王琴，馬鑫，徐靜，潘璐，張嬌，劉羅娜

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心臟中心功能檢查部，寧夏銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏銀川 750004； *通訊作者 王琴13995290877@163.com

近年來，越來越多的臨床和解剖學(xué)資料發(fā)現(xiàn)，肥胖導(dǎo)致的心臟病患者在出現(xiàn)冠狀動脈粥樣硬化前已出現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變[1]，但早期肥胖患者的心臟結(jié)構(gòu)與功能改變進(jìn)程尚未明確。目前認(rèn)為肥胖是一種慢性代謝性炎癥，是發(fā)生在脂肪組織的炎癥狀態(tài)。多種內(nèi)源性或外源性危險信號通過激活NLRP3 炎癥小體上調(diào)炎性因子的表達(dá)水平、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)慢性炎癥的發(fā)生、發(fā)展[2]。因此，深入研究NLRP3炎癥小體激活機(jī)制對肥胖早期心肌損傷防治具有重要意義。本研究應(yīng)用超聲生物顯微鏡（ultrasound biomicroscopy，UBM）追蹤觀察肥胖小鼠及正常小鼠心肌應(yīng)變及二維超聲的測值，并通過檢測NLRP3 炎癥小體蛋白水平表達(dá)，分析UBM 在監(jiān)測肥胖小鼠早期心肌損傷改變的作用及肥胖小鼠心肌損傷改變與NLRP3 炎癥因子的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取120 只6 周齡雄性C57BL/6 小鼠（合格證號為20180006001186），體重20～30 g，喂以高脂飼料。選取體重及Lee’s 指數(shù)分別大于對照組平均±1.5 倍標(biāo)準(zhǔn)差的肥胖小鼠模型60 只，分為肥胖模型組、肥胖+慢病毒空載體組、肥胖+NLRP3-miRNA 慢病毒組，每組20 只。肥胖+NLRP3-miRNA慢病毒組小鼠經(jīng)頸靜脈注射NLRP3-miRNA 慢病毒，劑量0.2×108TU/只，干預(yù)時間8 周。另納入20 只C57BL/6 小鼠與實(shí)驗(yàn)組同齡、同性別小鼠作為對照組。涉及動物所執(zhí)行的程序均獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 UBM 檢查方法

1.2.1 儀器及實(shí)驗(yàn)動物準(zhǔn)備 采用Vevo 2100 高分辨超聲成像系統(tǒng)（Visualsonics 公司），配置30 MHz 探頭，分辨率40 μm，選用RMV-707B 單晶片機(jī)械扇掃探頭，探頭頻率30 MHz。使用2%異氟烷麻醉小鼠，以仰臥位固定于恒溫平臺上，固定四肢并連接在心電圖電極。成像前使用化學(xué)脫毛劑脫去胸部毛發(fā)。麻醉開始后，采集小鼠心率平穩(wěn)時的超聲心動圖數(shù)據(jù)。

1.2.2 UBM 檢查方法 經(jīng)胸骨左緣、心尖等掃查窗口。分別采用二維、M 型和多普勒采集左心室長軸及各水平短軸、心尖四腔心切面，進(jìn)而測量其內(nèi)徑，并獲得各瓣口的血流頻譜。分析左心收縮及舒張功能。動態(tài)觀察小鼠左心室超聲生物學(xué)特性，包括形態(tài)學(xué)、血流動力學(xué)、功能、應(yīng)變的變化。形態(tài)學(xué)改變包括采集左心室長軸切面，測得室間隔左心室后壁厚度及左心室舒張及收縮內(nèi)徑。應(yīng)用M 型超聲測定室間隔及左心室后壁，左心室收縮末期內(nèi)徑（Ds）及舒張末期內(nèi)徑（Dd）。用Teichholtz 校正公式計算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）；血流動力學(xué)分析測定二尖瓣口舒張?jiān)缙谘魉俣龋‥）、舒張晚期血流速度（A）及兩者的比值；應(yīng)用應(yīng)變及應(yīng)變率顯像技術(shù)（VevoStrain，VisualSonics）測定左心室心肌應(yīng)變及應(yīng)變率參數(shù)。徑向和圓周應(yīng)變及應(yīng)變率由乳頭肌左心室短軸切面測得。軟件自動追蹤心內(nèi)膜得出心肌整體應(yīng)變及應(yīng)變率曲線，獲得各切面心肌應(yīng)變及應(yīng)變率參數(shù)。

1.2.3 心肌組織NLRP3 蛋白表達(dá) 采用免疫印跡法測定心肌組織NLRP3 炎癥蛋白表達(dá)。以裂解液裂解心肌組織，提取心肌組織蛋白。采用Bradford 法測定心肌組織的總蛋白含量。等量上樣，在12%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。以電轉(zhuǎn)膜方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，考馬斯亮藍(lán)染色，觀察轉(zhuǎn)移效果后洗脫。用含5%脫脂奶粉的TBS 緩沖液封閉過夜。兔抗大鼠NLRP3 單克隆抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，DAB 顯色。結(jié)果在圖像系統(tǒng)中進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0 軟件，計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二維超聲心動圖參數(shù)比較 UBM 測量對照組、肥胖組、肥胖+慢病毒空載體組、肥胖+NLRP3-siRNA 組小鼠二維超聲指標(biāo)左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、LVEF、心率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 各組小鼠常規(guī)超聲指標(biāo)比較（ ±s）

表1 各組小鼠常規(guī)超聲指標(biāo)比較（ ±s）

注：LVEDD 為左心室舒張末期內(nèi)徑，LVESD 為左心室收縮末期內(nèi)徑，IVSd 為室間隔厚度，LVPWd 為左心室后壁厚度，LVEF為左心室射血分?jǐn)?shù)

測量指標(biāo)肥胖組肥胖+慢病毒空載體組肥胖+NLRP3-siRNA 組對照組F 值P 值LVEDD（mm） 3.36±0.20 3.60±0.06 3.48±0.10 3.41±0.10 0.965 >0.05 LVESD（mm）2.44±1.15 2.55±0.05 2.44±0.10 2.40±0.10 1.721>0.05 IVSd（mm） 0.79±0.05 0.78±0.04 0.71±0.02 0.64±0.02 5.532 <0.05 LVPWd（mm）0.63±0.11 0.70±0.22 0.76±0.15 0.71±0.16 2.112>0.05 LVEF（%） 48.76±3.79 53.90±2.04 56.00±2.41 58.80±1.97 1.943 >0.05心率（次/min）441.90±9.40 458.00±15.44 425.40±23.20 445.70±10.81 0.575>0.05 E/A 1.71±0.28 1.70±0.60 2.02±0.68 1.67±0.34 2.137 >0.05

2.2 應(yīng)變參數(shù)比較 UBM 顯示對照組、肥胖組、肥胖+慢病毒空載體組、肥胖+NLRP3-siRNA 組小鼠縱向應(yīng)變及圓周應(yīng)變組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。肥胖組、肥胖+慢病毒空載體組小鼠縱向應(yīng)變參數(shù)明顯低于對照組及肥胖+NLRP3-siRNA 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 各組小鼠心外膜應(yīng)變參數(shù)比較（ ±s）

表2 各組小鼠心外膜應(yīng)變參數(shù)比較（ ±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與肥胖+NLRP3-siRNA 組比較，#P<0.05

參數(shù)對照組肥胖組肥胖+慢病毒空載組肥胖+NLRP3-siRNA 組F 值P 值縱向應(yīng)變 22.04±2.89 7.35±1.37*# 11.06±1.22*# 17.11±3.10 7.168 <0.05徑向應(yīng)變23.49±3.08 16.00±2.11 16.56±1.91 20.90±2.14 2.264>0.05圓周應(yīng)變 20.10±2.00 29.84±2.67 23.71±1.68 23.27±2.48 3.018 <0.05

2.3 NLRP3 蛋白水平比較 Western blot 顯示對照組及肥胖+NLRP3-siRNA 組小鼠的NLRP3 蛋白表達(dá)條帶明顯減低（圖1）。

3 討論

C57BL/6 小鼠是目前食物誘導(dǎo)肥胖代謝性疾病研究中常用的動物模型。肥胖C57BL/6 小鼠隨周齡增長可自然發(fā)生肥胖相關(guān)代謝異常所致心肌損傷，如無干預(yù)可發(fā)展至心力衰竭，與肥胖人群的心肌發(fā)展規(guī)律非常相似[3]。然而小鼠心率快、體積小，臨床所用的高頻超聲分辨力不理想。因此，準(zhǔn)確評估小鼠的心功能影像檢查比較困難。UBM 是一種無創(chuàng)、實(shí)時、活體、動態(tài)研究小動物微小結(jié)構(gòu)形態(tài)及功能評價的方法，分辨率達(dá)30 μm，圖像與組織切片具有高度相關(guān)性，可清晰顯示小鼠的心臟及大血管等微小結(jié)構(gòu)和多普勒血流信息，并進(jìn)行精確定量檢測以及連續(xù)動態(tài)觀察[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇UBM 觀察和測量肥胖小鼠的左心室結(jié)構(gòu)及功能具有良好的可行性。應(yīng)變及應(yīng)變率顯像是UBM 中檢測心肌功能的新技術(shù)[5]。心肌應(yīng)變指心肌在心動周期中發(fā)生的變形，可用于評價局部心肌的收縮功能與舒張功能、血供情況及心肌活力等[6]。應(yīng)變及應(yīng)變率顯像可定性及定量地顯示心肌收縮功能，為研究心臟整體和部分力學(xué)運(yùn)動提供了嶄新的定量方法。該方法無角度依賴，且?guī)l較高。因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用UBM 定量分析肥胖小鼠模型心肌收縮力學(xué)特征。

肥胖誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)是指心肌結(jié)構(gòu)、功能和表型的改變，包括心室質(zhì)量、體積或形態(tài)改變，纖維化含量增加，細(xì)胞肥大和細(xì)胞死亡等[7]。當(dāng)機(jī)體肥胖時，脂質(zhì)過度沉積于白色脂肪組織中，使其功能受損，減少了脂肪因子的分泌；同時心外膜和其他內(nèi)臟的脂肪組織釋放TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎性因子至循環(huán)系統(tǒng)，從而可能導(dǎo)致全身炎癥。系統(tǒng)性炎癥促進(jìn)心外膜脂肪組織的積累以及進(jìn)一步的局部和全身炎癥誘導(dǎo)終末器官功能障礙[8]。本研究結(jié)果顯示，肥胖組、肥胖+慢病毒空載體組較對照組、肥胖+NLRP3-siRNA 組小鼠室間隔厚度增大，在肥胖小鼠早期室間隔代償性增厚，心臟代償作用下心肌環(huán)向收縮功能增強(qiáng)。因此，肥胖組、肥胖+慢病毒空載體組較對照組、肥胖+NLRP3-siRNA 組小鼠圓周應(yīng)變增加；而肥胖組、肥胖+慢病毒空載體組較對照組、肥胖+NLRP3-siRNA 組小鼠縱向應(yīng)變減低，提示肥胖小鼠心臟形態(tài)學(xué)發(fā)生早期改變，心肌收縮力減低，提示肥胖早期心肌出現(xiàn)損傷，心臟結(jié)構(gòu)已發(fā)生重構(gòu)。NLRP3 炎癥小體是胞內(nèi)模式識別受體NLR 家族成員之一，參與炎癥反應(yīng)[9-10]。NLRP3 炎癥小體的激活是脂質(zhì)蓄積誘導(dǎo)肥胖發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，堆積的脂肪組織釋放炎癥介質(zhì)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)可以引起心肌重構(gòu)。本研究前期應(yīng)用應(yīng)變技術(shù)觀察到肥胖小鼠存在心肌早期收縮功能降低。Aloysius 等[11]在心肌梗死模型小鼠發(fā)現(xiàn)使用siRNA 或藥物抑制NLRP3 和P2X7 受體將使炎癥小體活化受到抑制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞死亡減少，最終減輕心肌重構(gòu)。因此，本研究采用Western Blot 檢測炎癥標(biāo)志物NLRP3 的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示NLRP3 蛋白在肥胖+NLRP3-siRNA 組及對照組的表達(dá)水平顯著減低，與上述研究結(jié)果一致，表明應(yīng)用NLRP3-siRNA 可以明顯改善肥胖小鼠的心肌炎癥，提示NLRP3 炎癥小體可能成為干預(yù)肥胖心肌早期損害發(fā)生及發(fā)展的重要靶標(biāo)，有必要進(jìn)一步探討其調(diào)控肥胖心肌損傷的分子機(jī)制。

圖1 NLRP3 各組蛋白水平比較。1 為對照組，2 為肥胖模型組，3 為肥胖+慢病毒空載體組，4 為肥胖+NLRP3-siRNA 慢病毒組

總之，UBM 可監(jiān)測肥胖小鼠的心肌收縮功能改變情況，應(yīng)變值可作為評估肥胖心肌收縮功能改變的一個準(zhǔn)確和有效的指標(biāo)，血清NLRP3 炎癥因子與肥胖心肌早期損傷有關(guān)。