李勝吾，蔚浩，戴國鋼

(四川省骨科醫(yī)院，四川成都 610041)

腰痛是臨床常見病和多發(fā)病，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量并帶來較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-4]。大量研究發(fā)現(xiàn)，腰痛主要病因是椎間盤退變(Intervertebral disc degeneration,IDD)[2, 5]。IDD發(fā)生率隨著年齡的增長而增加，60歲以上無癥狀者中，90%會出現(xiàn)IDD[6]。研究發(fā)現(xiàn)，IDD涉及遺傳、機(jī)械和生物等多因素。然而，其確切機(jī)制尚未完全闡明。

2015年，Kazezian等[7]使用基因芯片獲得纖維環(huán)(annulus fibrosus,AF)和髓核(nucleus pulposus,NP)的基因表達(dá)譜。在本研究中，為了深入了解IDD的分子機(jī)制，筆者基于生物芯片數(shù)據(jù)鑒定了退行性AF和退行性NP與非退行性同類組織中的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)。本研究還收集了8名IDD患者和8名健康志愿者的全血(whole blood,WB)進(jìn)行生物芯片信息分析，以確定IDD患者WB中的DEGs，并且用實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證了部分DEGs。

1 資料與方法

1.1 椎間盤生物芯片數(shù)據(jù)

基于Affymetrix GPL17810平臺(HG-U133_Plus_2)的芯片數(shù)據(jù)集GSE70362從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫下載而來(網(wǎng)址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)。該數(shù)據(jù)集包含24個髓核和24個AF的尸體組織樣本基因表達(dá)數(shù)據(jù)，由36位年齡21-82歲捐贈者提供。本研究下載了原始信號強(qiáng)度數(shù)據(jù)的CEL格式文件和IDD的湯普森分級信息[8]。我們將原始的探針名轉(zhuǎn)換為基因名，丟棄任何未被識別的探針。對于具有多個探針的基因，只有具有最高差異倍數(shù)的探針被保留。在24個NP和24個AF樣本中，各有8個湯普森一級或湯普森一至二級的樣本被認(rèn)為是非退變性的，各有16個分類為湯普森二至五級的樣本被認(rèn)為是退變性的。

1.2 識別AF和NP的DEGs

使用Genespring GX 11.5軟件(美國安捷倫科技公司生產(chǎn))識別DEGs。使用RMA(Robust multi-array average)算法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，配對t檢驗(yàn)的閾值P值為0.05，差異倍數(shù)(fold change,FC)為1.5，以鑒定退行性和非退行性AF、NP樣本之間的DEGs。對于具有多個探針的基因，只保留具有最高FC的探針。

1.3 人類WB采集

WB樣本于2018年4月～2018年8月在四川省骨科醫(yī)院采集。本研究招募了8名患者，其中4名男性和4名女性，年齡33～60歲，經(jīng)磁共振成像確診為椎間盤退變(DD)；另有8名志愿者，其中4名男性和4名女性，年齡19～23歲，沒有下腰痛或坐骨神經(jīng)痛的臨床證據(jù)。在上午7:00～7:30之間，從每位受試者的左肘正中靜脈抽取10 mL的空腹全血。所有WB樣本立即置于靜脈真空采血管全血RNA管(美國BD)中于-20℃保存，72 h內(nèi)送上海博豪生物科技有限公司進(jìn)行基因芯片雜交。

1.4 WB的基因芯片數(shù)據(jù)分析和WB-DEGs的鑒定

基因芯片數(shù)據(jù)分析使用安捷倫SurrPress G3人類基因表達(dá)生物芯片8×60 K在上海博豪生物科技有限公司的安捷倫基因芯片掃描儀平臺上進(jìn)行掃面分析，遵循安捷倫科技有限公司(美國加利福尼亞州)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程。利用R語言的limma包對芯片掃描得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。采用分位數(shù)算法，對信號值進(jìn)行Log2歸一化處理。t檢驗(yàn)的閾值P值為0.05，F(xiàn)C值為1.5，以鑒定WB-DEGs。對于具有多個探針的基因，只保留具有最高FC的探針。WB基因表達(dá)譜的完整數(shù)據(jù)集已上傳到GEO數(shù)據(jù)庫，GSE124272。

1.5 常見DEGs總RNA提取、cDNA合成及實(shí)時熒光定量PCR檢測

用實(shí)時熒光定量PCR檢測NP、AF和WB中常見DEGs的表達(dá)。按照說明，使用PX血液RNA提取試劑盒(美國OMEGA)提取和純化總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒(日本TOYOBO)將每個RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后用cDNA進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。基因表達(dá)水平的量化使用7500HT序列檢測系統(tǒng)(美國ABI)和Power SYBR Green PCR Master Mix預(yù)混液(美國ABI)。用引物表達(dá)法(v3.0.1)設(shè)計(jì)特異基因的引物，由上海生丁生物工程股份有限公司合成。以β-肌動蛋白基因?yàn)閮?nèi)參基因，用2?傆bΔCt方法將基因表達(dá)水平與β-肌動蛋白基因進(jìn)行歸一化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)時熒光定量PCR數(shù)據(jù)由均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用GraphPad Prism 6.0軟件(美國加利福尼亞州圣地亞哥GraphPad軟件有限公司生產(chǎn))進(jìn)行t檢驗(yàn)。P<0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEGs

AF、NP、WB三組差異表達(dá)基因概況如表1所示。三組22個共同的差異表達(dá)基因。

表1 AF、NP、WB中DEGs概況

2.2 常見DEGs的實(shí)時熒光定量PCR

用WB進(jìn)行蛋白二硫鍵異構(gòu)酶A4(protein disulfide isomerase family A member 4, PDIA4)、肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶11(FK506 BINDING PROTEIN 11, FKBP 11)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶4(ectonucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase 4, ENPP4)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2, SOD2)和肌動蛋白結(jié)合蛋白LIM1(actin binding LIM protein 1, ABLIM1)實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證基因芯片雜交結(jié)果。用WB進(jìn)行的實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果與基因芯片雜交結(jié)果一致，證明了基因芯片結(jié)果的可靠性(圖1 A-E)。椎間盤退變(IDD)患者WB中PDIA4、FKBP11和ENPP4的表達(dá)水平明顯低于健康志愿者，而SOD2的表達(dá)水平明顯高于健康志愿者。結(jié)果表明，PDIA4、FKBP11、ENPP4、SOD2的基因表達(dá)水平在患者組和志愿者組之間存在顯著差異(P<0.05)。PCR引物均列于表2中。

圖1 PDIA4、FKBP11、ENPP4、SOD2、ABLIM1在椎間盤退變(IDD)患者與健康志愿者WB中表達(dá)水平比較

表2 用于實(shí)時熒光定量PCR的引物序列

3 討論

基因芯片技術(shù)目前已逐漸被運(yùn)用于椎間盤退變領(lǐng)域的相關(guān)研究，為椎間盤退變的發(fā)病機(jī)制研究起到重要的推動作用[9]。以往的研究大多集中在退行性和非退行性AF或NP或整個椎間盤組織之間的DEGs方面，而這些組織只能通過手術(shù)獲得。本研究通過全血分析出退變椎間盤患者與健康人之間存在DEGs，且這些差異基因與AF和NP的差異基因既有部分重疊，也有差異，這一結(jié)論提示，今后在椎間盤退變相關(guān)疾病生物學(xué)治療上，不能只局限于椎間盤局部組織的取樣和分析，還要考慮不同組織的基因表達(dá)可能存在差異。全血與椎間盤組織存在共同的DEGs，在條件有限情況下，可以優(yōu)先選擇操作更為簡便的抽血進(jìn)行取樣分析。

本研究鑒定出846個AF-DEGs、902個NP-DEGs和862個WB-DEGs，其中有22個共同的DEGs。用實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證椎間盤退變患者全血中PDIA4、FKBP11、ENPP4、SOD2、ABLIM1基因的表達(dá)水平，PDIA4、FKBP11和ENPP4的表達(dá)水平明顯低于健康志愿者，而SOD2的表達(dá)水平明顯高于健康志愿者。

Schubert等[10]通過全基因組表達(dá)分析鑒定了5個AF和6個NP生物標(biāo)志物，但在本研究的全血中未觀察到這11個生物標(biāo)志物的異常表達(dá)。Guo等[11]比較退行性椎間盤和非退行性椎間盤的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)有35個FC大于2的DEGs在AF-DEG和NP-DEG間重疊。在這35種常見的DEGs中，只有具有LIM結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白185包含在本研究FC為1.5的DEGs中。Kazezian等[12]鑒定了17個FC大于1.5的退變AF生物標(biāo)記物，但在本研究所鑒定出的AF-DEGs中未觀測到這些生物標(biāo)志物的異常表達(dá)。Zhang等[13]比較椎間盤退變患者外周血單核細(xì)胞與非椎間盤退變者外周血單核細(xì)胞的基因表達(dá)譜，共鑒定出62個DEGs，其中上調(diào)基因39個，下調(diào)基因24個，在這39個上調(diào)的DEGs中，人膜聯(lián)蛋白A3(Annexin A3)、組織蛋白酶抗菌肽(cathelicidin antimicrobial peptide, CAMP)和白介素1β(interleukin 1 beta, IL-1β)在本研究中椎間盤退變患者全血里有所上調(diào)，但細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin B1和肌間蛋白2(Myomesin 2, MYOM2)表達(dá)有所下調(diào)，在我們所鑒定出的WB-DEGs中沒有發(fā)現(xiàn)他們研究報(bào)道的24個下調(diào)基因。

隨著對椎間盤退變機(jī)制的認(rèn)識深入和分子生物學(xué)技術(shù)不斷進(jìn)步，基因治療在改變椎間盤細(xì)胞代謝和生物力學(xué)性能方面逐漸開展?；蛑委煹哪康氖菍⑼庠葱?DNA或 RNA轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞，通過外源基因表達(dá)對靶細(xì)胞有利的蛋白產(chǎn)物或沉默特定基因減少有害產(chǎn)物生成，使靶細(xì)胞恢復(fù)正常的形態(tài)功能[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)椎間盤退變患者全血中差異基因PDIA4、FKBP11和ENPP4的表達(dá)水平明顯降低，而SOD2的表達(dá)水平明顯增高，通過國內(nèi)外文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫查閱，目前尚無PDIA4、FKBP11和ENPP4與椎間盤退變相關(guān)性的研究報(bào)道。PDIA4屬于蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase,PDI)家族，PDI家族主要在促蛋白折疊、翻譯后修飾上發(fā)揮重要作用，與未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)密切相關(guān)，而UPR與多種疾病如糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤等發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，PDIA4主要在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中表達(dá)，目前對于PDIA4生理學(xué)功能研究并不透徹[15]。FKBP11是肽基脯氨酸順異異構(gòu)酶家族成員之一，也與UPR密切相關(guān)，可保護(hù)細(xì)胞免受炎性反應(yīng)損傷[16]，炎性反應(yīng)在椎間盤退變的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[17-20]。筆者推測FKBP11可能在椎間盤退變中參與炎癥保護(hù)。ENPP4的生物學(xué)功能也尚不明確，有研究報(bào)道其在巨噬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，具有抗腫瘤效應(yīng)和保護(hù)細(xì)胞降低細(xì)胞毒性反應(yīng)[21]。關(guān)于SOD2與椎間盤退變的關(guān)系，目前已有一定的研究進(jìn)展。椎間盤退變是伴隨著氧化性損傷和炎性反應(yīng)而加速的衰老過程[22-24]。椎間盤退變過程中，血管向椎間盤內(nèi)生長[25-26]，由此形成的新生血管使椎間盤的無血管組織暴露于高氧張力[27]。SOD2將超氧自由基轉(zhuǎn)化為H2O2，通過抗氧化劑酶將其分解為無害的H2O和O2[28-29]。過度的氧化反應(yīng)通過誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)可引起蛋白質(zhì)、DNA和細(xì)胞膜損傷，與細(xì)胞炎性反應(yīng)相關(guān)[30-31]。SOD2在椎間盤退變過程中可能通過抗氧化和抗炎機(jī)制保護(hù)椎間盤。

本研究發(fā)現(xiàn)，人全血中的PDIA4、FKBP11、ENPP4、SOD2是椎間盤退變的潛在標(biāo)志物，這些基因可能對椎間盤退變的機(jī)制研究和生物學(xué)治療提供了重要的依據(jù)。今后需要開展進(jìn)一步研究以確定這些基因在椎間盤退變過程中的具體作用機(jī)制。由于椎間盤退變與年齡密切相關(guān)，為了盡量避免椎間盤退變可能出現(xiàn)在健康對照組，本研究招募了年輕人作為志愿者，不排除年齡可能會影響基因表達(dá)檢測結(jié)果，因此需要后續(xù)研究再次驗(yàn)證。