劉厚宇，李順雨，吳敏芳，喬 光，吳亞維，宋 莎

(1.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院/生命科學(xué)院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025;2.貴州大學(xué)林學(xué)院, 貴陽 550025； 3.貴州省清鎮(zhèn)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 貴陽 550004；4.貴州省威寧自治縣果業(yè)發(fā)展中心, 貴州威寧 553100；5.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所，貴陽 550006)

中國櫻桃(PrunuspseudocerasusLindl.)是櫻桃中產(chǎn)地為中國的櫻桃種家族，相對于歐洲甜櫻桃，其風(fēng)味獨(dú)特，在中國適應(yīng)性廣。很多學(xué)者利用AFLPs[1]、ISSR[2]、SSR[3]等分子標(biāo)記技術(shù)對中國櫻桃開展了諸如遺傳多樣性評價、遺傳穩(wěn)定性檢測、種質(zhì)鑒定等研究。但這些方法各有缺點(diǎn)，如ISSR標(biāo)記對體細(xì)胞遺傳變異檢測效率較低；AFLP技術(shù)對基因組純度和反應(yīng)條件要求較高，且用于遺傳作圖時，少數(shù)的標(biāo)記和圖譜緊密度有出入；SSR標(biāo)記標(biāo)記密度低，檢測方法較為單一[4,5]。

LTR家族反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在高等植物中以高拷貝數(shù)普遍存在[6]，copia和gypsy家族轉(zhuǎn)座子是LRT轉(zhuǎn)座子的主要組成部分，如在梨上，Gypsy和Copia分別占基因組的25.5%以及14.9%[7]。因此利用反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因相關(guān)的分子標(biāo)記，在遺傳多樣性和系譜研究、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及性狀基因定位方面具有很大的發(fā)展?jié)摿8]。IRAP(interretrotransposon amplified polymorphism)是基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列間多態(tài)性的一種分子標(biāo)記[9]開發(fā)，原理是在逆轉(zhuǎn)錄酶保守區(qū)域或者LTRs保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，操作方便，靈敏度高。在前期工作中，我們克隆了中國櫻桃的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty 1-copia和Ty 3-gypsyRT序列。本研究根據(jù)這些序列設(shè)計(jì)IRAP引物，篩選具多態(tài)性高的引物，并建立IRAP-PCR技術(shù)體系，旨在為櫻桃遺傳變異研究、遺傳多樣性評價、種質(zhì)鑒定等方面提供新型分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

IRAP-PCR分子標(biāo)記反應(yīng)體系建立使用材料來自貴州省農(nóng)科院果樹所落葉果樹種質(zhì)資源圃，以貴州省內(nèi)黔西、赫章、納雍、關(guān)嶺、盤縣、修文等地的14種中國櫻桃(P.pseudocerasusLindl.)資源幼葉為試材，用于檢測IRAP-PCR產(chǎn)物多態(tài)性的非變形聚丙烯酰氨凝膠電泳適宜濃度以及計(jì)算引物多態(tài)性等信息。取樣時間及方法：3月中旬，取幼葉于自封袋，冰盒保存迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，清水洗凈、液氮處理后置于-80 ℃冰箱保存。用于 PCR 擴(kuò)增的TaqDNA 聚合酶和 dNTPs 購自大連寶生物工程公司。DNA提取試劑盒購自北京天根生物科技公司(貨號：DP 302)。使用核酸微量測定儀及瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA濃度及質(zhì)量。

1.2 IRAP引物設(shè)計(jì)及篩選

根據(jù)本研究前期工作中獲得的中國櫻桃Ty 1-copia和Ty 3-gypsyRT(逆轉(zhuǎn)錄酶)基因保守端序列設(shè)計(jì)引物(表1)。引物由上海生工生物科技有限公司合成，表1中退火溫度(Tm)值由序列自動計(jì)算。

表1 IRAP引物設(shè)計(jì)

根據(jù)引物計(jì)算的退火溫度，以上下浮動4～5 ℃范圍，在梯度PCR儀上相隔1 ℃設(shè)8個溫度梯度篩選最適的退火溫度。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，復(fù)性45 s(Tm視引物而定)，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃下保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物，在含有EB的2%瓊脂糖凝膠中，以5 V·cm-1的電壓電泳50 min，然后于凝膠分析儀中觀察并拍照保存。將引物與退火溫度篩選同時進(jìn)行，選擇條帶數(shù)量多，清晰度好的引物。

1.3 PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

對PCR反應(yīng)體系里的MgCl2、Taq酶、引物、模板DNA以及dNTP設(shè)置5個濃度因子，每因子設(shè)4個濃度梯度進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，優(yōu)化反應(yīng)體系(見表2)，共16個組合。其中，模板DNA濃度是10 ng，引物稀釋了10倍，Taq酶稀釋了5倍，MgCl2離子濃度是 25 mmol·L-1，dNTPs 的濃度 2.5 mmol·L-1，10× PCR Buffer 2.5μL,PCR體系總體積為 25μL。

表2 IRAP-PCR正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 PCR產(chǎn)物檢測技術(shù)的優(yōu)化

設(shè)計(jì)2.0%的瓊脂糖凝膠以及濃度為5%、6%、8%、10%的非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳，檢測IRAP-PCR產(chǎn)物的多態(tài)性。非變性PAGE膠各組分配制見表3，依次加入組分，TEMED和10% APS攪拌均勻定容至60 mL。

表3 非變性膠濃度的設(shè)置

瓊脂糖電泳電壓為100 V，電泳時間80 min。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳為150 V，電泳時間根據(jù)不同濃度設(shè)定，范圍在1.2～2.5 h之間。凝膠取出后放入含有5%冰醋酸和10%乙醇的固定液容器中，置搖床上 100 r·min-1固定 15 min。0.1%的硝酸銀置搖床上 100 r·min-1銀染 15 min，迅速用dd H2O快速清洗2次。加入顯色液(-20 ℃預(yù)冷10 min)(包含1.5% NaOH+1.1%甲醛)輕搖至條帶清晰，用dd H2O沖洗膠表面的顯色液，拍照分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物及退火溫度的篩選

退火溫度是影響多態(tài)性的重要因素，圖1顯示了部分引物受退火溫度變化的影響，隨著溫度降低，條帶亮度增高，小片段也越發(fā)清晰，但是1 500～2 000 bp的片段無法顯示，1 000～1 500 bp左右的片段特異性不高，呈現(xiàn)彌散狀。隨著溫度升高，大片段更加清晰，但是小片段無法呈現(xiàn)。根據(jù)條帶的清晰度和數(shù)量，確定適合的引物退火溫度。另外發(fā)現(xiàn)，在30條引物可以擴(kuò)增出具有多態(tài)性的條帶，綜合考慮條帶清晰度、數(shù)目、穩(wěn)定性等因素，9條引物及其最適退火溫度被篩選出來，分別是LTR 1-47(56 ℃)、LTR 1-10(57 ℃)、LTR 1-3(58 ℃)、LTR 1-1(59 ℃)、LTR 1-26(59 ℃)、LTR 1-2(60 ℃)、LTR 1-48(56 ℃)、LTR 1-60(57 ℃)、LTR 3-11(58 ℃)，其中8條來自于Ty 1-copia，占所有Ty 1-copia序列的17.4%；1條來自于Ty 3-gypsy，占Ty 3-gypsy序列的7.7%。

注：M為Marker D 2000;1為引物L(fēng)TR1-26；2為LTR1-27；3為LTR1-29;A～H為59 ℃，58 ℃，57 ℃，56 ℃，55 ℃，54 ℃，53 ℃，52 ℃。

2.2 IRAP-PCR 反應(yīng)體系的建立

優(yōu)化反應(yīng)體系電泳結(jié)果顯示(圖2)，根據(jù)條帶亮度從優(yōu)到差的順序?yàn)榈?、11、5、14、13、15、10、4、12、6泳道，而第1、2、3、7、9、16泳道等7個沒有擴(kuò)增出條帶。有條帶的泳道中，第4、5、11泳道的條帶比較多且清晰，第8、12、13泳道盡管條帶多，但是過于模糊，第6、10、14、15泳道條帶較少。綜合來看，第4、5、11泳道較好。對于組合4，考慮到dNTP價格比較貴，而Taq酶0.5 U太少容易引起加樣過程中的誤差，還是采用組合11；組合5由于條帶主要集中在1 000 bp以上，在非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳中不太容易分辨而舍棄，因此最佳的PCR體系應(yīng)該是2.0 mmol·L-1MgCl2、Taq酶1.0 U、引物0.2 mmol·L-1、模板DNA為20 ng、dNTP為0.3 mmol·L-1。

注：M為Marker D 2000，泳道1～16同表2處理1～16。

2.3 IRAP-PCR產(chǎn)物檢測技術(shù)體系

用篩選的引物L(fēng)RT 1-3，在優(yōu)化的體系中對14種中國櫻桃進(jìn)行PCR，對比2.0%的瓊脂糖凝膠以及不同濃度的非變性PAGE膠檢測結(jié)果(圖3)，瓊脂糖凝膠能檢測出8個位點(diǎn)，而5%、6%、8%、10% PAGE膠檢測出14、21、24、23個位點(diǎn)。說明聚丙烯酰氨凝膠電泳的分辨率高于瓊脂糖凝膠，瓊脂糖凝膠無法分辨一些大于1 000 bp的大片段和一些弱帶。5%的PAGE非變性膠由于濃度低，條帶清晰度及分辨率都最低，而且膠塊易碎，不容易操作。8%和10%能分辨的條帶數(shù)相近，考慮到成本，選擇8%的非變性膠進(jìn)行IRAP-PCR的檢測。

注：A 表示2%瓊脂糖凝膠電泳，B、C、D表示5%、6%、8%、10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。

表4 櫻桃IRAP引物條帶統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4 IRAP引物評價

利用優(yōu)化體系，將篩選出的9條引物在14種中國櫻桃上擴(kuò)增，獲得了222個位點(diǎn)，平均每條引物擴(kuò)增出24.67個位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)為200個，平均每條引物的多態(tài)性位點(diǎn)是22.22個，平均多態(tài)性比率是90.09%，條帶范圍在150～2 500 bp之間。引物L(fēng)TR1-47總位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)以及多態(tài)比例在所有引物中均最高。

3 討 論

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)很多分子標(biāo)記技術(shù)，不同標(biāo)記技術(shù)之間各有優(yōu)劣。本研究根據(jù)中國櫻桃基因組LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty 1-copia和Ty 3-gypsy序列設(shè)計(jì)單向IRAP引物，篩選出多態(tài)性高、條帶多的引物并建立了櫻桃IRAP分子標(biāo)記的體系，對貴州地方櫻桃進(jìn)行遺傳多樣性評價。與其他在櫻桃上應(yīng)用的分子標(biāo)記相比，IRAP多態(tài)性(90.9%)高于ISSR(87.28%)[2]、RAPD(87%)[10]以及SRAP(84.6%)[11]；IRAP擴(kuò)增每條引物擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)(24.67)更是遠(yuǎn)高于ISSR(10.9)[2]、SSR(7.67)[12]以及RAPD(5.0)[10]。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子有很多優(yōu)點(diǎn)，比如高通量、基因組覆蓋范圍廣、多態(tài)性豐富等，在櫻桃上使用較少的IRAP引物，就能獲得數(shù)量較多的多態(tài)性標(biāo)記，省時省力。

IRAP標(biāo)記建立在PCR技術(shù)基礎(chǔ)之上，因此dNTPs、引物、Mg2+、TaqDNA 聚合酶濃度和退火溫度等因素影響較大，對這些因素進(jìn)行篩選和優(yōu)化很必要。比較與櫻桃親緣關(guān)系相近的果梅IRAP體系[13]，發(fā)現(xiàn)兩者間有所差異，原因在于不同的物種，其基因組DNA特性及試劑規(guī)格不同，最適PCR體系也不同。另外，IRAP 標(biāo)記的擴(kuò)增帶太多，瓊脂糖凝膠電泳靈敏度較低，檢測得到數(shù)量較少[14]，因此需要利用不同濃度PAGE凝膠對檢測技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化。與大多數(shù)研究結(jié)果一樣，瓊脂糖凝膠對條帶顯示數(shù)量和清晰度不如非變性PAGE凝膠。非變性PAGE凝膠濃度對檢測效果的影響也非常大，張秀華等[15]認(rèn)為，非變性PAGE膠的濃度范圍為3.5%～20.0%；但是在低濃度膠電泳中，條帶較彌散，不利于基因型的判斷，本研究篩選出8%為最適合的濃度，與沈玉英等[13]在梅上，陶金等[16]在火龍果上的最佳濃度一致, 但是高于煙草(3%)[17]。說明應(yīng)用IRAP分子標(biāo)記對于不同種類植物進(jìn)行研究時，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳的類型和濃度存在差異。除了PAGE膠濃度之外，凝膠速度、均勻程度以及上樣量大小等因素也會影響到條帶的清晰和數(shù)量。凝膠制作時，每一步都要混勻，最好在低溫條件下進(jìn)行，夏天凝結(jié)時間非常短。本研究取1.2μL PCR產(chǎn)物和0.2μL 6×loading buffer混合，效果比較好。

本研究建立的IRAP分子標(biāo)記體系，在櫻桃遺傳多樣性、親緣關(guān)系鑒定以及遺傳變異檢測方面有廣闊的應(yīng)用前景。尤其在檢測遺傳變異方面，IRAP具有高度的靈敏性，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的活動可能是芽變產(chǎn)生的原因之一[18]，利用IRAP標(biāo)記檢測芽變，在很多物種上都有報(bào)道[19，20]。研究也證明反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子類分子標(biāo)記對于體細(xì)胞變異鑒別更靈敏，如Bernet等[21]用RAPD、ISSR、IRAP 3種分子標(biāo)記對檸檬品種進(jìn)行鑒別，發(fā)現(xiàn)IRAP多態(tài)性比例分別是(36.4%)，高于RAPD(27.3%)和ISSR(0)。另外，IRAP還有物種間通用性，可以應(yīng)用在薔薇科很多核果和仁果類果樹中。