賈晶晶，陳燕飛，程暉，燕平梅

(太原師范學(xué)院 生物系，太原 030619)

泡菜常作為下飯菜食用。它起源于3000多年前，具有保留所需原材料的營(yíng)養(yǎng)成分、色澤和香味等功能，這種功能使得泡菜在國(guó)內(nèi)外都備受歡迎[1,2]。乳酸菌在泡菜的發(fā)酵過程中通過產(chǎn)生有機(jī)酸來促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，幫助消化，預(yù)防便秘，增強(qiáng)人體免疫力。但目前在泡菜發(fā)酵過程中最受人們關(guān)注的問題就是亞硝酸鹽含量過高引起的安全問題[3]。在泡菜發(fā)酵初期，蔬菜中的乳酸菌生長(zhǎng)緩慢，酸堿環(huán)境還未形成，泡菜中含有的其他有害菌(大腸桿菌、黃桿菌屬等)中所含的硝酸還原酶可將泡菜中的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽[4]，當(dāng)亞硝酸鹽進(jìn)入人體后，一是可以引起高鐵血紅蛋白癥，這是由于血液中正常的低鐵血紅蛋白被氧化為高鐵血紅蛋白，降低紅細(xì)胞的攜氧能力；二是危害人類健康，甚至導(dǎo)致癌癥[5,6]，因此，如何在制作泡菜的過程中降低亞硝酸鹽的含量已成為首要問題。

隨著社會(huì)的急速進(jìn)步，人們的健康意識(shí)也在逐步加強(qiáng)，中藥的副作用小并易得，因此，使得很多學(xué)者開始研究[7]。黃芩是一種常用的中藥，有很好的清熱解毒、清火、止血、安胎、抗病毒、抗癌、降血脂等功效[8,9]。目前，劉云波等已證實(shí)黃芩具有體外抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌等作用[10]，但是中草藥在蔬菜發(fā)酵中的應(yīng)用研究還很少，尤其是黃芩，這使得此次實(shí)驗(yàn)具有極大的研究?jī)r(jià)值。

本次實(shí)驗(yàn)以白菜為材料, 通過借助黃芩的抑菌功效進(jìn)而探索在泡菜發(fā)酵過程中加入黃芩導(dǎo)致pH、亞硝酸鹽含量變化的過程以及對(duì)亞硝酸鹽形成菌數(shù)量的影響，從而找到一個(gè)在泡菜發(fā)酵過程中對(duì)人體危害較少、適宜食用的黃芩添加量。

1 材料和方法

1.1 材料

新鮮白菜、無碘食鹽：購自附近商店；黃芩：購自藥房。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理

將實(shí)驗(yàn)用到的刀、案板、電子天平等放入潔凈的工作臺(tái)中紫外殺菌20 min。將16個(gè)100 mL錐形瓶(洗凈并用棉塞塞住)置于立式滅菌器中，在121 ℃下滅菌20 min，并置于潔凈的工作臺(tái)中冷卻。將白菜用蒸餾水沖洗，在潔凈的工作臺(tái)內(nèi)案板上切碎，分別稱取30 g置于滅好菌備用的16個(gè)錐形瓶?jī)?nèi)。貼上標(biāo)簽(對(duì)照、1%、5%、10%各4瓶)。

量取適量自來水，按4%的比例加入食鹽、1%的比例加入黃芩，在電磁爐上加熱煮沸，冷卻后在帶有1%標(biāo)簽的錐形瓶?jī)?nèi)加入100 mL上述溶液。以不添加黃芩的為對(duì)照組，按上述步驟制作對(duì)照、5%、10%的黃芩溶液并分裝。

將16個(gè)分裝好的錐形瓶放入霉菌培養(yǎng)箱于30 ℃下培養(yǎng)備用。腌制那天算1 d，其后的5 d為第一次，每隔5 d選取含有不同濃度黃芩的泡菜各1瓶，在潔凈的工作臺(tái)上各取1 mL，用移液管稀釋至10-9進(jìn)行涂布。

1.2.2 發(fā)酵蔬菜鹵中亞硝酸鹽形成菌的分離和計(jì)數(shù)

將培養(yǎng)皿于立式滅菌器中滅菌，待冷卻后在潔凈工作臺(tái)內(nèi)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)倒入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基凝固后，用移液槍將0.1 mL濃度為10-9的稀釋樣品涂布到培養(yǎng)基上，而后倒置放在霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)于30 ℃進(jìn)行培養(yǎng)。第2天待菌落長(zhǎng)出來后再蓋一層SAN瓊脂培養(yǎng)基，固化后滴入N-1-萘基乙二胺溶液(1 g/L)1 mL，在霉菌培養(yǎng)箱中于30 ℃培養(yǎng)1 d后對(duì)變紅的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，此為亞硝酸鹽形成菌。

1.2.3 發(fā)酵白菜鹵中亞硝酸鹽含量的測(cè)定[11]

亞硝酸鹽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液，于25 mL帶塞試管內(nèi)備用。

稱取2.5 g從發(fā)酵瓶中排出的大白菜梗，用研缽研磨，加蒸餾水450 mL，加NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH至7.5以上，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加入5 mL ZnSO4溶液并混勻。在60 ℃水浴中加熱10 min，取出并靜置30 min充分搖勻，用濾紙過濾，棄去30 mL濾液后收集10 mL濾液倒入25 mL帶塞試管內(nèi)備用。

在上述備用試管內(nèi)加入氯化銨溶液(4.5 mL)、乙酸(2.5 mL)、顯色劑(5 mL)后加水至刻度，于暗處靜置25 min取出，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)吸光度并記錄，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 發(fā)酵白菜鹵中pH值的測(cè)定

通過數(shù)字pH計(jì)測(cè)定白菜發(fā)酵液的pH值。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

每5 d重復(fù)上述操作，并對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄，實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果為多次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。使用 Duncan單因素方差分析判斷其差異顯著性。

2 結(jié)果及分析

2.1 不同濃度黃芩處理液對(duì)發(fā)酵白菜亞硝酸鹽含量的影響

表1 發(fā)酵白菜中亞硝酸鹽含量(mg/kg)Table 1 The nitrite content (mg/kg) in fermented cabbage

由表1可知，從同一黃芩濃度的處理來看，亞硝酸鹽含量最高即“亞硝峰” 均是在第5天出現(xiàn)。而后第5～15 天的泡菜中亞硝酸鹽含量在顯著性降低，第20天時(shí)又開始顯著性增加，且第15 天時(shí)亞硝酸鹽含量顯著性低于其他天數(shù)，說明黃芩處理15 d時(shí)的泡菜是最好的。

從同一天的測(cè)量結(jié)果來看，隨著黃芩濃度的升高，亞硝酸鹽含量在顯著性下降，但是在濃度為10%時(shí)又開始顯著上升，此外，黃芩濃度為1%、5%、10%的處理組泡菜中亞硝酸鹽含量顯著低于對(duì)照組，說明泡菜在黃芩濃度為5%時(shí)適宜食用。

2.2 不同濃度黃芩處理液對(duì)發(fā)酵白菜亞硝酸鹽形成菌數(shù)量的影響

表2 發(fā)酵白菜中亞硝酸鹽形成菌數(shù)量(lg CFU/mL)Table 2 The number of nitrite-forming bacteria (lg CFU/mL)in fermented cabbage

由表2可知，從同一黃芩濃度的處理來看，第5天、第10天、第15天泡菜中亞硝酸鹽形成菌的數(shù)量顯著減少，第20天時(shí)又顯著性開始增加，且第15天亞硝酸鹽形成菌的數(shù)量顯著性低于其他天數(shù)，說明黃芩處理15 d時(shí)的泡菜是最好的。

從同一天的測(cè)量結(jié)果來看，隨著黃芩濃度的升高，亞硝酸鹽形成菌數(shù)量在顯著性降低，但是在濃度為10%時(shí)又開始顯著上升，此外，黃芩濃度為1%、5%、10%的處理組泡菜中亞硝酸鹽形成菌的數(shù)量顯著性低于對(duì)照組，說明泡菜在黃芩濃度為5%時(shí)適宜食用。

2.3 不同濃度黃芩處理液對(duì)發(fā)酵白菜pH值的影響

表3 發(fā)酵白菜中pH值Table 3 The pH values of fermented cabbage

pH值是判斷白菜發(fā)酵成熟度的關(guān)鍵指標(biāo)之一，同時(shí)pH值能改變微生物的生存環(huán)境，影響其生長(zhǎng)和代謝，間接影響泡菜的口感和風(fēng)味[12,13]。由表3可知，從同一黃芩濃度的處理來看，泡菜在第5～15天pH值有顯著下降趨勢(shì)，第20天時(shí)pH值又開始回升，且第15天時(shí)pH值顯著性低于其他時(shí)間，說明黃芩處理15 d時(shí)的泡菜是較好的。

從同一天的測(cè)量結(jié)果來看，隨著黃芩濃度的升高，pH值也在顯著性降低，但是在濃度為10%時(shí)又開始顯著性上升，并且黃芩濃度為1%、5%、10%的處理組的泡菜pH值顯著性低于對(duì)照組，說明泡菜在黃芩濃度為5%時(shí)適合食用。

3 討論

從本實(shí)驗(yàn)的研究中可以看出，在發(fā)酵到第5天時(shí)出現(xiàn) “亞硝峰”，研究表明亞硝酸鹽的產(chǎn)生是由于在發(fā)酵開始時(shí)發(fā)酵液中一些革蘭氏陰性菌(大腸桿菌等硝酸還原菌)的大量增殖，將白菜中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，使得亞硝酸鹽含量升高[14,15]。隨著發(fā)酵時(shí)間的繼續(xù)增加，瓶?jī)?nèi)的氧氣含量降低抑制了需氧菌的產(chǎn)生，厭氧性的乳酸菌成為優(yōu)勢(shì)菌種，乳酸含量增加，pH值降低，并且有害細(xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制，因此硝酸鹽難以轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽含量開始降低。但是在發(fā)酵到第20天時(shí)，發(fā)酵瓶?jī)?nèi)開始出現(xiàn)大量霉菌，霉菌具有很強(qiáng)的抗酸能力，因此在這個(gè)低pH值環(huán)境下能夠生存，但是發(fā)酵環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，霉菌會(huì)和乳酸菌爭(zhēng)奪發(fā)酵環(huán)境內(nèi)的糖類物質(zhì)[16]，從而使得乳酸菌含量降低，對(duì)這些有害菌的抑制作用開始減弱，硝酸鹽又開始被還原為亞硝酸鹽，因此在發(fā)酵到第20 天時(shí)，亞硝酸鹽含量又開始有上升趨勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)中添加黃芩溶液的處理組亞硝酸鹽含量顯著低于未添加黃芩溶液的對(duì)照組，表明向泡菜中加入黃芩溶液可以降低亞硝酸鹽含量。黃芩抑菌功效的發(fā)揮得益于它體內(nèi)的黃酮類化合物黃芩苷，它可以通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)來抑制它們的生長(zhǎng)繁殖。泡菜發(fā)酵過程中產(chǎn)生的革蘭氏陰性菌會(huì)被黃芩苷破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[17]，數(shù)量減少，硝酸鹽難以被還原，亞硝酸鹽的含量逐步降低。但是隨著黃芩濃度的增加，當(dāng)添加的黃芩溶液為10%時(shí)亞硝酸鹽含量顯著高于添加5%的黃芩溶液，而王娜的研究顯示：在中草藥水煮過程中除了會(huì)分離出有抑菌作用的黃酮類化合物，還會(huì)分離出淀粉、蛋白質(zhì)等無抑菌作用的物質(zhì)，而這類物質(zhì)往往會(huì)影響抑菌效果[18]，這也恰好說明了隨著黃芩濃度的提高，抑菌作用不一定會(huì)越來越好，因此可以得出結(jié)論：向泡菜中添加5%的黃芩溶液可以將亞硝酸鹽含量降低至合適的可食用狀態(tài)。

4 結(jié)論

在泡菜發(fā)酵過程中，黃芩溶液的添加會(huì)降低發(fā)酵白菜中的亞硝酸鹽含量。添加5%的黃芩溶液發(fā)酵15 d時(shí)泡菜中亞硝酸鹽的含量、亞硝酸鹽形成菌的數(shù)量均最少，使得泡菜對(duì)人體的危害最低，最適宜食用。