曹太見，鮑劍峰，趙麗，蘇占海，米明珊，杜鵬，趙洋洋，孫金琳

(1.青海大學附屬醫(yī)院脊柱外科，青海西寧 810000；2.青海大學附屬醫(yī)院手術麻醉科，青海西寧 810000；3.青海大學研究生院，青海西寧 810000；4.青海大學附屬醫(yī)院皮膚科，青海西寧 810000)

結核病是感染結核分枝桿菌引起的慢性傳染病，所有結核病例中，骨和關節(jié)的繼發(fā)感染占肺外結核的10%-35%，脊柱結核占50 %，使其成為最具代表性的肺外結核[1]。在印度、中國和印度尼西亞等發(fā)展中國家普遍存在由遺傳變異導致的活動性結核病情況[2]。但由于脊柱結核的過度保守治療和手術困難，脊柱結核已成為脊柱痙攣和畸形的主要原因[3]。

流行病學調查顯示，世界上約有1/3的人感染結核桿菌，但只有少數人受到攻擊[4]，可能與患者的生活環(huán)境、生活習慣以及疾病的遺傳易感性有關。研究患者對該疾病的遺傳易感性有助于早期識別高危人群，有利于早期診斷和干預，降低該疾病的發(fā)病率。研究發(fā)現，當結核分枝桿菌感染宿主并控制炎癥進展時，炎癥相關細胞因子起著重要作用。作為急性炎癥細胞因子，白細胞介素(interleukin, IL-10，IL-12)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)與干擾素(interferon-gamma，INF-γ)通過與其他相關炎癥因子交織而參與炎癥反應的下調，從而影響脊柱結核的發(fā)展[5, 6]。目前，上述基因多態(tài)性在藏、回、漢脊柱結核患者及正常人中是否存在表達差異，尚未見報道。本文通過研究TNF-α238、308、IFNG rs2430561、IL-10(-1082G/A、-592C/A)、IL -12(IL12RB1 rs436857)位點的基因多態(tài)性在藏、回、漢族脊柱結核患者及正常人中的表達特點，最終為脊柱結核的早期篩查、診斷尋求基因診斷依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2016年1月-2017年12月在青海大學附屬醫(yī)院脊柱外科住院確診為脊柱結核的患者，按民族分組(藏、回、漢族)，各組內患者分別預設序號，使用統(tǒng)計軟件選取隨機序號生成實驗組樣本(藏族40例，回族40例，漢族40例)。同法選取本院體檢中心同時段健康人群生成對照組樣本(藏族40人，回族40人，漢族40人)。

納入標準：(1)家族3代及以上均在青海本地生活；(2)所有樣本對象間無血緣關系；(3)研究對象無基因變異或遺傳性疾病。排除標準：(1)脊柱結核基礎上，確診患有糖尿病或長期應用激素者；(2)合并肝腎功能異常者；(3)HIV、自身免疫性疾病者。

1.2 樣本處理方法

采集每位研究對象的清晨空腹外周靜脈血2 mL×4管，采用聚合酶鏈反應[7](polymerase chain reaction, PCR)技術分析TNF-α 308、IFNG rs2430561、IL -10(-1082G/A、-592C/A)、IL-12(IL12RB1 rs436857)位點的基因多態(tài)性。

1.3 提取基因組DNA

采集研究對象的清晨空腹外周靜脈2 mL，加入乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管中，淋巴細胞基因組DNA嚴格按照所購血液基因組提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit,德國)說明書操作提取，采用梯度離心法(12 000 r/min室溫離心15 min，離心半徑為25 cm)提取基因組DNA并于-20°C保存。

1.4 位點多態(tài)性檢測

用提取的基因組進行PCR擴增，本研究采用iPLEX GOLD(Sequenom MassARRAY?)完成了對所選位點的引物設計，確保引物的特異性和反應的順利進行。

取iMLDRTM多重SNP分型試劑盒中的多重PCR引物混合物1 μL、2 × PCR Mastermix 5 μL、樣本DNA 1 μL、ddH2O 3 μL混勻，進行PCR擴增反應并純化。將試劑盒中的10 ×連接緩沖液2 μL、高溫連接酶0.2 μL、連接引物混合液1 μL與純化后多重PCR產物3 μL、 ddH2O 3.8 μL混勻。 然后94 ℃, 1 min，56 ℃, 4 min，共35個循環(huán)；最后4 ℃下保存。 取0.5 μL稀釋后的連接產物，與0.5 μL Liz500 Size Standard熒光內標及9 μL高度去離子甲酰胺混勻，95 ℃變性5 min后上測序儀(ABI3130XL)進行測序。收集的原始數據用UVP800(美國)進行分析，采用連接產物的熒光標記特點及長度區(qū)分等位基因及不同位點(由上海天昊生物科技公司完成)。

SNP選擇、分型及引物設計SNP位點選擇策略以標簽SNP為主，并且補充文獻報道的SNP位點，共選擇2個基因的16個SNP位點。標簽SNP是根據Hapmap數據庫(網址：http://www.hapmap.org)的中國人群數據得到，為了加強對5’非編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)的研究，選取標簽SNP的范圍在基因的5’端和3’端各延伸5000 bp。SNP分型采用美國Sequenom公司的高通量飛行質譜Mass ARRAY Analyzer技術。

2 結果

2.1 TNF-α308位點基因型及頻率結果

藏族實驗組與對照組TNF-α 308位點等位基因、基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?；刈迮c漢族實驗組與對照組TNF-α 308位點等位基因、基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。民族之間實驗組與對照組位點基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 藏、回、漢族實驗組與對照組的TNF-α 308位點等位基因及基因型頻率比較[n(%)]

2.2 IFNG rs2430561位點基因型及頻率結果

藏族實驗組與對照組IFNG rs2430561位點等位基因、基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。回族、漢族的實驗組與對照組IFNG rs2430561位點基因型及頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。3個民族的實驗組IFNG rs2430561位點基因頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 藏、回、漢族實驗組IFNG rs2430561位點等位基因及基因型頻率比較[n(%)]

2.3 IL-10(-1082G/A、-592C/A)位點基因型及頻率結果

藏族實驗組與對照組的IL-10-1082G/A位點等位基因、基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而在其他組別中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。IL-10-592C/A在各個民族中均沒有顯著性差異(P>0.05)，見表4。并且，兩個位點的等位基因、基因型頻率在不同民族間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3-4。

表3 藏、回、漢族實驗組IL-10-1082 G/A位點等位基因及基因型頻率比較[n(%)]

表4 藏、回、漢族實驗組IL-10-592C/A位點等位基因及基因型頻率比較[n(%)]

2.4 IL12RB1 rs436857位點基因型及頻率結果

藏族實驗組與對照組IL12RB1 rs436857位點等位基因、基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。漢族和回族在該位點基因、基因型頻率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，3個民族間位點基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表5。

表5 藏、回、漢族實驗組IL12RB1 rs436857位點等位基因及基因型頻率比較[n(%)]

3 討論

脊柱結核以結核桿菌刺激后引發(fā)肉芽腫為其典型的炎癥反應，細胞免疫機制在機體免疫中發(fā)揮著重要作用，能通過免疫調控殺滅巨噬細胞吞噬的結核桿菌。研究顯示，包括IL、TNF、INF-γ在內的細胞因子均在結核病變中起著重要的作用[6,7]。

3.1 TNF-α308位點基因的結果分析

TNF-α是一種由巨噬細胞激活后產生、能夠誘導巨噬細胞抑制結核桿菌生長，防止其擴散的細胞因子[8]。TNF-α-308A/G位點是結核病相關性的研究熱點。結果顯示，藏族實驗組TNF-α308G/A、A/A基因型頻率和等位基因頻率明顯高于對照組，而漢族和回族的位點基因、基因型的分布頻率比較無明顯差異。說明TNF-α308位點與青海地區(qū)漢族和回族脊柱結核易感性無關，卻在藏族患者中存在過度表達，揭示TNF-α308A等位基因可能是青海地區(qū)藏族脊柱結核的一種遺傳易患因子，其基因多態(tài)性與青海地區(qū)藏族脊柱結核的發(fā)病可能有一定相關性，這與李得春[9]研究結論基本一致。

3.2 IFNG-rs2430561位點基因多態(tài)性實驗結果分析

人類IFNγ基因與多種疾病密切相關，如病毒感染性疾病、肺結核、寄生蟲感染和腫瘤等[10]。本課題研究發(fā)現，rs2430561位點多態(tài)性(等位基因與基因型)在青海地區(qū)藏族人群中的分布有顯著性差異。藏族實驗組IFNγrs2430561的T等位基因頻率(92.5 %)明顯高于對照組，而其基因型頻率比較顯示T/T基因型在實驗組分布頻率較高(75 %)，而A/A基因型為0 %，說明IFNG-rs2430561位點與藏族脊柱結核易感性相關。藏與回、藏與漢族脊柱結核患者組比較顯示T與A等位基因頻率存在明顯差異性，藏族脊柱結核患者組中IFNγ-rs2430561 T等位基因頻率明顯增高。而回族、漢族實驗組與各自的對照組IFNγrs2430561等位基因與基因型頻率差異無統(tǒng)計學意義。結果說明，在青海地區(qū)IFNγ-rs2430561 T等位基因存在過度表達，且存在民族差異性。

3.3 IL-10(-1082G/A、-592C/A)位點基因多態(tài)性實驗結果分析

IL-10能夠通過抑制Th1細胞來抑制IFN-γ細胞因子的產生，參與脊柱結核和成骨的纖維化，控制結核病灶的擴散，延長時間。骨再生在抗結核免疫信號通路中起著重要作用[11]。本文研究發(fā)現，IL-10-1082G/A位點多態(tài)性(等位基因與基因型)在青海地區(qū)藏族脊柱結核患者與正常藏族健康人群中的分布有顯著性差異。藏族實驗組IL-10-1082 A等位基因頻率(12.5 %)明顯高于對照組；而其基因型頻率比較顯示，G/A基因型在實驗組分布頻率較高(15 %)。回族、漢族實驗組與各自的對照組IL-10-1082 G/A等位基因與基因型頻率差異無統(tǒng)計學意義。結果說明，在青海地區(qū)的藏族脊柱結核患者中IL-10-1082 A等位基因存在過度表達。IL -10-592C/A等位基因與基因型頻率結果顯示：藏、回、漢族實驗組與各自的對照組IL-10-592C/A等位基因與基因型頻率差異均無統(tǒng)計學意義，說明IL-10-592C/A多態(tài)性與青海地區(qū)藏、回、漢脊柱結核無明顯相關性。此外，兩個IL -10(-1082G/A、-592C/A)位點在與脊柱結核易感相關性中，不存在民族差異性。

3.4 IL12RB1 rs436857實驗結果分析

IL-12在結核分枝桿菌(mycobacterial tuberculosis，MTB)感染機體過程中承擔重要功能[12, 13]：抑制輔助T細胞2(Th2)，Th2可以降低體內T細胞、NK細胞及巨噬細胞，使得殺傷結核分枝桿菌的活性下降，導致結核病病情加重[14]。本研究發(fā)現，IL12RB1 基因多態(tài)性表達在青海地區(qū)的藏族脊柱結核患者中有明顯差異性。藏族實驗組IL12RB1 rs436857 A等位基因頻率(11.2 %)明顯高于對照組，G/A基因型在實驗組分布頻率也明顯較高(15 %)。在回族、漢族脊柱結核患者與其對照組的該等位基因頻率及基因型頻率的比較中，未發(fā)現明顯差異。結果說明，關于IL12RB1 rs436857等位基因在青海地區(qū)的脊柱結核患者中僅藏族人群存在差異性表達(IL12RB1 rs436857 A等位基因過度表達)，回族與漢族脊柱結核人群與IL12RB1 rs436857等位基因的多態(tài)性表達無明顯相關性。

綜上所述，青海地區(qū)藏族脊柱結核患者中TNF-α308 A、IFNG rs2430561 A、IL-10-1082 A、IL12RB1 rs436857A等位基因均存在差異性表達(過度或抑制)，TNF-α308、IFNG rs2430561、IL-10-1082、IL12RB1 rs436857其基因多態(tài)性與青海地區(qū)藏族脊柱結核的發(fā)病可能相關；IL-10-592C/A基因多態(tài)性與青海地區(qū)藏族脊柱結核的發(fā)病可能沒有關系。TNF-α308、IFNG rs2430561、IL -10(-1082G/A，-592C/A)、IL12RB1 rs436857基因多態(tài)性與青海地區(qū)藏、回族脊柱結核的發(fā)病可能無相關性。

本研究對病例和對照樣本的納入和排除嚴格，篩選合格的病例及樣本量偏少，樣本收集時間較長，其結果可能存在偏倚。在未來研究中，需納入更多病例及對照樣本，使用Mass ARRAY系統(tǒng)嚴格質控，盡量減少檢測的偏倚。我們在不同民族間脊柱結核基因多態(tài)性比較中，雖然漢、回族脊柱結核是陰性結果，但仍顯示了漢、回族脊柱結核病的部分遺傳特點，下一步需擴大樣本量、減少抽樣誤差而引起的結果偏倚。本研究僅對青海地區(qū)脊柱結核不同民族基因多態(tài)性的分析，需在加大樣本的同時對比研究其他區(qū)域內脊柱結核的基因多態(tài)性，利于進一步完善結核發(fā)病機制的研究，為我國脊柱結核的發(fā)生、治療及預防提供理論依據。