中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)非小細(xì)胞肺癌專(zhuān)家委員會(huì)

1 引言

肺癌是目前全球最常見(jiàn)、致死率最高的惡性腫瘤[1]。2018年全球肺癌新發(fā)病例近209.4萬(wàn)例，占所有惡性腫瘤的11.6%，死亡病例176.1萬(wàn)例，占所有惡性腫瘤的18.4%[1]。全國(guó)腫瘤登記中心數(shù)據(jù)[2]顯示，2014年我國(guó)新發(fā)肺癌患者數(shù)為78.1萬(wàn)，死亡數(shù)達(dá)到62.6萬(wàn)，居所有惡性腫瘤發(fā)病和死亡人數(shù)首位。17個(gè)癌癥注冊(cè)中心的數(shù)據(jù)[3]分析顯示，我國(guó)肺癌患者的年齡標(biāo)化5年相對(duì)生存率由2003年-2005年的16.1%僅增加至2012年-2015年的19.7%，仍不樂(lè)觀(guān)。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌中最常見(jiàn)的組織學(xué)類(lèi)型，在肺癌病例中占比超過(guò)80%[4]。

隨著對(duì)疾病認(rèn)識(shí)的不斷加深，腫瘤的治療模式也在發(fā)生變革，個(gè)體化精準(zhǔn)治療模式逐漸成為主流。在NSCLC領(lǐng)域，隨著基因檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步和一系列新藥臨床研究的突破，近10年間新發(fā)現(xiàn)的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因不斷增多，推動(dòng)了NSCLC靶向治療藥物的研發(fā)和臨床應(yīng)用。

近年來(lái)興起的免疫治療是腫瘤治療領(lǐng)域的革命性突破。NSCLC的免疫治療研發(fā)和應(yīng)用速度進(jìn)步顯著，目前已有多個(gè)針對(duì)NSCLC患者的免疫治療方案獲批。但如何篩選出可從免疫治療中獲益的人群，仍是該療法在臨床應(yīng)用中的一大挑戰(zhàn)。研究[5]表明，全面的分子生物學(xué)檢測(cè)信息可為肺癌患者免疫治療的方案選擇、預(yù)后判斷，以及為臨床試驗(yàn)入組提供依據(jù)。

在此背景下，傳統(tǒng)基因檢測(cè)方法因基因覆蓋有限，存在漏檢的可能性，以及因組織樣本耗竭而影響后續(xù)檢測(cè)等方面的缺陷，已不能充分滿(mǎn)足目前的臨床需求。因此全面的腫瘤相關(guān)基因檢測(cè)方法則成為提升NSCLC患者治療效果及預(yù)后的有效手段。中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（Chinese Society of Clinical Oncology, CSCO）NSCLC診療指南也提出應(yīng)采用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)多個(gè)驅(qū)動(dòng)基因[6]。美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）NSCLC指南則強(qiáng)烈支持通過(guò)全面分子測(cè)序的結(jié)果，指導(dǎo)臨床治療方案的確定，或納入相關(guān)臨床試驗(yàn)中。其他多個(gè)肺癌診療指南[6-8]也提出了類(lèi)似的建議。

二代基因測(cè)序（next generation sequencing, NGS）又稱(chēng)為高通量測(cè)序，該技術(shù)能夠同時(shí)對(duì)上百萬(wàn)甚至數(shù)十億個(gè)DNA進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)了高通量測(cè)序的目標(biāo)。目前國(guó)外已發(fā)表了多個(gè)NGS檢測(cè)技術(shù)指南，其中頗具影響力的包括EuroGentest和歐盟人類(lèi)遺傳學(xué)會(huì)在2015年聯(lián)合發(fā)布的《二代測(cè)序診斷指南》[9]；美國(guó)分子病理學(xué)會(huì)（Association for Molecular Pathology, AMP）和美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)（College of American Pathologists, CAP）在2017年聯(lián)合發(fā)布的《基于二代測(cè)序的腫瘤panels驗(yàn)證指南》[10]。我國(guó)近年來(lái)也發(fā)表了多個(gè)NGS專(zhuān)家共識(shí)，包括2017年中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)和中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腫瘤病理專(zhuān)業(yè)委員會(huì)聯(lián)合發(fā)布的《臨床分子病理實(shí)驗(yàn)室二代基因測(cè)序檢測(cè)專(zhuān)家共識(shí)》[11]；2018年陸續(xù)發(fā)表了由國(guó)內(nèi)多名專(zhuān)家和機(jī)構(gòu)聯(lián)合撰寫(xiě)的《臨床基因檢測(cè)報(bào)告規(guī)范與基因檢測(cè)行業(yè)共識(shí)探討》[12]、中華醫(yī)學(xué)會(huì)制訂的《二代測(cè)序技術(shù)在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用專(zhuān)家共識(shí)》[13]，以及中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)血液腫瘤專(zhuān)業(yè)委員會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)聯(lián)合制訂的《二代測(cè)序技術(shù)在血液腫瘤中的應(yīng)用中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)（2018年版）》[14]等。

現(xiàn)有的這些NGS指南通常側(cè)重檢驗(yàn)科室的技術(shù)參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，尚缺乏可指導(dǎo)NGS檢測(cè)在實(shí)體瘤臨床診療路徑中應(yīng)用的指南或共識(shí)，然而我國(guó)NSCLC患者數(shù)量龐大，精準(zhǔn)治療藥物的可及性高，全面而準(zhǔn)確的腫瘤基因診斷結(jié)果已經(jīng)成為肺癌醫(yī)師臨床診療的剛需。因此，我們邀請(qǐng)行業(yè)內(nèi)資深專(zhuān)家共同討論并撰寫(xiě)了本共識(shí)，旨在為我國(guó)NSCLC臨床診療規(guī)范使用NGS這一新型基因檢測(cè)技術(shù)提供指引。

2 NGS檢測(cè)的適用人群

2.1 常規(guī)推薦進(jìn)行NGS檢測(cè)的NSCLC患者當(dāng)患者確診為晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC后，就需要考慮進(jìn)行分子病理檢測(cè)，以指導(dǎo)后續(xù)治療和判斷預(yù)后。基于臨床研究中報(bào)道的分子靶向藥物和免疫藥物治療效果，CSCO NSCLC診療指南（2020）推薦對(duì)病理學(xué)診斷為非鱗癌的肺癌患者組織標(biāo)本進(jìn)行分子標(biāo)志物檢測(cè)[6]。

針對(duì)肺鱗癌患者，目前尚無(wú)明確的基因檢測(cè)位點(diǎn)和獲批的分子靶向藥物，也無(wú)臨床證據(jù)支持對(duì)單純肺鱗癌患者常規(guī)進(jìn)行某個(gè)基因變異的檢測(cè)。雖然單純肺鱗癌患者中有4%的表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變率[15]，但尚無(wú)證據(jù)支持肺鱗癌患者使用靶向EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors,TK I）顯著獲益，因此不推薦對(duì)單純肺鱗癌患者進(jìn)行EGFR基因檢測(cè)。而另一方面，研究[16,17]提示病理類(lèi)型是含有腺癌成分或具有腺癌分化的混合鱗癌的NSCLC患者也可能攜帶敏感型突變，可從靶向治療中獲益。一些臨床特征也與敏感型突變相關(guān)，如較年輕、不吸煙或少吸煙（少于100支/年）[7]。因此CSCO NSCLC診療指南（2020）也建議對(duì)不吸煙、經(jīng)小標(biāo)本活檢診斷為肺鱗癌或混合腺癌成分的患者進(jìn)行驅(qū)動(dòng)基因檢測(cè)[6]。

共識(shí) 1：推薦所有病理診斷為肺腺癌、含有腺癌成分的肺癌以及不能分型的晚期新發(fā)或術(shù)后復(fù)發(fā)的NSCLC患者常規(guī)進(jìn)行基因檢測(cè)?！綢級(jí)推薦】

對(duì)經(jīng)小標(biāo)本活檢診斷為含有腺癌成分或具有腺癌分化的混合型鱗癌，以及年輕或不吸煙/少吸煙肺鱗癌患者，也推薦進(jìn)行基因檢測(cè)?！綢I級(jí)推薦】

2.2 NGS和傳統(tǒng)檢測(cè)方法的比較 隨著對(duì)NSCLC發(fā)生發(fā)展機(jī)制認(rèn)識(shí)的逐漸深入，在研的新靶點(diǎn)和治療方案也不斷增多，加上臨床診療需求的不斷拓展，對(duì)NSCLC的腫瘤基因檢測(cè)技術(shù)提出了更高的要求[13]。

目前，在我國(guó)NSC L C的臨床診療過(guò)程中，篩選分子標(biāo)志物所使用的檢測(cè)方法仍以免疫組織化學(xué)檢測(cè)（immunohistochemistry, IHC）、熒光原位雜交檢測(cè)（fluorescencein situhybridization, FISH）和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）等傳統(tǒng)基因檢測(cè)技術(shù)為主。

IHC是利用抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理，檢測(cè)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中特定蛋白質(zhì)表達(dá)量的技術(shù)，與其他技術(shù)檢測(cè)DNA變異有所不同。IHC技術(shù)成熟，成本低廉，但僅能檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)量的改變，并且由于其依賴(lài)于人工判讀，對(duì)于1+/2+的弱陽(yáng)性結(jié)果不能直接確診，需要使用其他方法再次檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證。

FISH是通過(guò)熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交，并在熒光顯微鏡下觀(guān)察并分析基因擴(kuò)增或融合的一種分子遺傳學(xué)分析技術(shù)。FISH是臨床檢測(cè)基因擴(kuò)增和融合的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其操作復(fù)雜，依賴(lài)人工判讀，因此對(duì)診斷醫(yī)生要求較高。同時(shí)，由于FISH需要利用預(yù)先設(shè)定好的探針進(jìn)行雜交，僅能檢測(cè)少數(shù)已知的融合基因，無(wú)法確定和區(qū)分不同的融合配體基因，更無(wú)法發(fā)現(xiàn)新伴侶的融合基因。

PCR和NGS都是檢測(cè)DNA變異的技術(shù)。臨床上最為廣泛應(yīng)用的是擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system, ARMS）-PCR技術(shù)。ARMS-PCR檢測(cè)具有單次檢測(cè)DNA使用量少，靈敏度高（0.1%-0.001%），操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)周期短（幾小時(shí)內(nèi)可出具檢測(cè)報(bào)告），單個(gè)基因/位點(diǎn)的檢測(cè)費(fèi)用較低，可以同時(shí)檢測(cè)數(shù)十個(gè)已知的基因點(diǎn)突變、小片段插入/缺失、部分明確的融合基因等特點(diǎn)。與ARMS-PCR相比，NGS檢測(cè)存在的缺點(diǎn)包括：所需DNA樣本量較高，操作流程復(fù)雜（包含雜交捕獲、建庫(kù)、測(cè)序、數(shù)據(jù)分析、變異注釋等流程），對(duì)于操作人員及操作環(huán)境的要求高，檢測(cè)周期長(zhǎng)（針對(duì)涵蓋基因數(shù)量不同的檢測(cè)panel，需3 d-10 d出報(bào)告），費(fèi)用相對(duì)較高等；但NGS檢測(cè)技術(shù)具有其不可替代的優(yōu)勢(shì)：可以同時(shí)涵蓋數(shù)十至數(shù)百個(gè)基因，檢測(cè)所有位點(diǎn)突變、未知伴侶的融合基因、拷貝數(shù)變異等多種變異類(lèi)型[18]，同時(shí)可評(píng)估腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden, TMB）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability, MSI）等免疫治療相關(guān)分子標(biāo)志物。

傳統(tǒng)基因檢測(cè)方法因臨床可及性高和單次檢測(cè)成本較低而在臨床應(yīng)用廣泛。但與NGS相比，傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)也存在一些技術(shù)缺陷，主要體現(xiàn)在：①通量低，一次只能篩查出有限數(shù)量的基因變異，會(huì)遺漏某些類(lèi)型的基因變異；②不能檢測(cè)未知基因變異；③不能同時(shí)提供TMB和MSI數(shù)據(jù)；④耗竭樣本，影響后續(xù)進(jìn)一步檢測(cè)。尤為重要的是，這類(lèi)檢測(cè)方法可能漏檢少見(jiàn)或罕見(jiàn)的突變，導(dǎo)致“假陰性”結(jié)果，使患者失去精準(zhǔn)治療的機(jī)會(huì)。例如，PCR僅限于分析DNA的點(diǎn)突變、小片段插入/缺失、少數(shù)常見(jiàn)亞型的融合基因檢測(cè)[23]，ARMS-PCR無(wú)法有效檢出EGFR19del某些罕見(jiàn)亞型[19]；ARMS-PCR同樣無(wú)法有效檢出酪氨酸蛋白激酶MET（c-mesenchymal-epithelial transition factor,C-MET）14號(hào)外顯子跳躍突變等罕見(jiàn)基因變異[20]；IHC可檢測(cè)蛋白表達(dá)，但無(wú)法檢測(cè)任何已知或未知的突變[21]；FISH可檢測(cè)拷貝數(shù)變異和重排（融合），但無(wú)法檢測(cè)堿基替換或插入/缺失[22]。

相比傳統(tǒng)基因檢測(cè)方法，NGS檢測(cè)有明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。NGS可以一次性、特定時(shí)間（約10個(gè)工作日）產(chǎn)生覆蓋基因組特定區(qū)域（從數(shù)個(gè)基因到數(shù)百個(gè)基因以至全外顯子組或全基因組）的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)[13]，在臨床診療中有重要的應(yīng)用價(jià)值：①NGS檢測(cè)可同時(shí)檢出多個(gè)基因的點(diǎn)突變、插入/缺失、拷貝數(shù)變異、基因重排四種變異形式，提供全面的基因突變數(shù)據(jù)，為初診晚期NSCLC患者提供精準(zhǔn)用藥指導(dǎo)，包括正確選擇靶向治療方案、協(xié)助判斷是否可使用免疫治療方案、指導(dǎo)臨床試驗(yàn)入組、提供療效預(yù)測(cè)信息等[24]；②避免由于單個(gè)基因序貫檢測(cè)帶來(lái)的樣本耗竭和檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)，更加快速地為患者治療方案選擇提供依據(jù)；③當(dāng)患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展時(shí)再次進(jìn)行全面的基因檢測(cè)，有助于發(fā)現(xiàn)潛在的耐藥機(jī)制，并且全面的基因變異檢測(cè)信息可以為下一步治療方案的選擇提供依據(jù)[24]；④盡管NGS多基因同時(shí)分析的總成本較高，但對(duì)比傳統(tǒng)檢測(cè)方法，單個(gè)基因單個(gè)位點(diǎn)的平均檢測(cè)費(fèi)用已大大下降。

由于NGS技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因所有變異類(lèi)型的特點(diǎn)，因此對(duì)于傳統(tǒng)檢測(cè)方式陰性的患者樣本建議使用NGS復(fù)檢。一項(xiàng)針對(duì)晚期NSCLC患者的回顧性研究[25]數(shù)據(jù)顯示，83%的患者攜帶潛在可用藥的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因突變，其中50%為指南推薦的肺癌可用藥基因變異；在既往傳統(tǒng)單基因檢測(cè)提示EGFR和間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）變異陰性的晚期NSCLC患者中，經(jīng)NGS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)17.4%的患者攜帶至少一個(gè)EGFR或ALK基因變異。另一項(xiàng)研究[26]發(fā)現(xiàn)，基于NGS檢測(cè)篩選出的47例ALK重排陽(yáng)性腫瘤樣本（41例EML4-ALK融合，6例其他融合伴侶），對(duì)有既往FISH檢測(cè)結(jié)果的31例腫瘤樣本進(jìn)行分析，顯示有11例（35%）患者在既往FISH檢測(cè)中為假陰性。這11例患者中有9例基于NGS檢測(cè)結(jié)果接受了克唑替尼治療并實(shí)現(xiàn)臨床獲益。紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心的研究[27]中，研究者對(duì)非NGS技術(shù)檢測(cè)顯示基因變異陰性的31例肺腺癌患者的組織樣本使用FoundationOne?CDx重新進(jìn)行NGS分析，結(jié)果有65%的樣本檢出存在可用藥的基因變異，部分患者基于檢測(cè)結(jié)果接受了已獲批或NCCN指南推薦的靶向藥物治療，并達(dá)到臨床獲益。一項(xiàng)韓國(guó)的研究[28]對(duì)51例采用非NGS檢測(cè)提示EGFR/KRAS（kirsten rat sarcoma viral oncogene）/ALK陰性的肺腺癌樣本分析后發(fā)現(xiàn)，31%的患者存在NCCN指南推薦的可用藥靶點(diǎn)基因變異。由此可見(jiàn)，非NGS技術(shù)檢測(cè)驅(qū)動(dòng)基因變異存在“假陰性”的可能性，因此對(duì)于傳統(tǒng)檢測(cè)方式陰性的患者樣本建議使用NGS復(fù)檢。

共識(shí)2：針對(duì)敏感型突變發(fā)生率高的NSCLC患者（見(jiàn)“共識(shí)1”），常規(guī)基因檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，建議使用中國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration,NMPA）或美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準(zhǔn)的NGS產(chǎn)品進(jìn)行復(fù)檢?！綢II級(jí)推薦】

3 晚期新發(fā)或術(shù)后復(fù)發(fā)NSCLC患者首次進(jìn)行基因檢測(cè)的共識(shí)意見(jiàn)

在過(guò)去20余年間，晚期NSCLC的臨床治療從只有一種針對(duì)EGFR突變的靶向治療方案，發(fā)展至今已有針對(duì)不同驅(qū)動(dòng)基因變異的多種分子靶向治療方案。分子靶向治療已成為驅(qū)動(dòng)基因變異陽(yáng)性肺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療策略之一。另一方面，以程序性死亡受體1（programmed death-1,PD-1）/PD配體1（PD ligand 1, PD-L1）抑制劑等免疫檢查點(diǎn)抑制劑為代表的新型腫瘤免疫療法近年來(lái)在晚期惡性腫瘤治療領(lǐng)域發(fā)展迅速，已成為部分驅(qū)動(dòng)基因陰性的晚期NSCLC患者的重要治療方案之一。與此同時(shí)，基于分子生物學(xué)探索分子靶向治療和免疫治療生物標(biāo)志物，篩選治療優(yōu)勢(shì)人群成為研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外的肺癌診療指南[5,6]也一致推薦對(duì)NSCLC患者進(jìn)行廣泛的分子標(biāo)記物檢測(cè)，并制定了基于檢測(cè)結(jié)果的個(gè)體化精準(zhǔn)診療流程。

3.1 晚期新發(fā)或術(shù)后復(fù)發(fā)NSCLC患者首次進(jìn)行基因檢測(cè)的目標(biāo)范圍推薦 隨著越來(lái)越多針對(duì)NSCLC患者的分子靶向和免疫治療方案的獲批，國(guó)內(nèi)外NSCLC診療指南推薦檢測(cè)的NSCLC驅(qū)動(dòng)基因和生物標(biāo)志物也不斷增加。國(guó)內(nèi)外NSCLC診療指南[5,6]對(duì)不可手術(shù)的III期及IV期NSCLC患者推薦的分子標(biāo)志物檢測(cè)內(nèi)容和相關(guān)個(gè)體化治療策略見(jiàn)表1-表3。

3.2 NSCLC常見(jiàn)驅(qū)動(dòng)基因 考慮到中國(guó)NSCLC患者特有的基因變異頻率、藥物在中國(guó)的獲批適應(yīng)證及藥物可及性，CSCO NSCLC診療指南（2020）明確指出對(duì)不可手術(shù)的晚期NSCLC患者推薦的首次分子標(biāo)志物檢測(cè)內(nèi)容必須包含EGFR、ALK、ROS1（ROS proto-oncogene 1）三個(gè)基因（表1）。EGFR、ALK、ROS1常見(jiàn)變異涵蓋多個(gè)位點(diǎn)及多種變異類(lèi)型，本共識(shí)推薦使用NMPA批準(zhǔn)的檢測(cè)產(chǎn)品，無(wú)論使用PCR、FISH或NGS方法，建議同時(shí)檢測(cè)EGFR突變、ALK融合和ROS1融合三種形式的基因變異。

表 1 國(guó)內(nèi)外肺癌診療指南對(duì)不可手術(shù)Ⅲ期及Ⅳ期患者推薦的首次分子標(biāo)志物檢測(cè)內(nèi)容Tab 1 First-time molecular biomarker testing for advanced NSCLC patients recommended by CSCO and NCCN NSCLC guidelines

表 2 2020版CSCO NSCLC診療指南（2020）對(duì)分子標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的不可手術(shù)Ⅲ期及Ⅳ期患者推薦的一線(xiàn)分子靶向/免疫治療方案[6]Tab 2 First-line therapy for molecular biomarker positive advanced NSCLC patients recommended by CSCO NSCLC guideline[6]

EGFR：EGFR突變是NSCLC驅(qū)動(dòng)基因研究中最早發(fā)現(xiàn)的基因突變，也是NSCLC中最常見(jiàn)的驅(qū)動(dòng)基因變異。東亞患者中EGFR突變的發(fā)生率高達(dá)46.7%，尤其見(jiàn)于腺癌（54.1%）和女性（61.8%）患者[29]。該基因的常見(jiàn)突變位點(diǎn)發(fā)生在18號(hào)-21號(hào)外顯子上，其中最常見(jiàn)的是19號(hào)外顯子缺失突變（19del）以及21號(hào)外顯子L858點(diǎn)突變（L858R），這兩種突變占比約為90%，均為EGFR-TKI敏感型突變[5]。分子生物學(xué)研究揭示了一些EGFR少見(jiàn)突變（發(fā)生率約10%）與EGFR-TKI治療敏感相關(guān)，如19號(hào)外顯子插入、L861Q、G719X、S768I、20號(hào)外顯子插入突變A763_Y764insFQEA；研究[5]還發(fā)現(xiàn)了少見(jiàn)的耐藥突變，如20號(hào)外顯子其他插入類(lèi)型（除A763_Y764insFQEA）和T790M（對(duì)三代TKI敏感）。一項(xiàng)基于FoundationOne?CDx檢測(cè)結(jié)果[30]的數(shù)據(jù)分析，描述了NSCLC中罕見(jiàn)EGFR突變亞型的分布特征，發(fā)現(xiàn)在非L858R/del19的EGFR突變中，20號(hào)外顯子插入突變和G719X突變最為常見(jiàn)。

A LK：A LK基因融合在NSCLC中的發(fā)生率約為7%，EML4是最常見(jiàn)的A LK融合伴侶，占A LK重排的90%-95%[31]。EML4-ALK又分為多個(gè)亞型，其中V1型（E13;A20）和V3型（E6; A20）占比最高，均為32%左右[31]，其他EML4-ALK融合亞型則較為少見(jiàn)（占比均不足10%）[31]。除EML4這一最常見(jiàn)的融合伴侶外，研究[32]還發(fā)現(xiàn)KIF5B、TFG、KLC1、SOCS5、HIP1、TPR、BIRC6等多種罕見(jiàn)的ALK融合伴侶，這些基因變異可能與腫瘤進(jìn)展和治療相關(guān)。不同融合亞型或不同治療方案[33]治療后產(chǎn)生的耐藥突變也存在差異[31]。

ROS1：ROS1融合基因在NSCLC中的發(fā)生率約為2%[5]，重排位點(diǎn)主要發(fā)生在32號(hào)-36號(hào)外顯子[34]，最常見(jiàn)的ROS1融合伴侶是CD74、SLC34A2、CCDC6和FIG[5]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)了更多的新型ROS1融合伴侶，如基于FoundationOne?CDx檢出的罕見(jiàn)的新型TPD52L1-ROS1融合[35]和TMEM106B-ROS1融合[36]。

共識(shí)3：針對(duì)晚期新發(fā)或術(shù)后復(fù)發(fā)的NSCLC患者，首次檢測(cè)建議采用NMPA批準(zhǔn)的檢測(cè)產(chǎn)品，檢測(cè)至少包括NSCLC常見(jiàn)驅(qū)動(dòng)基因: EGFR突變（應(yīng)涵蓋18號(hào)、19號(hào)、20號(hào)、21號(hào)外顯子），以及ALK融合、ROS1融合。【I級(jí)推薦】

3.3 NSCLC少見(jiàn)驅(qū)動(dòng)基因 除了上述常見(jiàn)EGFR突變、ALK融合、ROS1融合外，雖然BRAF（B-Raf proto-oncogene）、KR AS、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體酪氨酸激酶（neurotrophic tyrosine receptor kinase,NTRK）1/2/3、MET、ERBB2（receptor tyrosine-protein kinase erbB-2）和RET（ret protooncogene）等基因在NSCLC中的變異頻率相對(duì)較低，但由于其已有對(duì)應(yīng)獲批或在研的靶向治療藥物，成為NSCLC患者潛在的可靶向治療基因。雖然目前國(guó)內(nèi)相關(guān)靶向藥物的可及性較低，但具有前瞻性臨床應(yīng)用價(jià)值，應(yīng)重視對(duì)這些靶點(diǎn)的檢出。2020版CSCO NSCLC診療指南也推薦在廣泛分子標(biāo)志物檢測(cè)中納入這些少見(jiàn)驅(qū)動(dòng)基因[6]?？紤]到上述少見(jiàn)肺癌驅(qū)動(dòng)基因并非全部含有NMPA批準(zhǔn)的傳統(tǒng)檢測(cè)產(chǎn)品（IHC、FISH、PCR等），并且NMPA批準(zhǔn)的NGS檢測(cè)產(chǎn)品（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站https://www.nmpa.gov.cn/）也無(wú)法涵蓋上述全部基因的變異類(lèi)型，本共識(shí)建議結(jié)合患者實(shí)際臨床情況，優(yōu)先使用NMPA批準(zhǔn)的傳統(tǒng)或NGS檢測(cè)產(chǎn)品，在NMPA批準(zhǔn)的檢測(cè)產(chǎn)品無(wú)法滿(mǎn)足臨床需求的情況下可以考慮使用FDA批準(zhǔn)的NGS檢測(cè)產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，建議檢測(cè)包括BRAFV600E、KRAS（如G12C等）、NTRK1/2/3融合、MET14號(hào)外顯子跳躍突變和MET擴(kuò)增、ERBB220號(hào)外顯子插入、RET融合等少見(jiàn)驅(qū)動(dòng)基因。

BRAF：2%-4%的NSCLC患者攜帶BRAF突變[37]。BRAF突變分為3種類(lèi)型，I類(lèi)（BRAFV600E/K/D/R/M）突變是最常見(jiàn)于NSCLC的BRAF突變，NCCN指南[5]推薦的靶向藥物為達(dá)拉菲尼和曲美替尼。II類(lèi)、III類(lèi)BRAF突變患者腦轉(zhuǎn)移發(fā)生率高，共突變發(fā)生率高，暫無(wú)確定的靶向治療方案，并且患者預(yù)后通常較差[37]。

K R AS：K R AS是NSCLC的一個(gè)重要驅(qū)動(dòng)基因，10.1%的東亞NSCLC患者攜帶這一突變[29]。KRAS突變型NSCLC患者EGFR-TKI療效不佳，預(yù)后較差[5]。由于KRAS突變類(lèi)型多，下游信號(hào)通路復(fù)雜，既往的靶向藥物研究均宣告失敗，目前并無(wú)推薦的靶向藥物[6]。KRASG12C是一個(gè)潛在可用藥靶點(diǎn)。NSCLC患者中約20%的KRAS突變?yōu)镵RASG12C突變。目前針對(duì)這一突變類(lèi)型的靶向藥物雖然尚未獲批，但兩個(gè)KRASG12C抑制劑——AMG510[38]和MRTX849[39]已在臨床前和初期臨床試驗(yàn)中顯示出良好的治療效果。從2019年ASCO大會(huì)上發(fā)布的AMG510 I期臨床研究數(shù)據(jù)來(lái)看，這一KRASG12C不可逆抑制劑在NSCLC患者中的療效和安全性均表現(xiàn)良好[40]。

表 3 NCCN指南中對(duì)于其他相對(duì)少見(jiàn)基因變異型NSCLC患者推薦的靶向/免疫治療方案（在我國(guó)相關(guān)藥物適應(yīng)證尚未獲批）[5]Tab 3 Appropriate treatment options for other molecular biomarker positive patients recommended by NCCN NSCLC guidelines[5]

NTRK：NTRK基因包括NTRK1/2/3三種亞型，分別編碼TRK A/B/C蛋白。NTRK基因發(fā)生融合激活后，將引發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，驅(qū)動(dòng)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。雖然NTR K融合在肺癌患者中的發(fā)生率較低（＜1%-5%）[41]，但基于NGS檢出的NTR K融合肺癌患者在兩個(gè)泛TRK抑制劑——恩曲替尼（Enctrectinib）[42]和拉羅替尼（Larotrectinib）[43]的關(guān)鍵籃子研究（basket trial）中均獲得顯著臨床獲益?；谶@兩項(xiàng)研究結(jié)果，CSCO NSCLC診療指南（2020）將這兩個(gè)NTRK抑制劑推薦用于治療NTRK基因融合陽(yáng)性的NSCLC患者[6]。

MET：c-MET是NSCLC的重要驅(qū)動(dòng)基因，c-MET通路異常激活主要包括MET14號(hào)外顯子跳躍突變、MET擴(kuò)增和MET蛋白過(guò)表達(dá)3種類(lèi)型。MET14號(hào)外顯子跳躍突變?cè)诜蜗侔┲械陌l(fā)生率約為3%，是重要的原發(fā)致癌驅(qū)動(dòng)基因變異[44]。MET擴(kuò)增在NSCLC中的發(fā)生率為3%-7%[45]，是三代EGFR-TKI的重要耐藥機(jī)制之一[46]?；谂R床研究[47,48]，NCCN指南推薦克唑替尼用于治療MET高水平擴(kuò)增或MET14號(hào)外顯子跳躍突變的NSCLC患者[5]。此外，已有多個(gè)靶向治療方案在臨床研究中顯示對(duì)MET擴(kuò)增NSCLC有治療活性[49-52]。針對(duì)MET14號(hào)外顯子跳躍突變晚期NSCLC患者的多個(gè)新藥也已處于臨床研究階段[53-55]。

ERBB2（HER2）：HER2突變?cè)贜SCLC中以酪氨酸激酶域的18號(hào)-21號(hào)外顯子突變較多，發(fā)生率約為2%-4%[56-58]。在臨床研究中顯示對(duì)HER2突變型NSCLC有治療活性的藥物包括曲妥珠單抗-美坦新偶聯(lián)物（Trastuzumab Emtansine,T-DM1）[59]、Trastuzumab Deruxtecan（T-DXd、DS-8021）[60]、吡咯替尼[61]、波奇替尼[62]、曲妥珠單抗[63]、阿法替尼[64]和Neratinib[65]等。曲妥珠單抗和阿法替尼單藥方案既往曾被推薦用于HER2突變陽(yáng)性的NSCLC患者，但因?yàn)橹委熡行实?，證據(jù)級(jí)別較低而不再推薦?；谝豁?xiàng)II期籃子研究結(jié)果[59]，NCCN指南目前推薦T-DM1用于治療HER2突變陽(yáng)性的NSCLC患者[5]。

RET：RET融合在NSCLC中的發(fā)生率約為2%[66]，變異類(lèi)型主要包括與KIF5B、TRIM33、CCDC6和NCOA4等基因發(fā)生融合，以及M918T等位點(diǎn)的點(diǎn)突變。NCCN指南目前推薦多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑卡博替尼和Vandetanib用于治療RET融合突變陽(yáng)性NSCLC患者[5]。但從目前的數(shù)據(jù)來(lái)看，卡博替尼[67,68]和Vandetanib[69]對(duì)RET靶點(diǎn)的治療效果并不理想。正在開(kāi)展的臨床研究中，阿來(lái)替尼[70]、多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑［侖伐替尼[71]、RXDX-105[72]、Pralsenitinib（BLU-667）[73]］、RET單靶點(diǎn)抑制劑Selpercatinib（LOXO-292）[74]的臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)值得期待。

共識(shí)4：針對(duì)晚期新發(fā)或術(shù)后復(fù)發(fā)的NSCLC患者，結(jié)合患者實(shí)際臨床情況，如需獲得更多的潛在靶點(diǎn)信息，首次檢測(cè)建議采用NMPA或FDA批準(zhǔn)的檢測(cè)產(chǎn)品，檢測(cè)包括BRAF V600E、KRAS（如G12C等）、NTRK1/2/3融合、MET 14號(hào)外顯子跳躍突變和MET擴(kuò)增、ERBB2 20號(hào)外顯子插入、RET融合等少見(jiàn)驅(qū)動(dòng)基因變異?！綢I級(jí)推薦】

3.4 NSCLC常見(jiàn)/少見(jiàn)驅(qū)動(dòng)基因的罕見(jiàn)變異形式 隨著NGS檢測(cè)技術(shù)在NSCLC臨床診療中應(yīng)用的普及，也推動(dòng)了NSCLC驅(qū)動(dòng)基因研究的迅猛發(fā)展，越來(lái)越多常見(jiàn)/少見(jiàn)驅(qū)動(dòng)基因的罕見(jiàn)變異形式被揭示與患者的臨床療效密切相關(guān)。腫瘤分子標(biāo)志物研究的目的是為了使越來(lái)越多的患者獲益于個(gè)體化治療。因此，即使攜帶罕見(jiàn)基因變異類(lèi)型的NSCLC患者人群較少，且多為個(gè)案報(bào)告，但仍需重視其檢測(cè)，以增加更多患者獲得精準(zhǔn)治療的機(jī)會(huì)，同時(shí)也為肺癌新藥的研發(fā)提供證據(jù)支持。

EGFR激酶區(qū)串聯(lián)重復(fù)（kinase domain duplication,KDD）和融合：EGFRKDD在肺癌中發(fā)生率約為0.07%，對(duì)阿法替尼、埃克替尼等EGFR-TKI治療敏感[75,76]；EGFR融合在肺癌中的發(fā)生率為0.08%，一系列EGFR融合變異（已報(bào)告的有EGFR-RAD51、EGFR-PURB、EGFR-SEPT14、EGFR-TNS3、EGFR-ZCCHC6、LINCO1446-EGFR）可以從厄洛替尼、阿法替尼、?？颂婺嶂委熤蝎@益[77]。

BRAFKDD和融合：NSCLC中BRAFKDD和BRAF融合的發(fā)生率不到0.5%[78,79]。個(gè)案報(bào)告[79]顯示，攜帶BRAFKDD的NSCLC患者接受BRAF-TKI治療有效。其他癌種的個(gè)案報(bào)告提示，針對(duì)不同BRAF融合基因使用個(gè)體化靶向治療方案可使患者獲益[80,81]。

METKDD和融合：METKDD和融合在中國(guó)NSCLC患者中的發(fā)生率分別為0.09%[79]和0.04%[82]。攜帶METKDD的NSCLC患者對(duì)MET-TKI治療有反應(yīng)[80]。國(guó)內(nèi)外多個(gè)個(gè)案報(bào)告[76,82-84]顯示，攜帶MET融合的NSCLC患者使用克唑替尼治療有效。

ERBB2（HER2）融合：分析數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)NSCLC患者中ERBB2融合的發(fā)生率為0.29%。部分患者使用阿法替尼治療有效[85]。

共識(shí)5：共識(shí)3和共識(shí)4中基因檢測(cè)均為陰性的NSCLC患者再次檢測(cè)時(shí)，建議采用NMPA或FDA批準(zhǔn)的NGS產(chǎn)品，檢測(cè)包含EGFR罕見(jiàn)變異形式（包括激酶區(qū)重復(fù)和融合）、BRAF罕見(jiàn)變異形式（包括激酶區(qū)重復(fù)和融合）、MET罕見(jiàn)變異形式（包括激酶區(qū)重復(fù)和融合）、ERBB2融合等罕見(jiàn)變異形式?！綢II級(jí)推薦】

3.5 免疫治療療效及預(yù)后生物標(biāo)志物 近年來(lái)，以PD-1/PD-L1抑制劑等免疫檢查點(diǎn)抑制劑為代表的免疫療法進(jìn)入臨床應(yīng)用，是肺癌治療領(lǐng)域的一大里程碑事件。免疫療法很大程度地改善了晚期NSCLC患者的生存預(yù)后，且療效持久。但免疫療法在未經(jīng)選擇的人群中有效率偏低，如PD-1/PD-L1抑制劑單藥用于NSCLC的應(yīng)答率僅為25%[86]。因此尋找合適的分子標(biāo)志物以篩選優(yōu)勢(shì)人群，是實(shí)現(xiàn)免疫治療精準(zhǔn)化的關(guān)鍵。

回顧性分析[87]提示，攜帶明確驅(qū)動(dòng)基因變異的NSCLC患者傾向于表現(xiàn)為冷腫瘤的免疫微環(huán)境特征，即免疫治療效果并不理想。CSCO NSCLC診療指南（2020）也將肺癌免疫治療的人群限制為無(wú)驅(qū)動(dòng)基因變異的患者[6]。IASLC（International Association for the Study of Lung Cancer）專(zhuān)家共識(shí)則特別強(qiáng)調(diào)，在存在可用藥致癌驅(qū)動(dòng)基因變異的腫瘤中，必須禁止前期使用免疫檢查點(diǎn)抑制劑，對(duì)于晚期患者，在沒(méi)有獲得常規(guī)基因組信息（EGFR、ALK、ROS1和BRAF）的情況下，不應(yīng)該使用免疫檢查點(diǎn)抑制劑[87]。

目前進(jìn)入臨床實(shí)踐的免疫治療生物標(biāo)志物有PD-L1高表達(dá)、錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷（mismatch repairdeficient, dMMR）/微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定性（high-frequency microsatellite instability, MSI-H），以及高腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden-high, TMB-H）。PD-L1高表達(dá)（≥50%）是目前NSCLC一線(xiàn)免疫單藥治療唯一獲批的分子標(biāo)志物。但由于腫瘤異質(zhì)性以及缺乏“金標(biāo)準(zhǔn)”檢測(cè)方法，加之免疫組化檢測(cè)方法本身的檢測(cè)敏感性差異問(wèn)題，PD-L1檢測(cè)目前僅在部分腫瘤適應(yīng)證中作為使用特定藥物的臨床分子標(biāo)志物[87]。dMMR/MSI-H是獲FDA批準(zhǔn)、不限組織學(xué)類(lèi)型的免疫治療生物標(biāo)志物[88]。FDA也已批準(zhǔn)了針對(duì)MSI-H腫瘤的免疫治療方案[88]。但由于dMMR/MSI-H在肺癌患者中的發(fā)生頻率較低，其在肺癌免疫治療中的臨床應(yīng)用價(jià)值仍需更多研究探索。

TMB作為預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的潛在標(biāo)志物已逐漸進(jìn)入臨床應(yīng)用。已有研究表明，組織腫瘤突變負(fù)荷高（tissue TMB, tTMB）與NSCLC免疫治療總體生存率（overall survival, OS）獲益有相關(guān)性[89,90]，結(jié)合PD-L1和TMB可以更好地預(yù)測(cè)NSCLC患者的免疫治療療效[91]。基于兩項(xiàng)III期研究結(jié)果[92,93]，NCCN指南推薦TMB作為新的生物標(biāo)志物，用于篩選納武利尤單抗聯(lián)合伊匹單抗方案和納武利尤單抗單藥治療方案的優(yōu)勢(shì)人群[5]。基于II期KEYNOTE-158研究數(shù)據(jù)，美國(guó)FDA近期已批準(zhǔn)帕博利珠單抗用于TMB-H（≥10個(gè)突變/兆堿基）、既往治療后病情進(jìn)展且無(wú)滿(mǎn)意替代治療方案的不可手術(shù)切除或轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤患者[94]。此外，為克服組織樣本檢測(cè)的局限性，血液TMB（blood TMB, bTMB）檢測(cè)的應(yīng)用逐漸廣泛，從POPLAR和OAK研究[95]，再到B-FIRST[96]、BFAST研究，都顯示出bTMB預(yù)測(cè)免疫治療療效的潛力。但由于多家基因檢測(cè)公司檢測(cè)TMB時(shí)使用的panel所涵蓋的基因不同，探針覆蓋的基因位置和范圍不同（基因全長(zhǎng)覆蓋或熱點(diǎn)區(qū)域覆蓋），設(shè)定的cut-off值也不同，所以TMB檢測(cè)目前仍無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)化，從而限制了其廣泛應(yīng)用于臨床。

此外，已有一些研究發(fā)現(xiàn)，某些基因變異與免疫治療效果密切相關(guān)，如KRAS突變和TP53突變的腫瘤可能有更好的免疫療效[97]；抑癌基因STK11缺失突變則可能造成免疫治療的療效不佳[98]。一系列早期研究中顯示，一些罕見(jiàn)基因突變可能與腫瘤免疫原性升高有關(guān)，如MUC16突變、MET14號(hào)外顯子突變、BRCA1/2突變、POLE突變、POLD1突變和MSH2突變[99]，但其臨床效用仍需大樣本的臨床研究進(jìn)一步探索。研究[100,101]發(fā)現(xiàn)，有9%-29%的患者在接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療中出現(xiàn)了超進(jìn)展（hyperprogression, HP）現(xiàn)象，這部分患者一般預(yù)后極差，中位生存時(shí)間僅2個(gè)月-5個(gè)月。目前發(fā)現(xiàn)MDM2/MDM4擴(kuò)增、EGFR擴(kuò)增和位于11q13位點(diǎn)的一些基因如CCND1、FGF3、FGF4和FGF19等擴(kuò)增與HP存在相關(guān)性，推測(cè)這些基因變異可能是預(yù)測(cè)HP的標(biāo)志物[102]。一系列與免疫治療預(yù)后相關(guān)的新興生物標(biāo)志物也在持續(xù)探索中，如腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes, TIL）、DNA損傷修復(fù)（DNA damage repair, DDR）通路基因變異、外泌體中特定蛋白的檢測(cè)、DNA甲基化、腸道菌群等。

共識(shí)6：結(jié)合患者實(shí)際臨床情況，如需獲取免疫治療相關(guān)的分子標(biāo)志物信息，晚期新發(fā)或術(shù)后復(fù)發(fā)的NSCLC患者，建議采用NMPA或FDA批準(zhǔn)的NGS產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)包含MSI、tTMB、免疫治療正負(fù)向相關(guān)基因和免疫治療超進(jìn)展相關(guān)基因在內(nèi)的免疫治療相關(guān)分子標(biāo)志物?！綢II級(jí)推薦】

3.6 NGS檢測(cè)平臺(tái)的選擇 為了協(xié)助臨床合理使用不斷革新的治療策略，理想的NGS檢測(cè)平臺(tái)應(yīng)能夠：①單次檢測(cè)就能發(fā)現(xiàn)與臨床治療相關(guān)基因的所有類(lèi)型變異，包括點(diǎn)突變、插入/缺失、拷貝數(shù)變異、基因重排；②覆蓋的檢測(cè)范圍廣泛，可提供TMB、MSI等重要免疫治療分子標(biāo)志物；③所需樣本少；④檢測(cè)周期短。為了保證臨床實(shí)踐的準(zhǔn)確性，NGS檢測(cè)結(jié)果必須保證檢測(cè)流程的穩(wěn)定，包含目標(biāo)區(qū)域富集方法、測(cè)序數(shù)據(jù)量、生物信息學(xué)分析流程等一系列可能影響結(jié)果準(zhǔn)確性的因素[13]。

NGS 技術(shù)包括全基因組測(cè)序（whole genome sequencing, WGS）、全外顯子組測(cè)序（whole exome sequencing, WES）、熱點(diǎn)基因變異的NGS小/大panel檢測(cè)以及全面基因組（comprehensive genomic profiling, CGP）檢測(cè)等。由于WGS和WES檢測(cè)覆蓋的基因范圍過(guò)于廣泛，納入了大量與腫瘤不相關(guān)的基因，引起檢測(cè)周期延長(zhǎng)、成本上升，進(jìn)而引起檢測(cè)深度不足而造成的敏感性下降，加上無(wú)法或極少涵蓋與腫瘤發(fā)生發(fā)展或治療密切相關(guān)的融合基因內(nèi)含子區(qū)域，其應(yīng)用偏向于科研，無(wú)法在臨床廣泛應(yīng)用[103]。

目前國(guó)內(nèi)外獲批用于NSCLC的NGS檢測(cè)方法有熱點(diǎn)基因變異NGS檢測(cè)和全面基因組CGP檢測(cè)兩種。腫瘤熱點(diǎn)基因變異NGS panel的檢測(cè)范圍一般僅局限于發(fā)生頻率較高的特定基因[104]，僅檢測(cè)少數(shù)目標(biāo)基因的特定區(qū)域（即已被證實(shí)有與高致癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的區(qū)域）[105]，并且無(wú)法檢測(cè)所有的基因變異類(lèi)型[19]。我國(guó)已獲批用于NSCLC患者檢測(cè)的NGS產(chǎn)品均為熱點(diǎn)基因檢測(cè)[106]。CGP檢測(cè)要求至少覆蓋300個(gè)以上與腫瘤用藥、預(yù)后密切相關(guān)基因的全外顯子區(qū)域；覆蓋臨床意義明確的熱點(diǎn)融合基因的內(nèi)含子區(qū)域；包含TMB、MSI檢測(cè)；并可以準(zhǔn)確評(píng)估所有基因的拷貝數(shù)變化（copy number variation, CNV）。

C G P 檢測(cè)目前已經(jīng)獲得F D A 批準(zhǔn)的包括FoundationOne?CDx和MSK-IMPACTTM。FoundationOne?CDx是FDA批準(zhǔn)的首個(gè)NGS泛癌種伴隨診斷產(chǎn)品，基于雜交捕獲技術(shù)，覆蓋包括309個(gè)基因的全部外顯子以及34個(gè)常見(jiàn)重排基因的特定內(nèi)含子，一次檢測(cè)即可提供324個(gè)腫瘤相關(guān)基因的四種變異信息，有效測(cè)序深度達(dá)到500X以上，可檢出腫瘤驅(qū)動(dòng)基因的罕見(jiàn)變異形式，同時(shí)還能提供TMB和MSI數(shù)據(jù)[107]。FoundationOne?CDx是目前唯一一個(gè)經(jīng)過(guò)分析驗(yàn)證[108]和臨床驗(yàn)證[93,109,110]的泛癌種伴隨診斷產(chǎn)品。MSK-IMPACTTM是第一個(gè)經(jīng)FDA批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的腫瘤基因組補(bǔ)充診斷產(chǎn)品，MSK-IMPACTTM同樣也是基于雜交捕獲技術(shù)，一次檢測(cè)可提供468個(gè)腫瘤相關(guān)基因的兩種基因變異類(lèi)型（堿基替換和插入/缺失）。

FDA批準(zhǔn)上市應(yīng)用于臨床診斷尤其是伴隨診斷的檢測(cè)方法，對(duì)其分析驗(yàn)證及臨床驗(yàn)證兩方面均有嚴(yán)格要求[111]。分析驗(yàn)證主要驗(yàn)證檢測(cè)技術(shù)的方法學(xué)以確認(rèn)分析性能。CGP檢測(cè)由于其覆蓋范圍廣、分析過(guò)程復(fù)雜等特點(diǎn)，目前主要以突變類(lèi)型區(qū)分或以臨床意義明確的關(guān)鍵基因或位點(diǎn)為代表，對(duì)細(xì)胞系和臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，與已經(jīng)獲批的PCR、FISH等產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行一致性分析，給出相應(yīng)的準(zhǔn)確性（包含敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值）和精確度（包括可重復(fù)性、可再現(xiàn)性、檢出下限）等方法學(xué)參數(shù)[112]。而基于突變?cè)谀[瘤發(fā)生發(fā)展中的復(fù)雜生物學(xué)機(jī)制，在方法學(xué)可靠的基礎(chǔ)上，更需要關(guān)鍵性的臨床驗(yàn)證來(lái)確定Cut-off值、臨床敏感性與特異性，從而進(jìn)一步保證檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)下的用藥能真正實(shí)現(xiàn)患者的臨床獲益[10]。對(duì)于一些發(fā)展較成熟的突變標(biāo)志物，例如EGFR基因突變，臨床驗(yàn)證常采用非劣效性測(cè)試進(jìn)行基因變異檢測(cè)一致性及相對(duì)應(yīng)藥物療效相關(guān)性的回顧性分析。而對(duì)于不斷涌現(xiàn)的新靶點(diǎn)標(biāo)志物的檢測(cè)，尤其是沒(méi)有對(duì)應(yīng)的PCR、FISH、IHC等傳統(tǒng)檢測(cè)方法獲批的分子標(biāo)志物，前瞻性臨床研究數(shù)據(jù)不可或缺。FoundationOne?CDx的TMB檢測(cè)正是基于其參與的多項(xiàng)II期/III期的免疫治療藥物臨床研究[92-94]的療效數(shù)據(jù)，成為目前唯一一個(gè)經(jīng)過(guò)分析驗(yàn)證[108]和臨床驗(yàn)證[106-108]的泛癌種伴隨診斷產(chǎn)品。同樣，bTMB與Atezolizumab療效的相關(guān)性在通過(guò)對(duì)POPLAR和OAK試驗(yàn)的回顧性檢測(cè)得到初步臨床驗(yàn)證后，又在NSCLC患者中開(kāi)展前瞻性的B-FIRST研究及前瞻性BFAST傘式研究來(lái)進(jìn)一步臨床驗(yàn)證[95,96]。

目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)已經(jīng)獲批的CGP檢測(cè)Panel，但已有幾家國(guó)內(nèi)基因檢測(cè)公司向NMPA提交了腫瘤NGS檢測(cè)大Panel的注冊(cè)，相信經(jīng)過(guò)分析驗(yàn)證與臨床驗(yàn)證的CGP檢測(cè)Panel在中國(guó)獲批后，會(huì)為中國(guó)肺癌患者帶來(lái)更廣泛的臨床獲益。

考慮到藥物可及性等因素，晚期NSCLC患者的首次分子標(biāo)志物檢測(cè)建議使用NMPA或FDA批準(zhǔn)的檢測(cè)方法進(jìn)行。使用非NGS的檢測(cè)方法，可能會(huì)造成組織樣本耗竭進(jìn)而導(dǎo)致無(wú)法再進(jìn)行后續(xù)基因檢測(cè)，進(jìn)而使患者錯(cuò)失潛在的靶向治療機(jī)會(huì)。紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心的研究發(fā)現(xiàn)[27]，在非NGS檢測(cè)提示驅(qū)動(dòng)基因變異陰性的NSCLC患者中，有34%的患者在組織耗竭的情況下不適合或拒絕再次穿刺活檢。而CGP可節(jié)省序貫單基因測(cè)序或熱點(diǎn)基因變異檢測(cè)可能帶來(lái)的樣本/時(shí)間/成本消耗[24]。由此我們認(rèn)為，在患者有意愿獲取最為全面的基因變異信息的情況下，晚期NSCLC患者首次基因檢測(cè)應(yīng)使用經(jīng)過(guò)NMPA或FDA批準(zhǔn)的針對(duì)腫瘤基因的CGP NGS檢測(cè)方法，這一點(diǎn)對(duì)于腫瘤樣本量少的患者尤其重要。但同時(shí)也應(yīng)當(dāng)了解NGS的應(yīng)用局限性，如受樣本取材或探針設(shè)計(jì)等因素影響或限制，NGS在某些變異類(lèi)型如拷貝數(shù)擴(kuò)增的檢測(cè)方面存在一定的局限性。對(duì)于NGS方法可能無(wú)法準(zhǔn)確檢出的部分基因變異，應(yīng)考慮采用可靠的單基因檢測(cè)方法對(duì)NGS檢出的變異進(jìn)行驗(yàn)證[113]。

共識(shí)7：在條件允許的情況下，如患者有意愿獲取最為全面的基因變異信息，晚期新發(fā)或術(shù)后復(fù)發(fā)的NSCLC患者，首次基因檢測(cè)可以自行選擇NMPA或FDA批準(zhǔn)的CGP NGS檢測(cè)產(chǎn)品，在全面了解腫瘤基因組信息的基礎(chǔ)上制訂一線(xiàn)治療方案?！綢I級(jí)推薦】

3.7 NGS液體活檢可以作為組織檢測(cè)的重要補(bǔ)充 腫瘤組織樣本的基因檢測(cè)在臨床實(shí)際應(yīng)用中仍存在諸多限制，包括取樣操作的有創(chuàng)性、組織樣本有限或耗竭、腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性而導(dǎo)致采樣偏差[114,115]、無(wú)法針對(duì)所有轉(zhuǎn)移灶取樣[116]、可能因腫瘤位置特殊而無(wú)法取樣[115]、無(wú)法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤變化[117]等。

近年來(lái)，液體活檢技術(shù)的發(fā)展為腫瘤患者提供了一種非侵入性取材的檢測(cè)路徑。液體活檢是指標(biāo)志物的收集和分析來(lái)自于各種體液，如血液、尿、痰、腦脊液和胸腔積液等。這些標(biāo)志物可以是循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC、cfDNAs、cfRNAs、循環(huán)外泌體、蛋白質(zhì)及其他代謝物等[118]。

目前從血清上清液或者血漿中提取ctDNA的液體活檢技術(shù)相對(duì)成熟[119]，且大量的臨床研究證實(shí)了血液樣本中的ctDNA檢測(cè)可評(píng)估腫瘤的復(fù)發(fā)、耐藥和轉(zhuǎn)移[120]。有研究[121,122]證實(shí)，治療后ctDNA是否清零可以評(píng)估療效，ctDNA的上升也可以提前預(yù)示病情進(jìn)展。此外，為克服組織樣本檢測(cè)的局限性，bTMB檢測(cè)的應(yīng)用逐漸廣泛，從POPLAR和OAK研究[95]，再到B-FIRST[96]、BFAST研究，都顯示出bTMB預(yù)測(cè)免疫治療療效的潛力。相比組織樣本檢測(cè)，血液樣本檢測(cè)可簡(jiǎn)化采樣流程；可多次采樣，進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控；減少采樣偏差；降低取樣創(chuàng)傷和患者死亡率[123]。

除了血液ctDNA檢測(cè)外，使用腦脊液（cerebrospinal fluid, CSF）和胸腔積液（malignant pleural effusion, MPE）進(jìn)行液體活檢的研究也越來(lái)越多。有研究[124]表明，對(duì)于腦轉(zhuǎn)移患者，血漿ctDNA的檢出率僅有50%左右，CSF中非腫瘤來(lái)源的DNA含量低，更容易檢測(cè)到突變。尤其是在腦膜轉(zhuǎn)移的患者中，CSF ctDNA體現(xiàn)出比血液ctDNA更優(yōu)的檢測(cè)性能[125,126]。但由于CSF的獲取方式為微創(chuàng)手術(shù)，如何篩選應(yīng)進(jìn)行CSF檢測(cè)的人群也是臨床必須考慮的問(wèn)題。基于最大轉(zhuǎn)移灶直徑和全部轉(zhuǎn)移灶距離中樞神經(jīng)距離的評(píng)分系統(tǒng)，可以將非腦膜轉(zhuǎn)移的腦轉(zhuǎn)移患者的腦脊液CSF ctDNA陽(yáng)性檢出率從59.09%提高至81.81%[127]。此外，也有報(bào)道[125-129]指出腦脊液中可發(fā)現(xiàn)更多獲得性耐藥基因突變。胸腔積液也是可用于NGS液體活檢的可靠標(biāo)本[130,131]。有研究者[132]認(rèn)為，在對(duì)于胸膜和腹膜受累患者進(jìn)行基因突變檢測(cè)時(shí)，更靠近轉(zhuǎn)移部位的液體（胸腔積液和胸腹水）要優(yōu)于血液，并且可以在常規(guī)臨床實(shí)踐中對(duì)這些“非血液”液體進(jìn)行基因檢測(cè)，以選擇具有特定轉(zhuǎn)移部位的癌癥患者的抗腫瘤治療藥物。值得注意的是，由于目前其他液體標(biāo)本仍缺乏大樣本量的基因變異類(lèi)型與臨床靶向治療療效相關(guān)性的前瞻性研究，臨床中廣泛應(yīng)用的ctDNA檢測(cè)仍然集中于血液標(biāo)本。

盡管液體活檢有利于克服腫瘤異質(zhì)性并實(shí)現(xiàn)基因變異圖譜實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，但由于體液中ctDNA含量極低，同時(shí)具有高度片段化、半衰期較短的特點(diǎn)，并且ctDNA的釋放受腫瘤類(lèi)型、分期、轉(zhuǎn)移灶的部位等多種因素影響[133,134]，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。ctDNA的特點(diǎn)也對(duì)樣本處理提出了更為嚴(yán)格的要求，并對(duì)靈敏度和特異性的要求更高，否則可能會(huì)引起假陰性的結(jié)果。

雖然目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)臨床獲得NMPA或FDA批準(zhǔn)的用于ctDNA檢測(cè)NGS產(chǎn)品，也無(wú)成熟的液體ctDNA檢測(cè)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。但2019年3月，第一款腫瘤NGS液體活檢產(chǎn)品Personal Genome Diagnostics（PGDx）公司的ElioTMPlasma Resolve經(jīng)歐盟批準(zhǔn)上市，彌補(bǔ)了腫瘤基因檢測(cè)市場(chǎng)上僅有NGS組織活檢產(chǎn)品的不足，同時(shí)也宣告NGS液體活檢正式進(jìn)入臨床應(yīng)用。2020年8月7日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了第一個(gè)液體活檢伴隨診斷試劑盒，來(lái)自Guardant Health公司的包含55個(gè)基因的Guardant 360 CDx用于識(shí)別攜帶EGFR基因突變的轉(zhuǎn)移性NSCLC患者，以幫助確定可以從奧希替尼治療中獲益的患者。隨后，在8月26日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了首個(gè)基于液體活檢的CGP伴隨診斷產(chǎn)品Foundation Medicine公司的FoundationOne?liquid CDx（F1LCDx）。F1LCDx經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的技術(shù)驗(yàn)證和臨床驗(yàn)證，可以全面準(zhǔn)確識(shí)別324個(gè)基因的四種變異類(lèi)型（點(diǎn)突變、插入/缺失、拷貝數(shù)變異和基因重排），且是首個(gè)同時(shí)提供免疫治療相關(guān)生物標(biāo)志物bMSI/bTMB以及評(píng)估ctDNA含量的伴隨診斷產(chǎn)品。

由于國(guó)內(nèi)目前暫未獲批基于液體活檢的NGS產(chǎn)品，CSCO NSCLC診療指南（2020）仍建議針對(duì)NSCLC患者的基因檢測(cè)，首選組織檢測(cè)，只有在組織標(biāo)本量不足或者組織不可及的情況下，可以選擇液體活檢作為補(bǔ)充手段。

共識(shí)8：晚期新發(fā)或術(shù)后復(fù)發(fā)的NSCLC患者，首次基因檢測(cè)組織樣本不足或組織檢測(cè)失敗時(shí)，經(jīng)NMPA或FDA批準(zhǔn)的液體活檢檢測(cè)產(chǎn)品可作為輔助或補(bǔ)充?！綢I級(jí)推薦】

對(duì)于腦轉(zhuǎn)移患者（包含腦膜轉(zhuǎn)移），有證據(jù)表明腦脊液ctDNA體現(xiàn)出比血液ctDNA更好的檢測(cè)性能，在條件允許的情況下，優(yōu)先使用腦脊液進(jìn)行液體活檢?！綢II級(jí)推薦】

有證據(jù)表明，胸腔積液ctDNA體現(xiàn)出比血液ctDNA更好的檢測(cè)性能，在條件允許的情況下，在胸腔積液沉渣中病理分析檢出腫瘤細(xì)胞的前提下，優(yōu)先使用胸腔積液進(jìn)行液體活檢?！綢II級(jí)推薦】

4 靶向治療耐藥NSCLC患者進(jìn)行基因檢測(cè)的共識(shí)意見(jiàn)

在肺癌的分子靶向藥物治療中，耐藥是臨床難以避免的挑戰(zhàn)，了解耐藥機(jī)制是合理選擇后續(xù)治療方案的前提。NSCLC靶向治療的耐藥機(jī)制復(fù)雜，包括驅(qū)動(dòng)基因的二次突變、旁路或下游通路激活、組織或表型轉(zhuǎn)化等。因此，對(duì)靶向治療耐藥的患者再次進(jìn)行廣泛的分子標(biāo)志物檢測(cè)有助于全面分析耐藥機(jī)制，并指導(dǎo)后續(xù)用藥。

4.1 NSCLC常見(jiàn)驅(qū)動(dòng)基因靶向治療耐藥后檢測(cè) EGFRTKI耐藥機(jī)制多樣，不同藥物也存在差異。目前最常報(bào)道的一代/二代EGFR-TKI耐藥相關(guān)突變?yōu)镋GFRT790M突變。對(duì)一代/二代EGFR-TKI耐藥患者，CSCO NSCLC診療指南（2020）建議再次活檢時(shí)應(yīng)檢測(cè)EGFRT790M，T790M突變陽(yáng)性患者可使用三代EGFR-TKI奧希替尼治療[6]。MET或ERBB2擴(kuò)增也與EGFR-TKI耐藥相關(guān)，NCCN指南將其納入EGFR-TKI耐藥基因檢測(cè)內(nèi)容[5]。基于廣泛的分子標(biāo)志物檢測(cè)，更多EGFR-TKI耐藥相關(guān)的基因變異不斷被發(fā)現(xiàn)，如基于FoundationOne?CDx檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的RET重排共突變（與一代和二代EGFR-TKI耐藥相關(guān)）[135]和FGFR3-TACC3融合突變[136]，基于MSK-IMPACTTM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的BRAF融合、FGFR3融合、YES1擴(kuò)增、KEAP1丟失和MTORE2419K突變[137]。

一代和二代ALK-TKI藥物的耐藥基因變異存在差異。一代ALK-TKI克唑替尼治療后發(fā)生ALK耐藥突變的發(fā)生概率為20%，最常見(jiàn)的耐藥突變?yōu)長(zhǎng)1196M（7%）和G1269A（4%）。二代ALK-TKI最常見(jiàn)的耐藥突變是G1202R：塞瑞替尼耐藥患者中最常見(jiàn)的耐藥突變?yōu)镚1202R（21%）、F1174C/L（16.7%）和C1156Y（8%）；阿來(lái)替尼耐藥患者中最常見(jiàn)的耐藥突變?yōu)镚1202R（29%），其他突變包括I1171T/S（12%）、V1180L（6%）、L1196M（6%）；Brigatinib耐藥患者中最常見(jiàn)的突變?yōu)镚1202R[32]。ALK-TKI耐藥患者檢出ALK耐藥突變，說(shuō)明腫瘤仍為ALK依賴(lài)，使用其他ALK抑制劑可能有效。根據(jù)ALK-TKI對(duì)各種耐藥細(xì)胞株作用研究表明，三代ALK-TKI勞拉替尼對(duì)絕大多數(shù)已知ALK耐藥型突變有效[32]，但勞拉替尼對(duì)一代和二代ALK-TKI耐藥NSCLC的療效不同?？诉蛱婺嶂委熀竽退幥椅词褂眠^(guò)其他ALK抑制劑的患者，是否出現(xiàn)ALK耐藥突變并不影響勞拉替尼的療效，這可能與克唑替尼是一個(gè)不完全ALK通路抑制劑相關(guān)；而對(duì)于二代ALKTKI治療后耐藥患者，未檢出ALK耐藥突變，使用三代ALK抑制劑就很難獲益[138]。

ROS1重排陽(yáng)性NSCLC患者接受克唑替尼治療后耐藥的機(jī)制目前尚不完全明確，已有的研究[139]證據(jù)提示一系列點(diǎn)突變（最常檢出的是G2032R，其他還有D2033N、L2026M、S1986Y/F、L2155S）、旁路激活（如KIT和EGFR通路激活）和下游通路異常（如RAS/RAF/MEK通路、PI3K通路、JAK/STAT通路）與克唑替尼耐藥相關(guān)。旁路激活、下游通路異常導(dǎo)致的耐藥可選擇對(duì)應(yīng)的靶向聯(lián)合治療[140]或化療/靶向聯(lián)合免疫方案[141]，第三代ALK-TKI勞拉替尼也顯示對(duì)旁路激活相關(guān)的克唑替尼耐藥腫瘤有效[142]。針對(duì)點(diǎn)突變導(dǎo)致的耐藥，可根據(jù)具體的點(diǎn)突變選擇相應(yīng)的靶向藥物，如對(duì)攜帶G2032R的NSCLC有潛在治療作用的靶向藥物有卡博替尼和Ropotrectinib[118]。

4.2 NSCLC少見(jiàn)驅(qū)動(dòng)基因靶向治療耐藥后檢測(cè) 除上述NSCLC中常見(jiàn)驅(qū)動(dòng)基因TKI耐藥機(jī)制外，近幾年針對(duì)少見(jiàn)靶點(diǎn)TKI潛在耐藥機(jī)制的研究也有一些報(bào)道，具體如下。

關(guān)于靶向BRAFV600E突變治療的耐藥機(jī)制的研究比較有限。3例BRAFV600E的NSCLC患者分別在接受達(dá)拉非尼單藥或達(dá)拉非尼聯(lián)合曲美替尼治療耐藥后，報(bào)道了獲得性的KRASG12D、KRASG12V和NRASQ61K突變，提示可能是耐藥機(jī)制[143-145]?；贛ATCH-R（matching resistance）研究患者數(shù)據(jù)的文章[146]報(bào)道了11例針對(duì)BRAFV600E靶向治療后的潛在耐藥機(jī)制：4例患者分別檢測(cè)到了MEK1K57N、PTENN329fs、NRASQ61R以及KRASQ61R突變。綜上所述，靶向BRAFV600E治療的潛在耐藥機(jī)制主要涉及上下游RAS/MEK基因的突變以及旁路影響（PI3K通路）。

關(guān)于靶向NTRK基因融合治療的耐藥研究集中在臨床前證據(jù)以及其他癌種個(gè)例報(bào)道，肺癌作為低頻癌種尚未有相關(guān)報(bào)道。相關(guān)耐藥機(jī)制多為NTRK激酶區(qū)的獲得性耐藥突變，包括TRKAG595R/F589L/A608D/G667C、TRKCG623R/G696A，目前并未見(jiàn)報(bào)道發(fā)生在TRKB上的耐藥突變[41]。針對(duì)這些耐藥突變的二代NTRK-TKI，如LOXO-195[147]和TPX-0005[148]正在臨床試驗(yàn)探索階段。除NTRK耐藥突變外，NTRK-TKI也可能存在旁路激活耐藥機(jī)制，臨床前研究[149]表明IGF1R旁路激活是潛在耐藥機(jī)制；STARTRK-2研究的后續(xù)分析也報(bào)道了恩曲替尼耐藥患者中獲得性的BRAFV600E和KRASG12D突變，提示與MAPK通路的潛在相關(guān)性[150]。

MET靶向治療耐藥機(jī)制的研究主要針對(duì)MET14號(hào)外顯子跳躍突變。多篇案例[151,152]報(bào)道了克唑替尼治療MET14號(hào)外顯子跳躍突變NSCLC患者進(jìn)展后的突變位點(diǎn)，包括METD1228X和Y1230X。2019 ASCO會(huì)議上報(bào)道了更加全面的MET靶向治療潛在耐藥機(jī)制[153]，包括在靶突變（HGF擴(kuò)增、METD1228X/Y1230X/G1163R/L1195V/H1049Y以及MET14號(hào)外顯子擴(kuò)增）和旁路激活（EGFR擴(kuò)增、ERBB2擴(kuò)增[154]、KRAS擴(kuò)增、KRASG12S/G13V以及RASA1S724*），其中激酶區(qū)突變?yōu)镸ET抑制劑耐藥的主要原因。上述這些研究大部分是基于克唑替尼治療耐藥患者的研究，這些耐藥位點(diǎn)是否對(duì)新一代選擇性MET抑制劑敏感，還有待臨床探索。

針對(duì)NSCLC中ERBB2以及RET靶向治療耐藥機(jī)制的研究較少。一項(xiàng)體外研究[155]報(bào)道了C805S突變是攜帶ERBB220號(hào)外顯子突變患者接受靶向治療后的獲得性耐藥機(jī)制。另一項(xiàng)針對(duì)多例ERBB2突變NSCLC患者的回顧性分析[156]提示PIK3CA突變（R88Q）以及ERBB2擴(kuò)增是潛在耐藥機(jī)制。近期，一項(xiàng)體外研究[157]發(fā)現(xiàn)一些RET突變（L730/E732/V738/V804/Y806/A807/G810）與髓樣甲狀腺癌患者Cabozantinib、Lenvatinib、Vandetanib耐藥相關(guān)，到目前為止，這些突變還沒(méi)有在RET融合或RET突變癌癥患者的腫瘤樣本中得到證實(shí)。近期一個(gè)病例[158]報(bào)道了RET融合的NSCLC患者在Vandetanib耐藥時(shí)出現(xiàn)二次RET突變（S904F）。另一個(gè)RET融合NSCLC的案例[159]描述了V804M突變對(duì)Vandetani耐藥的影響。這些結(jié)果表明，RET激酶區(qū)突變可能是產(chǎn)生TKI耐藥的原因。

4.3 免疫治療耐藥后檢測(cè) 由于免疫治療的耐藥機(jī)制尚不清晰，并且尚無(wú)免疫治療后產(chǎn)生可靶向治療耐藥位點(diǎn)的文獻(xiàn)報(bào)道，因此本共識(shí)并未對(duì)免疫治療耐藥后患者進(jìn)行相關(guān)NGS檢測(cè)的推薦。

共識(shí)9：對(duì)于靶向治療耐藥后的患者，為了更好地指導(dǎo)后續(xù)治療方案的選擇，建議使用NMPA或FDA批準(zhǔn)的CGP NGS檢測(cè)產(chǎn)品再次進(jìn)行檢測(cè)?！綢I級(jí)推薦】

對(duì)于不能獲取腫瘤標(biāo)本的耐藥患者，CSCO NSCLC診療指南（2020）建議進(jìn)行基于血液樣本的cf/ctDNA檢測(cè)[6]。液體檢測(cè)因無(wú)創(chuàng)和操作便捷，可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)治療效果，及早發(fā)現(xiàn)耐藥。疾病進(jìn)展時(shí)，cfDNA分析可有效識(shí)別導(dǎo)致耐藥的新發(fā)基因變異。如通過(guò)ctDNA檢測(cè)出了EGFR-TKI的新型獲得性耐藥突變FGFR3-TACC3融合，提示基因激酶區(qū)的融合可能是EGFR-TKI的耐藥機(jī)制[136]。FLAURA研究中，通過(guò)ctDNA檢測(cè)到最常見(jiàn)的奧希替尼耐藥相關(guān)突變?yōu)镸ET擴(kuò)增和EGFRC797S突變，其他突變包括HER2擴(kuò)增、PIK3CA和RAS突變[160]。此外，通過(guò)ctDNA檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)了ALK抑制劑的新型耐藥突變[161-163]。

共識(shí)10：靶向治療耐藥后優(yōu)先選擇再次活檢，如無(wú)法再次進(jìn)行組織活檢或活檢組織樣本不足時(shí)，可使用經(jīng)NMPA或FDA批準(zhǔn)的CGP NGS液體活檢檢測(cè)產(chǎn)品進(jìn)行補(bǔ)充檢測(cè)?！綢I級(jí)推薦】

5 NGS檢測(cè)中標(biāo)本類(lèi)型和檢測(cè)流程的規(guī)范

樣本質(zhì)控對(duì)高質(zhì)量基因檢測(cè)結(jié)果至關(guān)重要。適合臨床NGS分析的樣本類(lèi)型優(yōu)選新鮮組織標(biāo)本，也可選用甲醛固定-石蠟包埋樣本（formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE）、腫瘤細(xì)胞學(xué)樣本及血漿（游離DNA/RNA）等[11]。

NGS檢測(cè)樣本的采集方法包括手術(shù)切除樣本、活檢小樣本、細(xì)針抽吸組織（細(xì)胞塊）和積液脫落細(xì)胞學(xué)（細(xì)胞塊）。對(duì)于未接受過(guò)靶向/免疫藥物治療的患者，NGS檢測(cè)應(yīng)首選經(jīng)病理評(píng)估的組織樣本，優(yōu)先使用手術(shù)切除樣本，也可選擇活檢樣本（選擇腫瘤含量最高或腫瘤最集中部位），再次檢測(cè)可選取液體活檢樣本進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)[11,13]。接受過(guò)靶向/免疫藥物治療的患者，應(yīng)盡可能使用治療后的樣本，以尋找治療后新出現(xiàn)的耐藥突變。

各個(gè)NGS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)不同樣本（新鮮組織標(biāo)本、FFPE樣本、細(xì)胞學(xué)樣本和體液/血液）的采集和處理需制訂嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（standard operating procedure,SOP）。樣本采集最好采用一次性材料。制備不同患者病理切片樣本時(shí)，需更換新刀片，并清除操作器皿或切片機(jī)上先前樣本的殘留。

手術(shù)和活檢的新鮮組織：獲取的樣本應(yīng)含有豐富的腫瘤細(xì)胞，浸潤(rùn)性腫瘤組織含有一定的淋巴細(xì)胞。手術(shù)取樣后用生理鹽水沖洗至組織表面沒(méi)有明顯血跡，避免血液中的gDNA污染。手術(shù)采集的腫塊組織不低于50 mg（豌豆粒大?。４┐虡颖緫?yīng)≥2條，長(zhǎng)度≥0.5 cm。新鮮組織樣本的理想保存方法是迅速置于液氮中，可保存于液氮罐或-80oC冰箱保存，這一過(guò)程應(yīng)在組織離體后30 min內(nèi)完成，以防止RNA等核酸降解。也可保存在樣本保護(hù)劑中，并盡早轉(zhuǎn)移至-80oC冰箱保存?？刹捎美鋬銮衅旧u(píng)估樣本中的腫瘤細(xì)胞含量。

FFPE：按病理規(guī)范要求取材，盡量避免腫瘤細(xì)胞過(guò)少或未檢測(cè)到的腫瘤組織、病變中心廣泛纖維化的腫瘤、黏液產(chǎn)生過(guò)高的腫瘤、周?chē)装Y嚴(yán)重的腫瘤、含壞死組織過(guò)多的腫瘤、含鈣化灶并脫鈣處理過(guò)的腫瘤。務(wù)必在組織離體后30 min內(nèi)浸入足量的4%甲醛溶液中固定（液體與組織大小比例為10:1），避免使用酸性及含有重金屬離子的固定液。大標(biāo)本切開(kāi)后充分固定12 h-48 h，不超過(guò)72 h；小活檢標(biāo)本可固定6 h-12 h。開(kāi)展NGS檢測(cè)前應(yīng)進(jìn)行HE染色，評(píng)估腫瘤細(xì)胞的含量。一般情況下，適合于NGS檢測(cè)的組織樣本中腫瘤含量建議應(yīng)達(dá)到20%以上，最佳含量為30%以上。腫瘤細(xì)胞體積至少達(dá)到0.2 mm3。組織樣本抽提獲得的DNA量應(yīng)達(dá)50 ng以上。若組織樣本中腫瘤細(xì)胞含量較低，仍需進(jìn)行NGS檢測(cè)的話(huà)，應(yīng)盡量采用顯微切割技術(shù)富集腫瘤細(xì)胞，并在報(bào)告中提示樣本局限性。

細(xì)胞學(xué)樣本：符合病理質(zhì)控或通過(guò)腫瘤細(xì)胞富集處理后符合要求的標(biāo)本，可直接抽提核酸，也可以制備成FFPE細(xì)胞學(xué)蠟塊進(jìn)行分析。腫瘤科醫(yī)師在申請(qǐng)胸水標(biāo)本的基因檢測(cè)時(shí)，必須同時(shí)進(jìn)行液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)來(lái)進(jìn)行病理評(píng)估。體腔積液標(biāo)本也可提取無(wú)細(xì)胞上清標(biāo)本中的ctDNA進(jìn)行檢測(cè)。

血漿或血液樣本：采集外周血提取血漿游離DNA進(jìn)行檢測(cè)，取樣時(shí)應(yīng)使用一次性的含乙二胺四乙酸（ethylen ediaminetetraacetic acid, EDTA）的抗凝真空采血管，根據(jù)檢測(cè)平臺(tái)的要求采集10 mL全血，2 h內(nèi)分離血漿，提取游離DNA后，保存于-80oC冰箱中，并避免反復(fù)凍融。如外周血需長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸，建議用商品化的游離DNA樣本專(zhuān)用保存管，在常溫條件下可穩(wěn)定保存3 d-7 d。

樣本運(yùn)送過(guò)程要確保各類(lèi)樣本運(yùn)送安全、無(wú)污染、無(wú)降解。石蠟樣本及血檢樣本可常溫運(yùn)輸，核酸樣本需在4oC或冷凍條件下運(yùn)輸。

共識(shí)11：NSCLC的NGS檢測(cè)樣本的采集處理和保存應(yīng)符合規(guī)范要求。未接受過(guò)靶向/免疫藥物治療的患者，NGS檢測(cè)應(yīng)首選經(jīng)病理評(píng)估的組織樣本。接受過(guò)靶向/免疫藥物治療的患者，應(yīng)盡可能使用治療后的樣本?！綢級(jí)推薦】

NGS檢測(cè)的全部流程主要包括實(shí)驗(yàn)室操作和生物信息學(xué)分析兩部分。實(shí)驗(yàn)室操作部分包括從符合送檢要求的樣本中提取DNA、基于雜交捕獲或擴(kuò)增子建庫(kù)方法進(jìn)行文庫(kù)制備、目標(biāo)區(qū)域富集、測(cè)序等；生物信息分析部分是對(duì)于不同類(lèi)型變異（包括堿基替換、插入/缺失、拷貝數(shù)改變和基因重排）采用特定生物信息學(xué)分析方法進(jìn)行分析并結(jié)合藥物注釋信息給出臨床報(bào)告。送檢樣本及全部測(cè)序和分析報(bào)告流程應(yīng)符合《臨床分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室二代基因檢測(cè)專(zhuān)家共識(shí)》、《二代測(cè)序技術(shù)在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)診療中的應(yīng)用專(zhuān)家共識(shí)》等共識(shí)基本要求[11,13]，充分關(guān)注試劑管理、樣本的質(zhì)控/質(zhì)量保證、檢測(cè)環(huán)境、人員資質(zhì)和熟練程度，NGS技術(shù)參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)（包括文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序流程、質(zhì)控等）等環(huán)節(jié)，配備獨(dú)立的質(zhì)量控制程序。

共識(shí)12：NSCLC的NGS檢測(cè)流程應(yīng)符合規(guī)范要求，配備完善的標(biāo)準(zhǔn)操作流程和獨(dú)立的質(zhì)量控制程序。【I級(jí)推薦】

6 NGS檢測(cè)報(bào)告的臨床解讀

NGS檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)化為患者的個(gè)體化精準(zhǔn)診療方案，需要基于多個(gè)分子標(biāo)志物的臨床或臨床前分子生物學(xué)證據(jù)，并結(jié)合患者診療史準(zhǔn)確判斷證據(jù)優(yōu)先級(jí)，個(gè)性化地解讀基因檢測(cè)報(bào)告?；谂R床信息的傳統(tǒng)腫瘤多學(xué)科協(xié)作治療模式（multidisciplinary team, MDT）可能無(wú)法滿(mǎn)足肺癌臨床日益增長(zhǎng)的基因檢測(cè)報(bào)告解讀需求，尤其是對(duì)于耐藥后有多種潛在治療方案的患者，需要結(jié)合患者診療史對(duì)不斷更新的證據(jù)等級(jí)進(jìn)行個(gè)性化排序。由此看來(lái)，組建由腫瘤科醫(yī)師、病理科醫(yī)師、分子生物學(xué)專(zhuān)家、生物信息學(xué)專(zhuān)家等多個(gè)專(zhuān)業(yè)領(lǐng)域?qū)＜医M成的肺癌分子腫瘤專(zhuān)家委員會(huì)（molecular tumor boards, MTB），討論分子生物學(xué)相關(guān)證據(jù)，優(yōu)化患者的個(gè)體化診療方案，并建立基于分子標(biāo)志物檢測(cè)的臨床治療路徑或許是更優(yōu)的解決方案。進(jìn)入NSCLC-MTB的腫瘤科醫(yī)師需要基于患者的臨床病理學(xué)信息發(fā)起基因檢測(cè)需求，熟悉基因變異信息對(duì)應(yīng)的患病風(fēng)險(xiǎn)、靶向治療、預(yù)后療效等臨床應(yīng)用價(jià)值，并對(duì)患者基于分子檢測(cè)的治療方案進(jìn)行跟蹤隨訪(fǎng)，以確認(rèn)分子標(biāo)志物陽(yáng)性患者的真實(shí)世界療效；病理科醫(yī)師能夠評(píng)估患者的腫瘤標(biāo)本特征并提供符合檢測(cè)需求的送檢樣本，如在院內(nèi)病理科進(jìn)行NGS檢測(cè)，還需要病理科醫(yī)師對(duì)于檢測(cè)流程進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可信；分子生物學(xué)及生物信息學(xué)專(zhuān)家主要負(fù)責(zé)分析基因變異和進(jìn)行藥物相關(guān)性注釋?zhuān)皶r(shí)更新數(shù)據(jù)庫(kù)的證據(jù)等級(jí)以便進(jìn)行更準(zhǔn)確的基因變異與藥物相關(guān)性注釋?zhuān)f(xié)助臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)收集。如有需要，NSCLC-MTB還應(yīng)包括腫瘤放射科、腫瘤外科、遺傳學(xué)和藥理學(xué)等其他專(zhuān)科領(lǐng)域的專(zhuān)家。

共識(shí)13：二代測(cè)序技術(shù)為NSCLC患者帶來(lái)了更多更全面的基因突變信息，倡導(dǎo)各單位組建NSCLC-MTB，以正確解讀基因檢測(cè)的結(jié)果，制定個(gè)體化臨床治療決策?！綢I級(jí)推薦】

表 4 二代測(cè)序技術(shù)在NSCLC中的臨床應(yīng)用中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)要點(diǎn)Tab 4 Summary of recommendations

7 展望

二代測(cè)序技術(shù)的全面應(yīng)用，將為NSCLC患者個(gè)體化臨床診治奠定基礎(chǔ)（表4-表6）。未來(lái)可以通過(guò)對(duì)患者臨床診療信息、基因檢測(cè)結(jié)果、后續(xù)治療方案的全程管理，建立NSCLC患者個(gè)體化精準(zhǔn)治療平臺(tái)，同時(shí)積累真實(shí)世界數(shù)據(jù)，不斷豐富和完善我國(guó)NSCLC患者的個(gè)體化診療全景圖。此外，重視腫瘤臨床醫(yī)師與病理科醫(yī)生、分子生物學(xué)及生物信息學(xué)專(zhuān)家的合作，構(gòu)建分子腫瘤專(zhuān)家委員會(huì)的新型多學(xué)科診療模式也是腫瘤臨床和研究的重要發(fā)展方向。

表 5 共識(shí)證據(jù)類(lèi)別Tab 5 Evidence level

表 6 共識(shí)推薦等級(jí)Tab 6 Recommendation level

本共識(shí)專(zhuān)家組成員