育出高效降解檸檬苦素的菌株,用響應(yīng)面法優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件,豐富酶法脫苦的研究,解決柑橘果汁的脫苦問題,為柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

多年生的橘園泥土 取自湖南省張家界市永順縣和湖南省郴州市宜章縣;2種醋醅 山西陳醋廠的熏醅發(fā)酵時期和酒精發(fā)酵時期;檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%) 北京索萊寶生物科技有限公司;檸檬苦素(純度≥98%) 上海源葉生物有限公司;濃硫酸(純度≥98%) 國家集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;細(xì)菌基因組DNA試劑盒 天根生化科技(長沙)有限公司。

CBV-1500A型超凈工作臺 上海瑞仰凈化裝備有限公司;HZ-9612K型高溫培養(yǎng)搖床 常州百翔實(shí)驗(yàn)儀器廠;ZHWY-1112B型恒溫培養(yǎng)搖床 上海智誠儀器公司;FA2004電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C pH計 儀電科學(xué)儀器;5804R型臺式離心機(jī) 艾本德中國有限公司;Ultra-670型紫外可見光分光光度計 上海翱藝儀器有限公司;S1000 PCR儀 美國Bio-rad公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司;DYY-12型穩(wěn)壓恒流水平電泳儀 北京市六一儀器廠;GelDocXR+凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-rad公司;9050隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的種類

1.2.1.1 馴化液體培養(yǎng)基 NH4NO315 g、K2HPO410 g、Na2SO41 g、KCl 5 g、NaCl 1 g、酵母粉1 g、檸檬苦素100 mg、蒸餾水1 L(檸檬苦素含量100 mg/L)[21]。

1.2.1.2 選擇性液體培養(yǎng)基 NH4NO315 g、K2HPO410 g、Na2SO41 g、KCl 5 g、NaCl 1 g、檸檬苦素100 mg、蒸餾水1 L(檸檬苦素含量100 mg/L)[21]。

1.2.1.3 選擇性固體培養(yǎng)基 NH4NO315 g、K2HPO410 g、Na2SO41 g、KCl 5 g、NaCl 1 g、檸檬苦素100 mg、瓊脂20 g、蒸餾水1 L(檸檬苦素含量100 mg/L)[21]。

1.2.1.4 LB液體培養(yǎng) 基酵母粉提取物5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 L[21]。

1.2.2 檸檬苦素降解菌的分離 在超凈工作臺下,將拿到的土壤樣品和醋醅樣品1000 r/min離心5 min,去泥土和雜質(zhì),收集上清菌液,8000 r/min離心10 min收集菌斑,接種于250 mL錐形瓶中(含有100 mL馴化液體培養(yǎng)基),濃度為2×109CFU/mL,在35 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)36 h后,重新接種于新的馴化培養(yǎng)基,濃度為2×109CFU/mL,繼續(xù)在35 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)36 h。將馴化得到的菌液于4 ℃、8000 r/min離心10 min,再接種到250 mL錐形瓶中(含有100 mL選擇性液體培養(yǎng)基),在35 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)12 h,取0.1 mL上清液涂布于選擇性固體培養(yǎng)基表面,繼續(xù)放在35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)36 h后,觀察培養(yǎng)皿上長出的不同菌落,再用平板劃線法分離進(jìn)行純化培養(yǎng),直到獲得純菌種,4 ℃斜面保存。

1.2.3 檸檬苦素含量的測定

1.2.3.1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 顯色試劑A液:將濃硫酸65 mL、無水乙醇35 mL混合作為貯備酸液用,將125 mg DMAB溶解100 mL貯備酸液即得到DMAB指示劑,現(xiàn)配現(xiàn)用。顯色試劑B液:精確稱取氯化鐵0.9 g,溶解于蒸餾水中并定容至100 mL。使用時,往A液中加入0.5 mL B液并混勻,即配即用。

精確稱量13 mg檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品,用無水乙醇溶解并定容至100 mL,作為標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。準(zhǔn)確吸取0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中,分別加無水乙醇至2.0 mL,再分別快速加入5.0 mL混合A液和B液的顯色劑,室溫下放置30 min。于500 nm處測定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),以檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并求得回歸方程為:y=7.2446x-0.0002,R2=0.999。

1.2.3.2 檸檬苦素降解率的測定 參考文獻(xiàn)[22],將接種后的發(fā)酵液3900 r/min,離心10 min,使菌體與上清分離,收集上清液。稱取50 mL上清液于125 mL分液漏斗中,以15 mL×2次石油醚脫脂后,分離除去石油醚層,加1 g MgSO4,然后以15 mL氯仿萃取3次,靜置分層,合并3次氯仿萃取液,將氯仿萃取液真空減壓濃縮。將濃縮物用無水乙醇定容到25 mL,待測。根據(jù)下式取其中1 mL樣品測降解率。

式(1)

式(1)中:m1為對照中的檸檬苦素含量,mg;m2為降解后的樣品中剩余檸檬苦素含量,mg。

1.2.3.3 酶活力測定 參考文獻(xiàn)[23],檸檬苦素酶活力定義:以酶反應(yīng)條件下每毫升酶液每分鐘所降解的檸檬苦素的微克數(shù)為單位酶活力(U)。參考方法1.2.2,收集培養(yǎng)36 h的發(fā)酵液,于8000 r/min離心10 min,取粗酶液待用。

樣品對照:取1 mL的0.13 mg/mL的檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)液于標(biāo)記的10 mL比色管中,加入粗酶液0.1 mL,于100 ℃反應(yīng)10 min使酶失活,冷卻后先加0.9 mL的無水乙醇,再加5 mL配好的顯色劑終止反應(yīng)。樣品反應(yīng)液于室溫下反應(yīng)10 min,其他方法與樣品對照的方法相同。每個菌株設(shè)置三個平行實(shí)驗(yàn),在波長為500 nm測定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,按照式(2)計算測定菌株所對應(yīng)的酶活力。

式(2)

式(2)中,m1為對照樣品液中檸檬苦素質(zhì)量/μg;m2為反應(yīng)液中的檸檬苦素質(zhì)量/μg。

1.2.3.4 高效降解檸檬苦素的菌株篩 選用接種環(huán)輕輕刮取初篩得到的菌株的菌苔,接入30 mL的LB液體培養(yǎng)基中,35 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)10 h后,無菌水調(diào)節(jié)OD值為0.8制得種子液。將種子液按1%的接種量接種到50 mL的選擇性培養(yǎng)基中,35 ℃、170 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h,每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。測定培養(yǎng)試驗(yàn)前后培養(yǎng)基中檸檬苦素的含量,以不接菌的液體培養(yǎng)基為空白對照,計算各菌株的檸檬苦素降解率。

1.2.4 檸檬苦素高效降解菌的分類鑒定

1.2.4.1 形態(tài)學(xué)特征 將純化后的菌株接種于LB固體平板培養(yǎng)基上,35 ℃培養(yǎng)12 h后觀察其菌落生長情況和形態(tài),參考文獻(xiàn)[24]進(jìn)行革蘭氏染色。挑取單菌落制成玻片,置于光學(xué)顯微鏡下觀察各菌株的顯微形態(tài)。收集對數(shù)期的菌樣品拍SEM觀察[25]。

1.2.4.2 分子生物學(xué)鑒定 細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取以上3株菌的總基因組DNA,采用細(xì)菌16S rDNA通用引物(27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3′,1492R:5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3 ′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所述的PCR反應(yīng)體系:DNA模板(基因組DNA20-50 ng/μL)0.5 μL,27 F和1492 R引物各0.5 μL,2×PCR-mix 12.5 μL,ddH2O 11 μL,總體系為25 μL。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s,33個循環(huán);72 ℃ 修復(fù)延伸 10 min;最后4 ℃終止反應(yīng)。所得產(chǎn)物送至擎科(長沙)生物公司進(jìn)行測序,測序所得的16S rDNA序列,提交到NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast在線比對,進(jìn)行同源性序列搜索,利用MEGA 5軟件分析,采用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,Bootstrap 500次進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 培養(yǎng)初始pH對檸檬苦素降解率的影響 由于柑橘果汁都是酸性的,pH在4.0左右,在酸性條件下,檸檬苦素脫苦酶活力會得到抑制[26],因此,pH是菌株產(chǎn)檸檬苦素酶的重要因素。本實(shí)驗(yàn)設(shè)定初始pH梯度為2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5。在氮源為硝酸銨、菌接種量為1×108CFU/mL、碳源檸檬苦素含量100 mg/L條件下,于35 ℃,170 r/min條件下培養(yǎng)96 h,每個梯度設(shè)置3個平行,以研究菌株產(chǎn)檸檬苦素酶的最適pH。

1.2.5.2 培養(yǎng)溫度對檸檬苦素降解率的影響 本實(shí)驗(yàn)設(shè)定培養(yǎng)溫度在25、30、35、40、45 ℃下,在最適的pH、氮源為硝酸銨、菌接種量1×108CFU/mL、碳源檸檬苦素含量100 mg/L條件下,170 r/min培養(yǎng)12 h,每個樣品做三個平行實(shí)驗(yàn),以研究最適培養(yǎng)溫度。

1.2.5.3 氮源對檸檬苦素降解率的影響 將未加氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基平均分成5份,按照培養(yǎng)基的體積,分別加入15 g/L的蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、氯化銨和尿素,在最適pH、最適溫度、菌接種量1×108CFU/mL、碳源檸檬苦素含量100 mg/L條件下,170 r/min培養(yǎng)12 h,每個樣品做三個平行,以研究最適培養(yǎng)氮源。

1.2.5.4 菌接種量對檸檬苦素降解率的影響 本實(shí)驗(yàn)以1×108CFU/mL為單位,在不同濃度梯度1、2、4、6、8下,在最適pH、最適溫度、最適氮源、碳源檸檬苦素含量100 mg/L條件下,170 r/mim培養(yǎng)12 h,每個樣品做三個平行,以研究菌株產(chǎn)檸檬苦素酶的最適培養(yǎng)菌接種量。

1.2.6 Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計 采用Design-Expert 8.0軟件,用Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計[27-28],因JJ-3菌株降解能力相對較高，本實(shí)驗(yàn)分別選取影響JJ-3菌株產(chǎn)檸檬苦素降解酶的4個因素,包括pH(A)、溫度(B)、氮源(C)、菌接種量(D),每個因素選取三個水平,即高、中、低水平,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。表1表示實(shí)驗(yàn)因素對應(yīng)變量水平的對應(yīng)值。以檸檬苦素的降解率作為響應(yīng)值,用4因素3水平的響應(yīng)曲面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計,分別進(jìn)行二次多項(xiàng)方程擬合及優(yōu)化分析。設(shè)計結(jié)果如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平設(shè)計

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理分別采用Microsoft Excel(office 2016)、Design Expert 8.0、Origin2016等軟件進(jìn)行分析及繪制圖形。

2 結(jié)果及分析

2.1 檸檬苦素降解菌的分離篩選

在選擇性液體培養(yǎng)基中,檸檬苦素是唯一碳源,馴化培養(yǎng)一段時間后,劃線純化培養(yǎng),最終純化出8株菌,如表2所示,分別為編號XP、JJ-2、JJ-3、C-2-1、C-1-2-2、C-1-5、E-3-1、S-15-2。測定以上8株菌的檸檬苦素降解率,結(jié)果如表2所示。表2表明,從醋醅和多年生橘園的土壤中純化出的8株降解檸檬苦素的菌株,其中檸檬苦素降解率在25%以上的有3株(C-1-5、C-1-2-2、JJ-3),檸檬苦素降解率分別為27%、36%、38%,以這三株表現(xiàn)出較強(qiáng)降解優(yōu)勢的菌株,作為本研究的優(yōu)勢檸檬苦素降解菌,用于后續(xù)的試驗(yàn)。

表2 篩選得到的降解菌株降解能力及來源

2.2 優(yōu)勢檸檬苦素降解菌的分類鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)學(xué)觀察 對3株菌進(jìn)行菌落形態(tài)及顯微特征的觀察,對應(yīng)的菌落特征和顯微特征結(jié)果見表3,3株菌均屬于細(xì)菌,電子顯微鏡下觀察革蘭氏染色后個體形態(tài)圖,如圖1 所示,C-1-5、C-1-2-2、JJ-3均為革蘭氏陰性菌G-,掃描電鏡下,如圖2所示,3種菌均為短桿狀。C-1-5菌的細(xì)胞個體較C-1-2-2和JJ-3菌大一些。

表3 菌株的菌落形態(tài)及顯微特征

圖1 菌株C-1-5、C-1-2-2、JJ-3號革蘭氏染色觀察

圖2 菌株C-1-5、C-1-2-2、JJ-3的SEM觀察

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 菌株C-1-5、C-1-2-2、JJ-3經(jīng)過DNA提取、PCR擴(kuò)增,結(jié)果見圖3,得到3條分別為1322、1383、1354 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物,將上述擴(kuò)增產(chǎn)物測序后得到的結(jié)果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中,采用BLAST程序進(jìn)行同源性比對,并獲取登錄號分別為MN701037、MN701062、MN700650,結(jié)果顯示C-1-5與纖維菌屬(Cellulomonassp.)序列同源性較高,C-1-2-2和JJ-3與蒼白桿菌屬(Ochrobactrumsp.)序列同源性較高。因此,C-1-5為纖維菌屬(Cellulomonassp.),C-1-2-2和JJ-3為蒼白桿菌屬(Ochrobactrumsp.)。

圖3 菌株C-1-5、C-1-2-2、JJ-3的16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

選取與C-1-5、C-1-2-2、JJ-3三種菌株相似度較高(>95%)的菌株的16S rDNA基因序列,分別進(jìn)行ClustalW比對后,用MEGA 5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4、圖5、圖6所示,菌株C-1-5與纖維菌屬(Cellulomonassp.)親緣關(guān)系較近,菌株C-1-2-2和JJ-3與蒼白桿菌屬(Ochrobactrum sp.)親緣關(guān)系較近。根據(jù)以上形態(tài)學(xué)特征、顯微鏡觀察以及16S rDNA序列分析結(jié)果,將菌株C-1-5鑒定為纖維菌屬(Cellulomonassp.),菌株C-1-2-2和JJ-3鑒定為蒼白桿菌屬(Ochrobactrumsp.)。

圖4 菌株C-1-5的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 菌株C-1-2-2的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6 菌株JJ-3的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 初始pH對檸檬苦素降解率的影響 初始的pH對檸檬苦素降解率的影響結(jié)果如圖7所示,隨著pH的增加三株菌的檸檬苦素降解率均出現(xiàn)了先上升后降低的趨勢,C-1-5菌株在pH為5.5時,檸檬苦素降解率達(dá)到最大47.06%,選擇最適pH為5.5;C-1-2-2菌株在pH為4.5時,檸檬苦素降解率達(dá)到最大43.17%,選擇最適pH為4.5;JJ-3菌株在pH為3.5時,檸檬苦素降解率達(dá)到最大55.83%,選擇最適pH為3.5。

圖7 pH對檸檬苦素降解率的影響

2.3.2 溫度對檸檬苦素降解率的影響 溫度對檸檬苦素降解率的影響如圖8所示,隨著溫度的升高,三株菌的檸檬苦素降解率均出現(xiàn)了先上升后降低的趨勢,C-1-5菌株在溫度為40 ℃時,檸檬苦素降解率達(dá)到最大50.14%,選擇最適溫度為40 ℃;C-1-2-2菌株在溫度為40 ℃時,檸檬苦素降解率達(dá)到最大52.04%,選擇最適溫度為40 ℃;JJ-3菌株在溫度為30 ℃時,檸檬苦素降解率達(dá)到最大59.16%,選擇最適溫度為30 ℃。

圖8 溫度對檸檬苦素降解率的影響

2.3.3 氮源對檸檬苦素降解率的影響 不同氮源對檸檬苦素降解率的影響,結(jié)果如圖9所示,不同的氮源,三株菌的檸檬苦素降解率沒有相應(yīng)規(guī)律性,其中C-1-5、C-1-2-2菌株均在氮源為氯化銨時,檸檬苦素降解率達(dá)到最大分別為63%、58%,選擇最適氮源為氯化銨;JJ-3菌株在氮源為硝酸銨時,檸檬苦素降解率達(dá)到最大為59.15%,選擇最適氮源為硝酸銨。

圖9 氮源對檸檬苦素降解率的影響

2.3.4 菌接種量對檸檬苦素降解率的影響 最適的接種量可以縮短菌株的生長周期,因?yàn)椴煌瑵舛鹊慕臃N量影響著菌株在降解過程中的生長速度。接種量過大時會產(chǎn)生過多的代謝物,影響菌株的生長速度;接種量過小時會延長菌株的生長周期,緩慢達(dá)到對數(shù)期,降低生長速率。菌的接種量對檸檬苦素降解率的影響如圖10所示,三株菌C-1-5、C-1-2-2、JJ-3的最適菌濃均在2×108CFU/mL時,檸檬苦素降解率達(dá)到最大分別為65.90%、72.79%、74.66%,最適接種的菌濃度為2×108CFU/mL。綜合考慮,選擇三菌株的最適接種量為1×108～4×108CFU/mL。

圖10 菌接種量對檸檬苦素降解率的影響

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 回歸模型得建立與顯著性分析 按照1.2.6方法設(shè)計實(shí)驗(yàn),以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),設(shè)計響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化檸檬苦素降解率結(jié)果見表4。

表4 檸檬苦素降解率響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

采用Design Expert 8.0軟件,用軟件進(jìn)行非線性回歸的二次多相似擬合,得到預(yù)測模型如下:

Y=78.10-0.62A+0.73B+2.09C+5.23D-1.06AB+1.53AC+2.44AD+1.13BC-1.14BD+6.02CD-7.70A2-6.8B2-13.2C2-7.74D2

回歸模型的方差分析如表5所示,回歸方程的模型P<0.0001,F=17.33,說明模型差異性顯著;模型失擬項(xiàng)P=0.1734>0.05,說明失擬不顯著,這代表不確定因素對實(shí)驗(yàn)干擾較小;R2=0.9454,說明該模型能解釋94.54%的響應(yīng)值變化,即變化來源于所取得四個因素,回歸模型理想,擬合度高,可使用該模型對檸檬苦素降解率進(jìn)行預(yù)測和分析。

表5 檸檬苦素降解率的響應(yīng)面方差分析結(jié)果

根據(jù)F值大小可以判斷A、B、C、D四個因素對檸檬苦素降解率得影響,由大到小得順序依次為:D(菌接種量)>C(氮源)>B(溫度)>A(pH);次項(xiàng)D(菌接種量)對檸檬苦素降解率有極顯著影響(P<0.01),一次項(xiàng)C(氮源)對檸檬苦素降解率影響顯著(P<0.05),二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2影響極顯著(P<0.01),交互項(xiàng)CD影響極顯著(P<0.01)。

2.4.2 響應(yīng)面圖分析 為進(jìn)一步分析各因素對響應(yīng)值的影響,做出各因素之間的響應(yīng)面圖和等高線圖如圖11所示。從上至下,交互影響因素依次為AB、AC、AD、BC、BD、CD,響應(yīng)面越陡并且等高線呈橢圓形,說明相互作用顯著。

圖11 各因素之間交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

2.4.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 對回歸模型設(shè)計數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析,得到檸檬苦素降解的最佳條件為:pH為3.54,溫度為30.16 ℃,氮源水平為0.18,菌接種量為3.12×108CFU/mL。為了驗(yàn)證該方法的可靠性,并且考慮實(shí)際的操作情況,將檸檬苦素降解的最佳條件調(diào)整為:pH為3.5,溫度為30 ℃,氮源水平為0(硝酸銨),菌接種量為3×108CFU/mL。測得檸檬苦素降解率為78.90%,與理論預(yù)測值79.36%相差0.46%,說明此模型擬合良好可靠。

3 結(jié)論與討論

本研究從多年生長的橘園的土壤和新鮮醋醅中篩選得到8株菌株,其中C-1-5、C-1-2-2、JJ-3菌株的檸檬苦素降解率達(dá)到27%、36%、38%,在最適pH、溫度、氮源和接種量的情況下,C-1-5、C-1-2-2、JJ-3菌株的檸檬苦素降解率提高至65.90%、72.79%、74.66%。形態(tài)學(xué)鑒定和16S rDNA序列分析結(jié)果表明,C-1-5為纖維菌屬,C-1-2-2和JJ-3為蒼白桿菌屬,新發(fā)現(xiàn)纖維菌屬和蒼白桿菌屬可降解檸檬苦素,豐富了已有報道的檸檬苦素降解菌株的類型。

通過響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn),JJ-3菌株的檸檬苦素降解率的最佳工藝為:pH為3.5,溫度為30 ℃,氮源為硝酸銨,菌接種量為3×108CFU/mL。最佳工藝下檸檬苦素降解率為78.90%。試驗(yàn)表明JJ-3菌株在pH3.5的柑橘果汁中具有良好的降解性,可為實(shí)際應(yīng)用提供參考。