申炳俊 柳婷婷

(長春理工大學生命科學技術學院, 長春 130022)

胡桃醌(Juglone，Jug)又名5-羥基-1,4-萘醌、5-羥基-1,4-萘二酮，屬于萘醌類化合物。天然Jug存在于胡桃科植物胡桃楸未成熟外果皮、新鮮樹皮和枝皮中，為民間抗癌驗方青龍衣的主要活性物質之一[1]。近年來，Jug具有的顯著抗腫瘤活性引起了研究者廣泛關注。研究結果表明，Jug不僅對胃癌、肝癌、肺癌、結腸癌和黑色素瘤等多種腫瘤有抑制作用[2～5]，而且還具有抗真菌、抗衣原體和抗病毒等多種藥理活性[6～8]。Jug是目前唯一已知的肽基-脯氨?；悩嬅?Pin1)抑制劑，能夠抑制Pin1活性， 以阻止腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]， 有望成為預防和治療腫瘤的藥物。然而，Jug也能引起人纖維細胞死亡，對人體細胞有損傷作用[10,11]，Jug的毒性和合理用藥是需要重點研究的內容。目前，Jug的化學性質已明確，有關細胞毒活性、抗腫瘤作用機制及作用靶點研究也取得了一些研究結果，但在毒性機理、體內運輸性質及用藥安全方面仍有待進一步研究。

人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是人血漿中含量最豐富的非特異性載體蛋白質，具有多種功能。藥物進入人體血液系統(tǒng)后，大部分先與HSA進行可逆結合，然后進行存儲、轉運、藥效發(fā)揮或毒副作用。藥物與HSA可逆結合親和性，將直接影響藥物分子在血液中的生物利用率、分布、自由態(tài)濃度和代謝。此外，HSA還是研究藥物與蛋白質結合機制的經(jīng)典模型蛋白，常被用于藥物與蛋白質相互作用研究中[12,13]。因此，在分子水平研究藥物與HSA相互作用，不僅對于闡明藥物發(fā)揮藥理作用的機制提供依據(jù)，而且對于揭示體內藥物動力學、指導臨床合理用藥、開發(fā)新藥也具有重要意義。近年來，大量中藥活性成分與血清白蛋白間相互作用結果被相繼報道，其中涉及較多為黃酮類和生物堿類活性成分，萘醌類活性成分研究相對較少。葛鋒等[14]利用熒光光譜法研究了紫草素(5,8-二羥基-2-[(1R)-1-羥基-4-甲基戊-3-烯基]萘-1,4-二酮)與牛血清白蛋白(BSA)的結合反應，獲得了兩者間結合常數(shù)和結合位點數(shù)等信息，紫草素分子萘醌結構和多個羥基使其與BSA之間的結合以靜電作用為主，同時伴有氫鍵作用力。王麗娜等[15]用圓二色和拉曼光譜表征了Cu2+/Mn2+存在下白花丹素(5-羥基-2甲基-1,4-萘醌)對HSA構象的影響，HSA與白花丹素作用可改變自身二級結構、降低α-螺旋含量。Jali等[16]研究了萘醌衍生物與血清白蛋白的選擇性結合及其對細胞毒性的影響，結果顯示萘醌衍生物結構直接影響其與BSA結合常數(shù)。目前，Jug與血清白蛋白的相互作用尚未見文獻報道，Jug是否能與HSA結合仍需進行實驗研究。

本研究以HSA為模型，利用內源熒光光譜、紫外吸收光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜以及分子模擬技術在分子水平上研究Jug與HSA的鍵和模式及作用機理，得到兩者間結合常數(shù)、結合位置、作用力類型以及相互作用過程中HSA構象變化等信息。本研究為闡明Jug在體內運輸、潛在生物毒害作用和指導臨床合理用藥提供了的實驗依據(jù)。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UV-2550紫外-可見分光光度計(日本島津公司); F280熒光分光光度計(天津港東公司); DELTA320型pH計(瑞士Mettler Toledo公司); DC-4006型高精度水浴鍋(上海菁海儀器公司); QL-901型振蕩器(江蘇海門其林貝爾公司); SG2200HP型超聲波清洗器(上海冠特公司); AB204-S型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

胡桃醌(Jug，純度≥98%，成都普菲德生物技術有限公司)用無水乙醇配制成1.0×10-3mol/L儲備液，使用時用無水乙醇稀釋成1.0×10-4mol/L。HSA (Sigma公司)用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.40， 含0.1 mol/L NaCl)配制成1.0×10-4mol/L儲備液。Jug和HSA儲備液均于4℃下避光保存。其它試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 實驗方法

2.2.1 熒光光譜和同步熒光光譜在8個7 mL離心管中，分別加入0、12、24、40、80、120、200和280 μL Jug溶液(1.0×10-4mol/L)，每個離心管中均移入40 μL HSA儲備液(1.0×10-4mol/L)，以Tris-HCl緩沖液定容至4 mL，獲得HSA與Jug的濃度比為1∶0、1∶0.3、1∶0.6、1∶1、1∶2、1∶3、1∶5和1∶7混合液，充分混合，恒溫水浴中靜止30 min，測量熒光光譜，激發(fā)波長(λex)為280 nm，發(fā)射波長(λem)范圍為290～410 nm，激發(fā)/發(fā)射狹縫為10 nm/5 nm。同步熒光光譜測定溶液配制過程同熒光光譜，Δλ=15 nm和Δλ=60 nm對應發(fā)射波長范圍分別為285～335 nm和310～370 nm。

2.2.2 紫外吸收光譜準確移取0、12、24、36、48、60、72和84 μL Jug儲備液(1.0×10-3mol/L)于8個7 mL離心管中，加入120 μL HSA儲備液(1.0×10-4mol/L)，用Tris-HCl緩沖液定容至4 mL，獲得HSA與Jug的濃度比為1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6和1∶7混合液，充分混合，室溫(20℃)下反應30 min。以相應濃度Jug溶液做參比，對Jug-HSA體系進行紫外吸收光譜分析，吸收波長范圍在200～400 nm。

2.2.3 三維熒光光譜在2個7 mL離心管中均加入40 μL HSA儲備液(1.0×10-4mol/L)，將160 μL Jug溶液(1.0×10-4mol/L)加入到其中1個離心管中，以Tris-HCl緩沖液定容至4 mL，獲得HSA與Jug的濃度比為1∶0和1∶4混合液，充分混合、室溫(20℃)下靜置30 min，熒光分光光度計掃描三維熒光光譜。激發(fā)波長范圍為200～350 nm，發(fā)射波長范圍為250～500 nm，激發(fā)和發(fā)射波長間隔均為5 nm，其它參數(shù)設置與熒光光譜相同。

2.2.4 結合距離測定實驗將40 μL HSA儲備液(1.0×10-4mol/L)、Jug溶液(1.0×10-4mol/L)分別加到2個7 mL 離心管中，以Tris-HCl緩沖液定容至4 mL，充分混合，室溫(20℃)下靜置30 min。測定HSA溶液熒光發(fā)射光譜，參數(shù)設置同2.2.1節(jié); 測定Jug溶液吸收光譜，波長范圍為200～410 nm。

2.2.5 分子對接模擬HSA的晶體結構來自蛋白質數(shù)據(jù)庫Protein Data Bank(蛋白質編碼： 4K2C)。Jug的3D結構由Pub Chem數(shù)據(jù)庫中獲得(Compound CID: 3806)。利用Auto Dock 4.2.5.1軟件對Jug與HSA進行分子對接模擬，應用Lamarckian Genetic Algorithm算法得到Jug與HSA結合構象，用PyMOL2.3.1.0軟件對結構構象進行可視化分析。

3 結果與討論

3.1 熒光光譜分析

圖1 Jug濃度對HSA內源熒光光譜影響Fig.1 Fluorescence spectra of human serum albumin(HSA) with different concentrations of Juglone (Jug)a-h, CHSA=1.0 μmol/L, CJug=0, 0.3, 0.6, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 7.0 μmol/L; i: CHSA=0, CJug=1.0 μmol/L; T=298 K, λex=280 nm

HSA含有1個色氨酸(Trp)、18個酪氨酸(Tyr)和30個苯丙氨酸(Phe)殘基，這些芳香氨基酸特別是Trp214使HSA具有較強的內源熒光[17,18]。280 nm光激發(fā)下，HSA最大熒光發(fā)射峰出現(xiàn)在343 nm， 而Jug僅有微弱的熒光發(fā)射，對實驗不產(chǎn)生“內濾光效應”干擾。在模擬人體生理條件下，不同濃度Jug對HSA熒光光譜影響結果見圖1。隨著Jug濃度不斷增加，HSA內源熒光強度呈現(xiàn)明顯減弱趨勢，熒光發(fā)射峰略藍移1.7 nm，但峰形沒有明顯變化，說明HSA生色基團所處的微環(huán)境有改變，Jug與HSA發(fā)生了反應。

3.2 相互作用機制分析

3.2.1 熒光猝滅機制藥物引起蛋白質熒光猝滅原因通常有靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅是藥物和蛋白質在基態(tài)時結合，形成不發(fā)熒光的復合物; 動態(tài)猝滅則是藥物和蛋白質激發(fā)態(tài)分子間發(fā)生電子或能量轉移過程。無論動態(tài)猝滅，還是靜態(tài)猝滅，作用過程均符合Stern-Volmer方程[13,14]：

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

(1)

圖2 不同溫度下Jug與HSA相互作用的Stern-Volmer曲線Fig.2 Stern-Volmer curves of fluorescence quenching of HSA by Jug at different temperatures

式中，F(xiàn)0和F分別為Jug加入前、后HSA內源熒光強度;Kq為雙分子碰撞過程速率常數(shù);τ0為HSA熒光壽命，約為1×10-8s; [Q]為Jug平衡濃度(μmol/L);Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù)。以F0/F對[Q]做線性擬合，繪制Stern-Volmer曲線(圖2)，可見在3個不同溫度下，Jug-HSA體系中F0/F-[Q]曲線均在[Jug]/[HSA]=1處出現(xiàn)明顯拐點，說明Jug對HSA熒光猝滅程度和方式與Jug濃度有關。

將F0/F對[Q] Stern-Volmer擬合，根據(jù)直線斜率可獲得猝滅常數(shù)Ksv和Kq值。由表1可知，兩個濃度范圍內，Jug對HSA熒光猝滅常數(shù)Ksv均隨溫度升高而減小，符合靜態(tài)猝滅特征。曲線存在[Jug]/[HSA]=1拐點，說明Jug對HSA的猝滅方式是以靜態(tài)猝滅為主的混合猝滅過程。3個溫度條件下的Kq值(1013和1012數(shù)量級)都大于生物大分子的最大分散碰撞猝滅常數(shù)(2×1010L/(mol·s))[15,16]，進一步證明Jug和HSA形成了復合物，引發(fā)其熒光猝滅。

3.2.2 結合常數(shù)和結合位點數(shù)蛋白質等生物大分子通常有相互獨立的結合位點。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線方程(lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q])，可以計算靜態(tài)猝滅中藥物分子與蛋白質間結合常數(shù)(KA)和結合位點數(shù)(n)[19]。以不同溫度下的lg(F0-F)/F對lg[Q]作圖(圖3)，由線性方程截距和斜率求出Jug與HSA的KA和n，結果見表2。n<1，說明在Jug和HSA分子上存在一個結合點。在人體生理pH值和溫度下，Jug與HSA間結合常數(shù)僅為3.72×102L/mol(310 K)，這較文獻[14]報道的萘醌類化合物紫草素與牛血清白蛋白間結合常數(shù)5.91×104L/mol(309 K)小2個數(shù)量級。原因在于紫草素比Jug多1個8-羥基和1個2-[(1R)-1-羥基-4-甲基戊-3-烯基]基團，即紫草素分子有3個羥基，而Jug分子有1個羥基。此結果說明萘醌類化合物羥基數(shù)量可以影響其與HSA結合常數(shù)大小。Jug與HSA間結合能力偏弱，血漿中HSA運輸和儲存Jug能力不強。由此推斷，游離態(tài)和Jug-HSA復合物應是Jug在血液循環(huán)中的兩種運輸方式。

表1 不同溫度下Jug對HSA的熒光猝滅常數(shù)

圖3 不同溫度下Jug和HSA相互作用的lg[(F0-F)/F]-lgCJug圖Fig.3 lg[(F0-F)/F] vs lgCJug graph describing the interaction of HSA and Jug at different temperatures

3.2.3 熱力學參數(shù)和主要作用力Jug分子中有1個羥基，氫鍵作用力可能參與Jug和HSA相互作用過程。通常藥物小分子與蛋白質間主要通過氫鍵、范德華力、靜電引力以及疏水作用力等非共價方式結合，形成超分子復合物[20]。Jug和HSA間的作用力類型可根據(jù)反應前后熱力學參數(shù)焓變(ΔH)和熵變(ΔS)的大小、正負判斷[21]。在模擬人體生理條件下，HSA結構穩(wěn)定，不會降解，Jug-HSA體系熱力學參數(shù)僅與Jug和HSA相互作用有關。根據(jù)Van′t Hoff定律[19,22]：

ΔG=-RTlnKA=ΔH-TΔS

(2)

lnKA=-ΔH/RT+ΔS/R

(3)

計算獲得Jug與HSA之間的ΔH、ΔS和ΔG值，結果見表2。ΔG<0，表明反應可自發(fā)進行; 由ΔH<0和ΔS<0確定， Jug和HSA之間作用力主要是范德華力和氫鍵。

表2 Jug-HSA體系在不同溫度下的結合常數(shù)、結合位點數(shù)及熱力學參數(shù)

3.2.4 結合距離藥物分子與蛋白質的結合距離可以利用F?rster非輻射能量轉移理論[23]進行計算，能量轉移效率(E)、臨界距離(R0)和結合距離(r)關系如下：

(4)

R06=8.79×10-25K2N-4φJ

(5)

(6)

式中，K2為偶極空間取向因子(取值2/3)，N為介質的折射率(取值1.336)，φ為供體在無受體存在時的熒光量子產(chǎn)率(取值0.118)，F(xiàn)(λ)為供體在波長λ處的熒光強度，ε(λ)為受體在波長λ處的摩爾吸光系數(shù)。

圖4 HSA的熒光發(fā)射光譜(a)和Jug紫外吸收光譜(b)的重疊圖Fig.4 Overlap spectrum of fluorescence emission of HSA (a) and absorbance spectrum of Jug (b)CHSA=CJug=1.0 μmol/L, T=298 K

HSA熒光光譜和Jug吸收光譜的重疊圖見圖4。根據(jù)公式(4)～(6)求得Jug與HSA濃度比為1∶1時， 重疊積分J=3.77×10-15(cm3·L)/mol，能量轉移效率E=0.21，臨界距離R0=2.09 nm，結合距離r=2.61 nm。r<7 nm且滿足0.5R0R0，表明非輻射能量轉移對熒光猝滅的貢獻較小，Jug對HSA內源熒光猝滅機制主要為靜態(tài)猝滅，這與熒光猝滅機制結論一致。

3.3 Jug對HSA構象影響分析

3.3.1 紫外吸收光譜分析紫外吸收光譜是研究藥物小分子對蛋白質二級結構影響的一種有效方法。HSA在278 nm處的紫外吸收主要由Trp和Tyr殘基苯雜環(huán)π→π*躍遷引起，可反映蛋白質芳香族氨基酸殘基信息[24]。Jug位于249.5 nm的吸收峰，則是由其分子1,4-萘醌結構π→π*躍遷引起。為了更加準確地體現(xiàn)出不同濃度Jug對HSA紫外吸收光譜影響，以相應濃度Jug溶液為參比液，掃描Jug-HSA體系的紫外光譜，結果見圖5(曲線a→h)。隨著Jug濃度增加，HSA在278 nm處的光吸收值逐漸增強，說明Jug使HSA的二級結構發(fā)生了改變。

3.3.2 同步熒光光譜分析同步熒光光譜具有簡化光譜、窄化譜帶和較少光譜重疊等優(yōu)點，常被用于研究蛋白質發(fā)光基團構象變化。通常情況下，Δλ=15 nm和Δλ=60 nm同步熒光光譜能夠選擇性地呈現(xiàn)Tyr和Trp殘基特征熒光。根據(jù)最大發(fā)射波長和強度變化可以獲得蛋白質相應氨基酸殘基微環(huán)境極性的改變信息，進而可以判斷藥物小分子對蛋白質構象的影響[13,25]。隨著研究體系中Jug濃度增大，Tyr和Trp殘基的同步熒光猝滅效果明顯(圖6)。代表Trp的熒光猝滅程度(30.84%)顯著大于Tyr (16.80%)，表明HSA與Jug結合部位更靠近Trp。Tyr殘基最大發(fā)射波長略藍移0.7 nm，表明與Jug作用在一定程度上影響了HSA構象，主要引起Tyr殘基附近微環(huán)境疏水性增加，對Trp影響甚微。

圖6 Jug濃度對HSA Δλ=15 nm(A)和Δλ=60 nm(B)同步熒光光譜的影響Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of Jug-HSA at (A) Δλ=15 nm and (B) Δλ=60 nmCHSA=1.0 μmol/L, CJug (a～h)=0， 0.3, 0.6, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 7.0 μmol/L; T=298 K

3.3.3 三維熒光光譜分析三維熒光光譜體現(xiàn)的是熒光強度隨激發(fā)波長(λex)和發(fā)射波長(λem)同時變化的信息，它是另外一種證實HSA構象和發(fā)光基團微環(huán)境是否發(fā)生改變的有效方法[26]。HSA與Jug作用前后的三維立體熒光光譜圖及三維熒光等高線如圖7和圖8所示。HSA三維熒光光譜圖中，Peak a為瑞利散射峰(λex=λem)，Peak 1(λex/λem/Intensity，230 nm/348.3 nm/153.0)為HSA多肽骨架結構熒光特征峰，Peak 2(λex/λem/Intensity，285 nm/348.3 nm/1329.8)為Trp、Tyr和Phe的重疊熒光峰。隨著Jug的加入，HSA的Peak 1(Intensity，104.4)和Peak 2(Intensity，818.5)的強度均有所降低，最大發(fā)射波長都藍移了0.9 nm。二級結構峰Peak 1強度降低及略藍移現(xiàn)象，表明Jug的加入引起了蛋白多肽鏈發(fā)生變化，進而導致HSA構象改變; Peak 2強度降低及藍移現(xiàn)象，顯示HSA中熒光基團微環(huán)境非極性略增，這與Δλ=15 nm同步熒光光譜結果一致。瑞利散射峰Peak a降低，說明與Jug作用破壞了HSA表面保護水層，使原本較為分散的蛋白質變得更加分散，蛋白質粒徑減小，Jug-HSA體系瑞利散射強度降低。

圖7 HSA溶液的三維熒光光譜圖(A)和等高線圖(B)Fig.7 Three-dimensional fluorescence spectra of HSA solution (A) and its contours (B)CHSA=1.0 μmol/L, T=298 K

圖8 HSA與Jug作用后的三維熒光光譜圖(A)和等高線圖(B)Fig.8 Three-dimensional fluorescence spectra of Jug-HSA solution (A) and its contours (B)CHSA=1.0 μmol/L, CJug=4.0 μmol/L, T=298 K

3.4 分子對接模擬分析

圖9 (A) Jug在HSA上的結合位置; (B) 放大的Jug與HSA分子對接模擬圖; (C)Jug和HSA相互作用圖Fig.9 (A) Binding site of Jug in HSA; (B) Enlarged binding mode between Jug and HSA; (C) Molecular modeling of interaction between Jug and HSA

4 結 論

在模擬人體生理條件下，采用內源熒光光譜、紫外吸收光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜和分子對接技術對Jug與HSA之間的結合過程進行了系統(tǒng)研究。結果表明，Jug主要通過氫鍵、范德華力和疏水作用力，與HSA自發(fā)形成摩爾比為1∶1的復合物。結合過程使HSA構象輕微改變，導致相關發(fā)光基團, 尤其是Tyr殘基周圍環(huán)境疏水性有所增加，兩者間結合距離為2.61 nm。分子對接結果進一步解釋并驗證了光譜分析的正確性，并給出了Jug在HSA亞域ⅢA結合位置以及參與氫鍵、范德華力和疏水相互作用的主要氨基酸殘基。Jug與HSA間結合常數(shù)為102數(shù)量級(310 K)，其值偏小，說明游離態(tài)和Jug-HSA復合物應是Jug在血液循環(huán)中的兩種運輸方式。本研究為深入理解Jug在體內的運輸儲藏過程和用藥安全性評估奠定了基礎。