黃美盈，袁耿彪，潘東風(fēng)，何雨蓓，李倩茹

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，重慶 400010； *通訊作者 袁耿彪 yuan_gb@126.com

腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，近年發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)。各種現(xiàn)代成像技術(shù)廣泛應(yīng)用于監(jiān)測(cè)腫瘤組織的結(jié)構(gòu)、功能和分子變化，包括光學(xué)成像（通過(guò)生物發(fā)光或熒光）、CT、MRI、PET、SPECT及超聲[1]。每種成像方法均有其獨(dú)特的強(qiáng)度和內(nèi)在的局限性，使得在疾病部位獲得精確可靠的信息變得困難[2]。多模態(tài)分子成像結(jié)合2 種或以上的檢測(cè)技術(shù)，形成一種新的成像方法，便于在診斷、治療、監(jiān)測(cè)等方面獲得進(jìn)一步的信息。目前，多模態(tài)分子成像已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究和臨床實(shí)踐的優(yōu)化，對(duì)心血管疾病、神經(jīng)精神疾病[3]和其他臨床疾病[4]均有幫助；還能顯著提高腫瘤邊界的定位，有效指導(dǎo)腫瘤的手術(shù)切除[5]。

由于近紅外熒光成像在生物成像方面仍存在一定的缺點(diǎn)，如組織滲透性較低，在癌癥的臨床應(yīng)用中僅適合淺表部位腫瘤的顯像，故本實(shí)驗(yàn)選用乳腺癌鼠瘤模型。本研究將近紅外熒光染料MHI 148、螯合劑1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二-1，4，7，10-四乙酸（1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7，10-tetraacetic acid，DOTA）與放射性核素177Lu 結(jié)合，形成多模態(tài)分子探針177Lu-DOTA-MHI 148，將探針注入荷乳腺癌裸鼠體內(nèi)，同時(shí)采用近紅外成像與γ 閃爍成像提高對(duì)腫瘤的診斷效率。本實(shí)驗(yàn)擬采用177Lu標(biāo)記DOTA-MHI 148，并對(duì)標(biāo)記物在乳腺癌MCF-7裸鼠體內(nèi)生物分布及活體成像進(jìn)行研究，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)177Lu-DOTA-MHI 148 對(duì)腫瘤的診療一體化提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 近紅外熒光染料DOTA-MHI 148（弗吉尼亞大學(xué)放射醫(yī)學(xué)系惠贈(zèng)）；人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 細(xì)胞株（重慶醫(yī)科超聲研究所）；177Lu 核素（西南醫(yī)科大學(xué)核醫(yī)學(xué)科）；裸鼠（重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），本研究符合重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)制訂的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)；鹽酸、醋酸鈉（成都科龍化工試劑廠）；CRC-15R 活度計(jì)（美國(guó)Capintee 公司）；SPECT 顯像儀（美國(guó)GE 公司）；SN-695B 型智能放免γ 計(jì)數(shù)器（上海物理研究所日環(huán)光電儀器有限公司）。

1.2177Lu-DOTA-MHI 148 的制備及標(biāo)記率的測(cè)定取DOTA-MHI 148 20 μg溶于10%乙醇溶液（1 mg/ml）放入EP 管中，將177LuCl32 mCi 和0.25 mol/L 醋酸鈉溶液加入上述溶液中，調(diào)整酸堿比為3∶1，于90℃下反應(yīng)30 min。采用高效液相分析法（HPLC）測(cè)定177Lu-DOTA-MHI 148 標(biāo)記率。HPLC 色譜條件：C18 色譜柱；紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)220 nm；流速1 ml/min；溶劑A 為0.1% TFA 的乙腈溶液，溶劑B 為0.1% TFA 的水溶液采用梯度洗脫：0～20 min 5%～85%溶劑A，20～25 min 85%～5%溶劑A。

1.3 構(gòu)建裸鼠乳腺癌動(dòng)物模型 將人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 用RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素雙抗）在37℃、5% CO2及常規(guī)濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用胰蛋白酶消化1 min，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至2.5×107/ml。選取18 只4 周齡左右的雌性裸鼠，將0.1 ml 細(xì)胞懸液接種至雌性裸鼠右側(cè)大腿皮下。待腫瘤長(zhǎng)至大于1.0～2.0 cm3時(shí)備用。

1.4177Lu-DOTA-MHI 148 在MCF-7 乳腺癌細(xì)胞荷瘤裸鼠的生物分布 選取12 只荷瘤裸鼠，隨機(jī)分成3 組，每組4 只。尾靜脈注射100 μl177Lu-DOTA-MHI 148（0.1 mCi），分別于注射12、24、48 h 后處死3 組裸鼠，取心臟、肝、脾、肺、腎、胃、腸、股骨、腫瘤、血液、左側(cè)大腿肌肉等組織器官，用天平準(zhǔn)確稱量器官重量，用γ計(jì)數(shù)器檢測(cè)各個(gè)器官的放射性計(jì)數(shù)。然后根據(jù)公式（1）計(jì)算各組織每克組織的百分注射劑量率（%ID/g）。

1.5177Lu-DOTA-MHI 148 在MCF-7 荷瘤鼠體內(nèi)的γ閃爍成像 按照上述標(biāo)記條件標(biāo)記177Lu-DOTA-MHI 148 備用。選取3 只已空腹6 h 的荷瘤鼠，準(zhǔn)備3 支一次性無(wú)菌注射器，每支注射器取0.1 ml177Lu-DOTA-MHI 148（0.3 mCi），在注射放射性藥物8、24、48 h 后，將裸鼠俯臥位固定于泡沫板上，進(jìn)行SPECT 靜態(tài)顯像，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)連續(xù)采集10 min，并觀察177Lu-DOTA-MHI 148 在裸鼠體內(nèi)的放射性濃聚隨時(shí)間的變化情況。采用針孔準(zhǔn)直器SPECT 顯像儀進(jìn)行圖像采集，主能峰為208 keV，副能峰為113 keV，矩陣128×128，放大倍數(shù)為3 倍。

1.6 裸鼠活體近紅外熒光成像 取3 只接種成功的裸鼠，準(zhǔn)備3 支一次性無(wú)菌注射器，每支注射器取177Lu-DOTA-MHI 148 100 μl，注射放射性藥物1、6、24、48、72 h 后進(jìn)行活體熒光成像。激發(fā)光/發(fā)射光為740 nm/820 nm。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1177Lu-DOTA-MHI 148 的標(biāo)記率及穩(wěn)定性 以90℃、pH 5～6、DOTA-MHI 148 20 μg、177LuCl32 mCi為制備條件，新鮮制備177Lu-DOTA-MHI 148（圖1），測(cè)得其1 h 時(shí)標(biāo)記率為（97.83±0.62）%（圖2）。在室溫25～27℃條件下，放置24 h 后，標(biāo)記物的標(biāo)記率略微降低，為（95.75±0.56）%，仍高于95%（圖3），1 h 與24 h 穩(wěn)定性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012），177Lu-DOTA-MHI 148 在室溫條件下具有較好的體外穩(wěn)定性。

2.2177Lu-DOTA-MHI 148 荷MCF-7 裸鼠體內(nèi)的生物分布177Lu-DOTA-MHI 148 在荷MCF-7 裸鼠體內(nèi)主要分布于腫瘤、血液、心、肝、腎等組織，隨著注射藥物后時(shí)間的增加，血液、心、肝、腎的%ID/g 逐漸降低，腫瘤的%ID/g 隨著注射藥物時(shí)間的增加而逐漸增加，表明177Lu-DOTA-MHI 148 在腫瘤組織中有較長(zhǎng)的滯留時(shí)間，并且在48 h 時(shí)，腫瘤內(nèi)標(biāo)記物分布達(dá)到最大，且腫瘤/肌肉比值達(dá)到最高，為40.53±16.09（表1）。

圖1 177Lu-DOTA-MHI 148 的分子結(jié)構(gòu)式

圖2 1 h 時(shí)177Lu-DOTA-MHI 148 的HPLC 圖譜

圖3 室溫放置24 h 后，177Lu-DOTA-MHI 148 的HPLC 圖譜

表1 177Lu-DOTA-MHI 148 在荷人乳腺癌裸鼠體內(nèi)的生物分布（%ID/g，±s，n＝4）

表1 177Lu-DOTA-MHI 148 在荷人乳腺癌裸鼠體內(nèi)的生物分布（%ID/g，±s，n＝4）

部位12 h 24 h 48 h心臟 1.64±1.23 0.93±0.27 0.78±0.12肝1.85±0.15 1.28±0.41 0.89±0.33脾 0.33±0.05 0.22±0.08 0.17±0.06肺0.57±0.05 0.36±0.11 0.20±0.08腎 2.65±0.86 1.07±0.25 0.46±0.22胃0.41±0.31 0.23±0.11 0.14±0.06骨骼 0.41±0.18 0.28±0.09 0.24±0.04肌肉0.23±0.04 0.16±0.04 0.11±0.03結(jié)腸 0.29±0.04 0.23±0.10 0.16±0.07血液3.16±1.87 2.09±0.77 1.01±0.13腫瘤 0.94±0.17 1.68±0.62 4.69±2.28腫瘤/肌肉比4.18±1.55 12.73±8.60 40.53±16.09

2.3177Lu-DOTA-MHI 148 在荷MCF-7 裸鼠體內(nèi)的γ閃爍成像 注射放射性藥物177Lu-DOTA-MHI 148 后，顯像圖示，隨著時(shí)間增加，腫瘤逐漸放射性濃聚增加，而其他各器官放射性分布逐漸減退，在48 h 時(shí)腫瘤顯像顯示荷瘤裸鼠的腫瘤部位有較高濃度的放射性攝取（圖4）。

2.4177Lu-DOTA-MHI 148 在荷MCF-7 裸鼠體內(nèi)的近紅外熒光成像 荷瘤裸鼠經(jīng)尾靜脈注射177Lu-DOTA-MHI 148 1 h 后，肝臟、心臟部位即刻顯影。腫瘤顯影較弱。隨著時(shí)間的推移，腫瘤部位熒光逐漸增強(qiáng)，腫瘤周背景熒光相對(duì)減弱，48 h 時(shí)腫瘤顯影效果最佳，并延續(xù)至72 h。使用儀器自帶軟件測(cè)量發(fā)現(xiàn)整個(gè)成像過(guò)程中腫瘤部位的熒光強(qiáng)度始終高于正常部位的熒光強(qiáng)度（圖5）。

圖4 荷人乳腺癌裸鼠注射177Lu-DOTA-MHI 148（0.3 mCi）后，分別于8 h（A）、24 h（B）、48 h（C）進(jìn)行γ 閃爍成像，顯示腫瘤位置（箭）

圖5 荷人乳腺癌裸鼠注射177Lu-DOTA-MHI 148 后分別在1、6、24、48、72 h（A～E）的近紅外熒光顯像情況及腫瘤與對(duì)照部位熒光強(qiáng)度測(cè)量值，腫瘤熒光信號(hào)明顯強(qiáng)于周圍皮膚

3 討論

近紅外熒光成像的發(fā)射波長(zhǎng)為600～900 nm，在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)吸收近紅外光的物質(zhì)少，在傳播過(guò)程中受到的干擾很小。同時(shí)近紅外成像具有高信噪比、高靈敏度、高分辨率、低成本、無(wú)創(chuàng)傷性、生物相容性好等優(yōu)勢(shì)[6-7]。近紅外熒光七甲川花菁染料，如IR-780、IR-783 和MHI 148 等，具有親脂性，不需要化學(xué)修飾，不需要與腫瘤特異性分子連接，自身即可高效蓄積在腫瘤細(xì)胞中，可被多種腫瘤細(xì)胞攝取，而在正常細(xì)胞內(nèi)攝取較少或無(wú)攝取，其進(jìn)入生物體后，可聚集在腫瘤組織，且近紅外熒光信號(hào)可保持較長(zhǎng)時(shí)間，而不聚集或僅少量聚集在正常組織中[8]。

Zhang 等[9]研究證實(shí)此類近紅外熒光吲哚七甲川菁染料能在腫瘤細(xì)胞線粒體中蓄積，與腫瘤細(xì)胞中的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)肽及缺氧誘導(dǎo)因子1α 有關(guān)。SLCO 基因編碼的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽是介導(dǎo)多種臨床藥物和內(nèi)源性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族[10]。HIF1 族經(jīng)常在多種類型的腫瘤中表達(dá)，并且通常與不良預(yù)后和快速表達(dá)疾病表型的預(yù)后相關(guān)。

既往已有研究將近紅外熒光七甲川花菁染料MHI 148與螯合劑DOTA結(jié)合形成DOTA-MHI 148，將其命名為探針PC-1001，用放射性核素64Cu 標(biāo)記探針PC-1001 構(gòu)成64Cu-PC-1001，有效實(shí)現(xiàn)了乳腺癌近紅外熒光與正電子發(fā)射斷層顯像[11]。后來(lái)又將近紅外熒光七甲川花菁染料MHI 148 與聯(lián)肼尼克酰胺相連，命名為PZ-1009。再與99Tcm結(jié)合，做成探針99Tcm-PZ-1009[11]，有效實(shí)現(xiàn)了關(guān)于近紅外熒光與單光子發(fā)射斷層顯像雙模式成像的研究。

本實(shí)驗(yàn)選用放射性核素177Lu，是較為理想的醫(yī)用放射性核素。與其他核素相比，177Lu 具有以下優(yōu)點(diǎn)：①衰期較長(zhǎng)（6.647 d），可供遠(yuǎn)距離運(yùn)輸，以及允許復(fù)雜的程序合成和純化放射性藥物；②177Lu 通過(guò)反應(yīng)堆大規(guī)模生產(chǎn)，易于獲得，價(jià)格低廉，比活度高；③可以發(fā)射出能量為112.95 keV（6.40%）、208 keV（11.00%）、321.3 keV（0.219%）、249.7 keV（0.212%）、和71.65 keV（0.15%）的γ 射線，可通過(guò)使用傳統(tǒng)SPECT 顯像，可對(duì)病灶進(jìn)行定位和測(cè)量，便于觀察患者體內(nèi)放射性藥物分布情況；④177Lu 能發(fā)射3 種能量分別為498 keV（79.3%）、380 keV（9.1%）和176 keV（12.2%）的β 粒子，用于腫瘤的治療[12]。β 粒子的能量射程短，能夠在對(duì)腫瘤組織進(jìn)行治療的同時(shí)減少正常組織損傷，并且對(duì)骨髓的抑制作用較輕。

然而，放射性核素探針也有其缺點(diǎn)，如空間分辨率低、暴露于輻射下、基礎(chǔ)代謝率高的組織（如大腦）大量攝取。由于七甲川花菁近紅外熒光小分子MHI 148 為親脂性陽(yáng)離子化合物，不需要與另外的化學(xué)基團(tuán)連接，可直接被腫瘤攝取，在癌細(xì)胞中特別積聚，并可通過(guò)近紅外熒光成像對(duì)腫瘤進(jìn)行影像診斷。因?yàn)榉派湫院怂爻上癖冉t外熒光成像具有更好的組織滲透性，核素成像和光學(xué)成像是提高熒光在生物組織中穿透深度的一種有吸引力的組合[13-14]。這種組合的造影劑不僅在成像中提供了詳細(xì)的空間分辨率，而且提高了腫瘤的診斷水平。

七甲川菁類染料MHI-148 具有良好的腫瘤聚集特性和較高的量子產(chǎn)率，在正常組織中顯示低攝取/滯留，代表一種新的腫瘤成像探針[15]。這些染料通過(guò)與放射性核素結(jié)合進(jìn)一步修飾，放射性同位素標(biāo)記染料不僅可以解決常規(guī)近紅外熒光染料滲透性差的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)成像，并且可以用于確定腫瘤的發(fā)生程度。近紅外光譜結(jié)合放射性同位素顯像可以為腫瘤的早期診斷提供新的方法。

本研究發(fā)現(xiàn)177Lu-DOTA-MHI 148 對(duì)乳腺癌具有良好的靶向作用。將該分子探針注入荷瘤裸鼠體內(nèi)48 h 后，在近紅外熒光成像與γ 閃爍成像中，腫瘤顯像清晰，并且腫瘤可在177Lu-DOTA-MHI 148 注射后較長(zhǎng)時(shí)間仍能清晰顯示。此外，體內(nèi)生物分布的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著注射時(shí)間的增加，腫瘤中177Lu-DOTA-MHI 148 的攝取逐漸增加，而其他正常組織中177Lu-DOTA-MHI 148 的攝取隨著時(shí)間的增加而減少，并且在48 h 時(shí)177Lu-DOTA-MHI 148 在腫瘤中的攝取高于其他正常器官組織。該化合物能迅速?gòu)难褐星宄?，并通過(guò)腎臟排泄。

本研究的局限性：①M(fèi)HI 148 進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的具體機(jī)制目前不清楚，有待進(jìn)一步研究；②盡管該藥物在腫瘤中攝取較高，但仍有一部分在腎、肝、心臟代謝器官中攝取，其攝取的特異性有待進(jìn)一步提高；③本實(shí)驗(yàn)對(duì)放射性核素177Lu 的治療作用未進(jìn)一步研究，該多模態(tài)分子探針177Lu-DOTA-MHI 148 的診療一體化作用尚有待通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。