陽(yáng)巧梅，鄧小榮，譚德展

(1.邵陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，湖南 邵陽(yáng) 422004；2.湖南省祁陽(yáng)縣畜牧水產(chǎn)局，湖南 永州 426100)

豬腹瀉性疾病成為養(yǎng)豬過(guò)程中主要的傳染性疾病之一，腹瀉性疾病可以危害不同日齡的豬，尤其對(duì)仔豬危害較大，感染率和死亡率均較高，其死亡率高達(dá)80%以上，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。相關(guān)研究表明，引起仔豬腹瀉因素主要包括細(xì)菌性、病毒性、寄生蟲性和飼養(yǎng)管理不當(dāng)?shù)?，臨床中致病性大腸桿菌、沙門菌、志賀菌及梭菌等細(xì)菌性腹瀉較為常見(jiàn)[2-3]。仔豬細(xì)菌性腹瀉具有廣泛的流行性、發(fā)病率和死亡率均較高、易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，給診斷和防控帶來(lái)一定的困難[4-5]。志賀菌又稱為痢疾桿菌，該菌主要引起人和動(dòng)物的腸道傳染病，主要以發(fā)熱、腹瀉及血便為主，嚴(yán)重者可導(dǎo)致毒血癥等，是重要的人獸共患病病原之一[6]。國(guó)內(nèi)關(guān)于志賀菌引起豬、牛、羊等發(fā)病的報(bào)道逐漸增多[7-8]。志賀菌可能對(duì)養(yǎng)殖業(yè)存在潛在的威脅，應(yīng)該引起重視。

本試驗(yàn)從采集自南京地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)中患腹瀉仔豬的肛拭子、糞便等病料組織126份中分離得到52株致病性志賀菌，并對(duì)其進(jìn)行血清型分布及耐藥性檢測(cè)，確定流行趨勢(shì)，為該地區(qū)致仔豬腹瀉志賀菌病的防控提供了參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源 南京地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)中患腹瀉仔豬的肛拭子、糞便等病料組織126份，進(jìn)行志賀菌分離鑒定。

1.2 試劑與儀器 MAC培養(yǎng)基、XLD培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)肉湯，均購(gòu)自青島高科園海博技術(shù)有限公司；ID32E腸道菌鑒定試條，購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司；志賀菌屬診斷血清制劑，購(gòu)自蘭州生物制品研究所；藥敏紙片，購(gòu)自杭州微生物試劑公司；基因組 DNA 提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；DL-2 000 Marker，購(gòu)自北京中科瑞泰生物公司；2×TaqMarker Mix，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)、多功能梯度PCR儀，均由美國(guó)ABI公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 25 g左右昆明系小鼠350只，由本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 細(xì)菌的分離與鑒定 采集的病料組織樣品，經(jīng)處理后，接種于MAC培養(yǎng)基在37 ℃恒溫箱進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，挑取MAC培養(yǎng)基上單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落接種于XLD培養(yǎng)基上進(jìn)行鑒別培養(yǎng)，挑取XLD培養(yǎng)基單個(gè)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)后，革蘭染色鏡檢和生化試驗(yàn)。

1.5 細(xì)菌生化試驗(yàn) 按照說(shuō)明書，將分離菌株調(diào)整菌液濃度為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫?，接種 ID32E腸道菌鑒定試條中培養(yǎng)，用全自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌生化特性鑒定。

1.6 細(xì)菌PCR鑒定 參考文獻(xiàn)[6]，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中志賀菌保守區(qū)基因序列，設(shè)計(jì)ipaH基因特異引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按照試劑盒說(shuō)明書提取分離菌株的基因組DNA，以提取的分離菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR鑒定，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄參考株的基因序列進(jìn)行同源性比較。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.7 致病性試驗(yàn) 將分離菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，調(diào)整菌液濃度為108CFU/mL，每株分離菌株腹腔注射0.2 mL(108CFU/mL)，5只小鼠，對(duì)照組注射等量的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯，攻毒12 h后，觀察小鼠發(fā)病情況并進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，試驗(yàn)期為7 d。

1.8 血清型鑒定 參照依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB 4789.5-2012食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 志賀氏菌檢驗(yàn)》中的方法對(duì)臨床分離的志賀菌的血清型進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)參照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行，按照CLSI的標(biāo)準(zhǔn)判斷耐藥(R)、敏感(S)或中介(I)進(jìn)行結(jié)果判斷與耐藥性分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 疑似志賀菌分離菌株在MAC培養(yǎng)基上長(zhǎng)出半透明、圓形、大小一致的桃紅色菌落；在XLD培養(yǎng)基上長(zhǎng)出半透明、圓形、表面光滑的中等大小粉紅色或者無(wú)色的菌落。分離菌株革蘭染色為陰性、呈兩端略圓的短桿狀。分離的志賀菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)特征與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB 4789.5-2012 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 志賀氏菌檢驗(yàn)》中報(bào)道的基本一致。

2.2 分離菌株生化鑒定 疑似志賀菌的分離菌株均能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇，硝酸鹽試驗(yàn)、M.R.試驗(yàn)、枸櫞酸鹽試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)均為陽(yáng)性;尿素酶試驗(yàn)和V-P試驗(yàn)陰性。生化鑒定系統(tǒng)鑒定為志賀菌，評(píng)定結(jié)果合格率為97.9%～99.9%；通過(guò)統(tǒng)計(jì)采集的126份樣品中分離得到69株志賀菌。

2.3 細(xì)菌PCR檢測(cè)與測(cè)序 用志賀菌特異引物ipaH基因?qū)Ψ蛛x的69株分離菌株均擴(kuò)增出大約為620 bp大小的目的條帶(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示：69株分離菌測(cè)序結(jié)果與GenBank庫(kù)中登錄的12株志賀菌參考株基因序列的同源性在98.9%～100.0%。因而證實(shí)了69株分離菌為志賀菌。

圖1 分離菌株P(guān)CR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR results of isolated strainsM:DL-2 000 DNA Marker； 1～9:分離菌株M:DL-2 000 DNA Marker； 1～9:Isolated strains

2.4 致病性試驗(yàn) 分離菌株在攻毒后的2～3 d出現(xiàn)發(fā)病，精神沉郁、腹瀉，個(gè)別的出現(xiàn)死亡，對(duì)死亡的小鼠進(jìn)行細(xì)菌鑒定，從體內(nèi)分離到志賀菌，直到試驗(yàn)結(jié)束(7 d)，對(duì)照組的小鼠健康存活。通過(guò)統(tǒng)計(jì)52株分離菌株使小鼠致死，因而證實(shí)了分離的52株分離菌株為致病性志賀菌。

2.5 血清型鑒定 結(jié)果由表2可知，分離的52株致病性志賀菌的血清型主要包括福氏志賀菌1a、1b、2b、3b四種血清型，其中福氏志賀菌1a血清型有16株、福氏志賀菌1b血清型有21株，分別占致病菌株的30.1%、40.4%，福氏志賀菌1a和 1b血清型為該地區(qū)志賀菌流行的主要優(yōu)勢(shì)血清型。

表2 血清型鑒定試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of serotype identification test

2.6 藥敏試驗(yàn) 結(jié)果由表3可知，分離的52株致病性志賀菌對(duì)阿莫西林、氨芐西林、磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星、多西環(huán)素5種藥物耐藥率最高，耐藥率在80.8%～98.1%；對(duì)新霉素、慶大霉素、大觀霉素、多黏菌素4種藥物耐藥率在 53.8%～75.0%；對(duì)頭孢噻呋、頭孢曲松、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、林可霉素5種藥藥物耐藥率在9.6%～40.4%。

3 討論

志賀菌是一種重要人獸共患病原菌，該菌可以引起多種動(dòng)物的嚴(yán)重腹瀉和幼齡動(dòng)物死亡，嚴(yán)重威脅人和動(dòng)物健康[9]。國(guó)內(nèi)關(guān)于牛、羊、豬等動(dòng)物感染志賀菌的報(bào)道逐漸增多。文英[9]報(bào)道了從青海省定地區(qū)牛、羊、雞、豬新鮮的糞便中分離得到72株志賀菌，大部分具有致病性。張興民等[6]研究表明，從四川地區(qū)226份羔羊的糞便中分離得到54株志賀菌，不同血清型的志賀菌對(duì)小鼠具有致病性。說(shuō)明了志賀菌在養(yǎng)殖業(yè)中流行。因此，在養(yǎng)殖過(guò)程中，應(yīng)該對(duì)志賀菌的防控引起重視。本試驗(yàn)表明，從南京地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)中患腹瀉仔豬的肛拭子、糞便等病料組織126份中分離得到69株志賀菌，分離率為54.8%(69/126)，通過(guò)人工感染小鼠試驗(yàn)，驗(yàn)證其致病性，其中52株為致病性志賀菌。說(shuō)明該地區(qū)仔豬源志賀菌在廣泛流行，應(yīng)該引起重視。因此，本試驗(yàn)對(duì)分離的52株志賀菌的血清型及耐藥性進(jìn)行檢測(cè)與分析。

表3 耐藥性結(jié)果Table 3 Results of drug resistance analysis

志賀菌是主要的革蘭陰性的胞內(nèi)寄生菌，該菌主要包括福氏志賀菌、痢疾志賀菌、宋內(nèi)氏志賀菌、鮑氏志賀菌4個(gè)血清群，在我國(guó)流行的主要以福氏志賀菌F2a、F3型為主，其中志賀菌1型在我國(guó)不同地區(qū)、不同養(yǎng)殖場(chǎng)流行[10-12]。本試驗(yàn)研究表明，分離52株致病性志賀菌屬于4種血清，福氏志賀菌F1a和F1b血清型為地區(qū)流行優(yōu)勢(shì)血清型，分別占致病菌株的30.1%、40.4%；與國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道有一定差異性，也可能與地區(qū)有關(guān)，不同的地區(qū)其流行情況不同。

在豬養(yǎng)殖過(guò)程中，抗菌藥物不合理的使用，不僅導(dǎo)致了抗菌藥物對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性，同時(shí)還造成嚴(yán)重藥物殘留，細(xì)菌的耐藥性可以通過(guò)多種途徑傳播給人類，嚴(yán)重威脅著人類的健康[11-13]。本試驗(yàn)表明，分離52株致病性志賀菌對(duì)阿莫西林、氨芐西林、磺胺間甲氧嘧啶等9種藥物耐藥率在53.8%～98.1%；對(duì)頭孢噻呋、頭孢曲松、氟苯尼考等5種藥藥物耐藥率在9.6%～40.4%。說(shuō)明了該地區(qū)分離的仔豬致瀉性志賀菌耐藥性嚴(yán)重。應(yīng)該引起重視。與楊永珍等[7]、文英[9]、陳文希等[14]等報(bào)道的有一定的差異性，可能與抗菌藥物使用的頻率有關(guān)，還可能與感染的宿主有關(guān)。因此，當(dāng)仔豬發(fā)生志賀菌腹瀉性疾病時(shí)，應(yīng)該進(jìn)行耐藥性分析，選擇敏感藥物進(jìn)行合理使用，減少耐藥性的產(chǎn)生，提高治療效果，同時(shí)還要注意豬場(chǎng)環(huán)境的消毒。