王振芳，王 亞，馬建青，鄭麗紅，王 帥，張晶梅

(1.冀中能源邢臺(tái)礦業(yè)集團(tuán)總醫(yī)院，河北 邢臺(tái) 054000；2.邢臺(tái)市第三醫(yī)院，河北 邢臺(tái) 054000)

近年來，臨床科研人員利用試驗(yàn)山羊模擬骨外科高新術(shù)式越來越多。然而，在模擬試驗(yàn)過程中，有的山羊出現(xiàn)失血，甚至個(gè)別山羊出現(xiàn)大出血現(xiàn)象，直接影響臨床新技術(shù)研究的成敗。此時(shí)及時(shí)準(zhǔn)確給山羊進(jìn)行血液補(bǔ)給尤為重要。若要給試驗(yàn)山羊輸血，尋找試驗(yàn)山羊的匹配血型是首要問題。有學(xué)者對(duì)試驗(yàn)山羊的血型進(jìn)行了初步探討[1-2]，為了不斷提高臨床醫(yī)療水平，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。了解掌握試驗(yàn)用山羊的血型及其臨床意義很有必要。因此，筆者對(duì)試驗(yàn)用山羊的紅細(xì)胞進(jìn)行了ABO、Rh、MN三個(gè)血型系統(tǒng)的血型研究分析?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)用山羊?yàn)楸驹汗强蒲芯克行娘曫B(yǎng)及邢臺(tái)縣當(dāng)?shù)厣窖?，共?jì)102只。母羊63只，公羊39只，山羊年齡為1～2歲，體重為24～46 kg，平均體重為35 kg。

1.2 主要試劑與儀器 抗-D、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e?？?M、抗-N標(biāo)準(zhǔn)血清(批號(hào)：20183102、20183203、20185605)，購自上海血液生物醫(yī)療有限責(zé)任公司；A型血紅細(xì)胞、B型紅細(xì)胞、O型紅細(xì)胞(批號(hào)：20180607、20181025)；微柱凝膠血型卡(批號(hào)：20180610)、TD-3A型血型血清學(xué)離心機(jī)、FYQ免疫微柱孵育器，均購自長春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司。2005-2型血庫專用離心機(jī)(BaSo貝索)。

1.3 方法

1.3.1 血樣采集及處理 首先將山羊臥倒，使山羊頭抬起與身體成90°，采血者右手固定山羊頸部，在頸靜脈1/3處頸靜脈溝內(nèi)消毒，直徑約4 cm×4 cm， 左手拇指按壓山羊頸靜脈使其充盈，右手持采血針沿頸靜脈縱向45°角刺入血管中。采集3 mL EDTA抗凝全血，3 400 r/min離心10 min，分離血漿待檢。

1.3.2 ABO血型檢測(cè) 選用微柱凝膠卡方法：將微柱凝膠卡的6支凝膠微管做好標(biāo)記，撕開封口膜，將待檢山羊0.8%紅細(xì)胞懸液分別加入第1～3微管中，每管50 μL；再將被檢山羊血清分別加入第4～6 微管中，每管50 μL；然后將已知A型、B型及O型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞(0.8%濃度)分別加入第4～6微管中，每管50 μL。即刻使用專業(yè)離心機(jī)3 400 r/min離心5 min，取出,肉眼觀察結(jié)果。

1.3.3 Rh血型、MN血型檢測(cè) 選用經(jīng)典試管法：準(zhǔn)備100 mm×13 mm試管若干支，做好標(biāo)記。每管加1滴抗血清于試管底部，再加1滴3%～5%被檢山羊紅細(xì)胞懸液于試管底部，混勻。以轉(zhuǎn)速1 000 r/min離心1 min,或轉(zhuǎn)速3 400 r/min離心15 s。然后取出試管輕輕搖動(dòng)，使試管內(nèi)容物重新懸浮。借助顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 山羊ABO血型 試驗(yàn)山羊結(jié)果顯示，既無ABO血型系統(tǒng)的A抗原、也無ABO血型系統(tǒng)的B抗原，存在類似人類O型血型特征(見表1)。

表1 山羊ABO血型檢測(cè)結(jié)果Table 1 Results of ABO blood group examination in goats

2.2 山羊Rh(D、E、e、C、c)及MN血型 采用試管法對(duì)102只試驗(yàn)山羊血型標(biāo)本進(jìn)行Rh血型系統(tǒng)的D、E、C、c、e抗原檢測(cè)，同時(shí)用同樣方法將試驗(yàn)山羊血標(biāo)本進(jìn)行M、N血型抗原檢測(cè)。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，D抗原、C抗原、c抗原、e抗原、N抗原陽性數(shù)均為0，即陰性率為100%。結(jié)果顯示，102只試驗(yàn)山羊中發(fā)現(xiàn)6只山羊紅細(xì)胞上含有E抗原，3只山羊紅細(xì)胞上含有M抗原(見表2)。

表2 山羊Rh(D、E、e、C、c)及MN血型結(jié)果Table 2 The results of RH (D,E,e,C,c) and MN blood group of goats

3 討論

目前尚無市售山羊的血型抗原抗體檢測(cè)專用試劑，筆者選用微柱凝膠卡氏法對(duì)試驗(yàn)山羊ABO血型進(jìn)行了檢測(cè)分析；采用經(jīng)典的試管法對(duì)試驗(yàn)山羊Rh及MN血型進(jìn)行研究。微柱凝膠卡新技術(shù)近年來已在血型血清免疫學(xué)方面作為常規(guī)技術(shù)應(yīng)用[3]，其原理是采用微試管凝膠凝集技術(shù)，將凝膠及抗人球蛋白血清抗體或其他抗體裝入微柱中離心，將發(fā)生凝集反應(yīng)的紅細(xì)胞阻滯于凝膠之內(nèi)，而未凝集的單個(gè)紅細(xì)胞則穿過凝膠間隙運(yùn)動(dòng)至管柱底，從而區(qū)分有無凝集反應(yīng)。同傳統(tǒng)方法相比，該方法主要優(yōu)點(diǎn)為血清學(xué)操作標(biāo)準(zhǔn)化[4]，重復(fù)性好，容易掌握，無需經(jīng)驗(yàn)，減少標(biāo)記，降低了錯(cuò)誤發(fā)生率。此外，該方法的結(jié)果易判斷[5]，凝集在上層為陽性，停留在下層為陰性。此方法結(jié)果穩(wěn)定，可保存、可拍照、可存入計(jì)算機(jī)，并易復(fù)檢。此方法檢測(cè)試驗(yàn)動(dòng)物山羊ABO血型試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果可靠。

試驗(yàn)山羊的Rh及MN血型系統(tǒng)的血型采用經(jīng)典的試管法檢測(cè)。傳統(tǒng)的經(jīng)典試管法是血型血清學(xué)檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，該方法準(zhǔn)確且成本低，可用于疑難/特殊血型鑒定。尤其對(duì)一些弱血型抗原抗體更易發(fā)現(xiàn)。就人類的血型而言，ABO血型系統(tǒng)的抗原比Rh及MN血型系統(tǒng)血型抗原強(qiáng)得多。比如：ABO血型系統(tǒng)內(nèi)的A型紅細(xì)胞表面上A抗原位點(diǎn)有80～100 萬個(gè)；B型紅細(xì)胞表面抗原位點(diǎn)有75萬個(gè)；而Rh血型系統(tǒng)內(nèi)的“-D-”(屬于C、c、E、e缺失型)的D抗原位點(diǎn)有20萬個(gè)，正常的D抗原位點(diǎn)1～3萬個(gè)，弱D抗原位點(diǎn)只有700～4 000個(gè)。MN血型系統(tǒng)的抗-M、抗-N血型抗體為天然抗體，是一種冷抗體，在檢測(cè)血型時(shí)，室溫20 ℃左右可出現(xiàn)弱凝集，要注意觀察血型結(jié)果，這種冷抗體在4 ℃凝集較強(qiáng)。試驗(yàn)動(dòng)物山羊血液中的紅細(xì)胞抗原及血清中的血清抗體不像人類那么高，且紅細(xì)胞上的特異性抗原較少。故試驗(yàn)人員在檢測(cè)試驗(yàn)動(dòng)物山羊血型之前，一定要根據(jù)試驗(yàn)動(dòng)物山羊的血清學(xué)特點(diǎn)，篩選出適合山羊血清學(xué)檢測(cè)的敏感方法。

由表1可知試驗(yàn)山羊ABO血型均為類人O型，即試驗(yàn)山羊的紅細(xì)胞加入單克隆抗-A、抗-B血清后均出現(xiàn)陰性反應(yīng)，山羊的血清分別加入A、B、O三型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞后，凝集強(qiáng)度為2+～4+。通過以上正反定型綜合分析，符合ABO血型系統(tǒng)的O型。因此，將試驗(yàn)山羊ABO血型最終定為類人O型。但從試驗(yàn)山羊ABO血型鑒定中的對(duì)照管中發(fā)現(xiàn)了新的問題，即試驗(yàn)山羊血清與人類標(biāo)準(zhǔn)O型紅細(xì)胞反應(yīng)時(shí)出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。筆者推測(cè)，這一凝集現(xiàn)象的出現(xiàn)，可能是試驗(yàn)山羊血清中存在著一種抗人類紅細(xì)胞的抗體，再者也可能是鑒定山羊血型所用的標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞是由人類紅細(xì)胞篩選制備。因人類的紅細(xì)胞和山羊的紅細(xì)胞在膜電位和凝集的最適溶液離子強(qiáng)度等方面存在差異，故兩者的紅細(xì)胞不完全匹配所致。因此有必要對(duì)試驗(yàn)山羊的紅細(xì)胞膜上的抗原位點(diǎn)的多寡及血清中的特異性抗體進(jìn)行研究，為試驗(yàn)山羊的血型深入研究提供科學(xué)基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)通過經(jīng)典試管法對(duì)102只試驗(yàn)山羊進(jìn)行了稀有血型調(diào)查。山羊稀有抗原檢測(cè)主要由：D、E、e、C、c、M、N七種稀有血型抗原。人類Rh血型抗原的強(qiáng)度僅次于ABO血型的A、B抗原。Rh血型陰性者有50%～75%，通過輸血治療或妊娠可使紅細(xì)胞上的D抗原免疫而產(chǎn)生抗-D。Rh血型抗原中，抗原的強(qiáng)度依次為D>E>C>c>e[6-7]，均顯示劑量效應(yīng)，即在遺傳方式上，同質(zhì)結(jié)合子比異質(zhì)結(jié)合子強(qiáng)。MN血型系統(tǒng)在遺傳學(xué)、輸血學(xué)及親子鑒定等方面有其重要作用。掌握各地區(qū)山羊MN血型的分布及特征情況具有一定的臨床意義。據(jù)王振芳報(bào)道[8]，河北省邢臺(tái)地區(qū)漢族人MN血型分布為M型最多，平均為50.50%；其次為MN型，平均為26.91%；N型最少，平均為22.59%。試驗(yàn)山羊的稀有血型尚無報(bào)道。此次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了6只E血型試驗(yàn)山羊；3只M血型試驗(yàn)山羊。由此筆者推測(cè)試驗(yàn)山羊可能存在有類人類血型系統(tǒng)的血型，為今后掌握應(yīng)用試驗(yàn)山羊的其他血型系統(tǒng)的研究提供了思路。

本試驗(yàn)采用不同方法，對(duì)試驗(yàn)山羊血型進(jìn)行了系統(tǒng)研究，既發(fā)現(xiàn)了ABO血型系統(tǒng)的O型山羊，又檢測(cè)到Rh血型系統(tǒng)的E抗原，還印證了MN血型系統(tǒng)的M抗原的存在?？傊?，了解掌握山羊的血型有其重要意義，特別有助于山羊在新術(shù)式試驗(yàn)過程中提高試驗(yàn)效果，延長山羊的生命；也有助于山羊創(chuàng)傷輸血救治；同時(shí)也促進(jìn)了動(dòng)物學(xué)、動(dòng)物免疫學(xué)、動(dòng)物遺傳學(xué)、動(dòng)物輸血學(xué)等動(dòng)物多學(xué)科的發(fā)展。