張錦華,張敏，范三紅*

(1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006；2.特色植物資源研究與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(山西大學(xué))，太原 030006)

紫蘇是一種既可以做藥材又可以做食材的植物，有紫綠色的莖和葉，其花朵比較大，為粉白色。紫蘇的適應(yīng)性很強(qiáng)，一般在野地、荒山、河邊、樹(shù)下都能看見(jiàn)它的身影[1]。在中國(guó)，紫蘇最早是作為中藥用于治療感冒風(fēng)寒，這是因?yàn)樽咸K性溫，古人均用其葉曬干以熱水沖泡來(lái)驅(qū)寒；而如今紫蘇的營(yíng)養(yǎng)被大眾所知，人們用紫蘇來(lái)烹制菜肴、做調(diào)味劑；紫蘇籽也可以經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)的加工制成食用油，除此之外，紫蘇中的一些多酚物質(zhì)如迷迭香酸可以制成香料用于化妝品中[2]。

迷迭香酸(rosemary acid，RosA)是一種水溶性的酚酸類(lèi)化合物，分子式為C18H16O8，分子量為360.33，穩(wěn)定性較好[3]。研究發(fā)現(xiàn)紫蘇花、葉、桿、籽中都有迷迭香酸的存在，其中花和葉中含量較多，紫蘇粕中也有迷迭香酸。迷迭香酸含量會(huì)因紫蘇的品種及采收期不同而不同，黃亮輝等人研究了不同采收期的紫蘇葉和白蘇葉中迷迭香酸的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙紫蘇葉、單紫蘇葉和白蘇葉的最佳采收期均為8月份[4]。迷迭香酸也可以通過(guò)植物組織培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)，培養(yǎng)液中各種因素(糖濃度、溶氧量、NH4NO3、KNO3)對(duì)迷迭香酸含量的影響，國(guó)內(nèi)外也做了大量的研究。隨著對(duì)迷迭香酸的深入研究發(fā)現(xiàn)，RosA不僅具有超強(qiáng)的抗氧化性及抑菌性[5]，它還可以通過(guò)提高黑色素的含量和促進(jìn)酪氨酸酶的表達(dá)來(lái)抑制光致癌[6]。除此之外，它還有提高機(jī)體免疫力、保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞[7]、抑制病理血管的生成等生理功能。

提取迷迭香酸的方法有很多，如超聲波提取法、酶輔助超聲提取法、有機(jī)溶劑提取法和熱水提取法等，黃丹丹等用酶輔助超聲提取貴州地區(qū)紫蘇迷迭香酸，在最佳提取條件下，得到1.426 mg/g的迷迭香酸，而只用纖維素酶來(lái)提取紫蘇迷迭香酸，在優(yōu)化條件下得到6.17 mg/g迷迭香酸[8]，此法雖然提高了迷迭香酸的得率，但纖維素酶水解纖維素產(chǎn)生了單糖或寡糖，引入了太多雜質(zhì)，為后期純化迷迭香酸增加了一定的難度。梅喜剛等人用硫酸提取紫蘇粕中的迷迭香酸，最終得到(0.541±0.02) mg/g的迷迭香酸[9]，周平等人用乙醇來(lái)提取青島地區(qū)紫蘇迷迭香酸，在最佳工藝下迷迭香酸含量為10.061 mg/g[10]，研究發(fā)酵和發(fā)芽對(duì)迷迭香酸的影響很少，但余茜等用NaCl-CaCl2處理大豆，可以使大豆中的酚類(lèi)物質(zhì)實(shí)現(xiàn)富集[11]；程磊等人用酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇，提高了赤蘚糖醇的產(chǎn)量[12]。

本研究分析了單面紅紫蘇、雙面紅紫蘇、紫蘇3號(hào)中迷迭香酸的分布和含量，并對(duì)其提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化；進(jìn)一步研究了在發(fā)酵和發(fā)芽條件下紫蘇迷迭香酸含量的變化情況，為后期迷迭香酸的提取以及綜合利用提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

單面紅、雙面紅、紫蘇3號(hào)：來(lái)自山西省百草盛生物科技有限公司；迷迭香酸標(biāo)品：白色結(jié)晶粉末，純度為99.46%，來(lái)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；發(fā)酵用培養(yǎng)基：蒸餾水30 mL、無(wú)水葡萄糖0.67 g、磷酸二氫鉀0.03 g、七水合硫酸鎂0.05 g、氯化鈉0.01 g、硫酸銨0.17 g。

DZKM-D-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 天津市大港區(qū)紅衫實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng)；Agilent Tecnnologies 126 InfinityⅡ高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；HRHPY-300恒溫培養(yǎng)搖床 青島海爾特種電冰柜有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RosA的提取

單面紅、雙面紅和紫蘇3號(hào) 3種不同品種紫蘇的葉、莖、籽經(jīng)粉碎后過(guò)20目的篩子，取1 g原料用于提取，以料液比為1∶50(W/V)加入50%的乙醇溶液，然后在65 ℃水浴鍋中加熱35 min，抽濾，抽濾后的殘?jiān)偬崛∫淮危褍纱蔚臑V液合并后用蒸發(fā)儀旋出濾液中的乙醇，用20%的鹽酸調(diào)節(jié)其pH 為2.0～2.5，最后用料液比為5∶3(V/V)的乙酸乙酯萃取3次，旋干萃取液，用2 mL甲醇溶解后過(guò)0.22 μm的有機(jī)濾膜待用。

1.2.2 RosA的測(cè)定與得率的計(jì)算

RosA含量用HPLC測(cè)定，色譜條件:色譜柱為Agilent TC-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈∶0.1%磷酸為30∶70，流速為1.0 mL/min。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：將迷迭香酸標(biāo)品配制成1 mg/mL濃度,從配制好的標(biāo)品溶液中分別吸取0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mL置于1 mL甲醇中，將其配制成20，40，60，80，100 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液[13]。采用高效液相色譜法測(cè)定，縱坐標(biāo)(Y)用峰面積表示，橫坐標(biāo)(X)用系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度表示。RosA得率如下：

式中:ρ為提取液中RosA的質(zhì)量濃度，mg/mL;V為甲醇的體積，mL; m為紫蘇質(zhì)量，g。

1.2.3 HPLC-MS對(duì)RosA的鑒定

將提取液中迷迭香酸用HPLC-MS技術(shù)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，參考文獻(xiàn)[14]，迷迭香酸測(cè)定的HPLC條件：采用WATERS BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流速0.20 mL/min，流動(dòng)相為0.1%甲酸和乙腈，按照以下流程洗脫：初始流動(dòng)相為5%乙腈，維持3 min后線(xiàn)性變化為30%乙腈，維持7 min后又變?yōu)?0%乙腈，2 min后變?yōu)?5%乙腈，0.5 min后回到初始流動(dòng)相。質(zhì)譜條件：所有的氣體均采用氮?dú)?，離子源(HESI)，噴霧電壓：2.5 kV；毛細(xì)管溫度：320 ℃；探針加熱器溫度：300 ℃，負(fù)離子掃描，掃描范圍100～1500 m/z[15,16]。

1.2.4 RosA提取優(yōu)化工藝

1.2.4.1 單因素試驗(yàn)

選取單面紅紫蘇葉做工藝優(yōu)化，將原料粉碎后過(guò)20目篩子，稱(chēng)取1 g用于單因素試驗(yàn)，固定乙醇濃度50%，加熱時(shí)間30 min，溫度60 ℃，考察料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(W/V)迷迭香酸的得率。固定料液比為1∶50(W/V)，加熱時(shí)間30 min,溫度60 ℃，考察30%、40%、50%、60%、70%乙醇的迷迭香酸得率。固定料液比為1∶50(W/V)，乙醇濃度40%，溫度60 ℃，考察加熱時(shí)間20，25，30，35，40 min的迷迭香酸得率。固定料液比為1∶50(W/V)，乙醇濃度40%，加熱時(shí)間35 min，考察溫度為50，55，60，65，70 ℃的迷迭香酸得率。

1.2.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析后，選擇料液比、乙醇濃度及提取溫度3個(gè)因素做響應(yīng)面優(yōu)化。響應(yīng)值為迷迭香酸的得率，設(shè)計(jì)響應(yīng)面因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface

1.2.5 微生物發(fā)酵對(duì)紫蘇RosA含量的影響

1.2.5.1 菌種的活化

用無(wú)菌水將高活性干酵母粉溶解后涂布到馬鈴薯固體培養(yǎng)基上，在28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d。待菌長(zhǎng)成后，再進(jìn)一步活化，重復(fù)活化幾次，以便得到較純的酵母菌。以上操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行[17]。

在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上接種干酪乳酸菌菌種，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，待菌長(zhǎng)成后，再進(jìn)一步活化。為了得到較純的乳酸菌，重復(fù)活化幾次。以上操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。

1.2.5.2 菌懸液的制備

配制馬鈴薯液體培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基各50 mL，分別接種活化好的酵母菌和干酪乳酸菌，之后在28，37 ℃的搖床中震蕩培養(yǎng)1 d，轉(zhuǎn)速為160 r/min。等到菌液渾濁后，將其在4000 r/min低速離心機(jī)中離心15 min，棄清液，用20 mL無(wú)菌水將沉淀制成菌懸液[18]。

1.2.5.3 微生物發(fā)酵紫蘇

取單面紅紫蘇作為試驗(yàn)品種，將其葉、籽、桿粉碎過(guò)篩后各取1 g于30 mL發(fā)酵用培養(yǎng)基中，分別加入2 mL活化好的酵母菌和干酪乳酸菌懸液，并在28 ℃和37 ℃的160 r/min搖床中發(fā)酵3 d后提取迷迭香酸并測(cè)定。

1.2.6 紫蘇籽發(fā)芽對(duì)RosA含量的影響

挑選顆粒飽滿(mǎn)的3種品種優(yōu)良的紫蘇籽，用自來(lái)水浸種24 h后放入發(fā)芽機(jī)中發(fā)芽，溫度為(25±5) ℃，每天定時(shí)噴灑自來(lái)水以保證紫蘇籽濕潤(rùn)[19]。待發(fā)芽后將發(fā)芽的紫蘇籽于30 ℃烘干粉碎過(guò)20目篩子，稱(chēng)取1 g后參照方法1.2.1測(cè)其迷迭香酸。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)的響應(yīng)面設(shè)計(jì)采用Design-Expert 10軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)，圖形采用Origin 9繪制，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均做3次平行處理，標(biāo)準(zhǔn)偏差采用Excel軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種紫蘇的葉、莖、籽中RosA含量的測(cè)定

迷迭香酸標(biāo)品的線(xiàn)性回歸方程y=45.299x-40.22，R2=0.9984。液相色譜圖見(jiàn)圖1。樣品中具有和標(biāo)品同樣的保留時(shí)間，為5.775 min。

a.樣品峰圖

b.標(biāo)品峰圖

單面紅、雙面紅和紫蘇3號(hào)的各部位中迷迭香酸含量見(jiàn)表2。迷迭香酸含量最多的是單面紅的葉，為1.27 mg/g，其次是雙面紅葉和單面紅籽，分別為0.93 mg/g和1.00 mg/g。紫蘇3號(hào)籽和葉中的含量無(wú)明顯差異，分別為0.70 mg/g和0.72 mg/g，單面紅莖、雙面紅莖和籽中迷迭香酸含量分別為0.39，0.45，0.50 mg/g。而迷迭香酸含量最少的是紫蘇3號(hào)莖，為0.04 mg/g，可見(jiàn)迷迭香酸的含量在紫蘇品種中具有一定的多樣性。

表2 3種不同紫蘇的葉、莖、籽中迷迭香酸含量Table 2 The rosemary content in leaves, stems andseeds of three different kinds of perilla

2.2 HPLC-MS對(duì)RosA的鑒定

采用HPLC-MS對(duì)提取液中的目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，迷迭香酸標(biāo)品及樣品的總離子流色譜圖和一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2和圖3?？傠x子流譜圖顯示，在同一保留時(shí)間下樣品與標(biāo)品有相同的吸收峰，而樣品的母離子為m/z=359.077([M+H]+)、子離子為m/z=161.023，檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)品相同，確定樣品中的目標(biāo)產(chǎn)物為迷迭香酸。

圖2 迷迭香酸標(biāo)品 HPLC-MS圖Fig.2 HPLC-MS diagrams of rosemary acid standard samples

圖3 樣品HPLC-MS圖Fig.3 HPLC-MS diagrams of samples

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖4 料液比對(duì)迷迭香酸得率的影響 Fig.4 Effect of ratio of solid to liquid on the yield of rosemary acid

圖5 乙醇濃度對(duì)迷迭香酸得率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the yield of rosemary acid

圖6 提取時(shí)間對(duì)迷迭香酸得率的影響 Fig.6 Effect of extraction time on the yield of rosemary acid

圖7 提取溫度對(duì)迷迭香酸得率的影響Fig.7 Effect of extraction temperature on the yield of rosemary acid

由圖4可知，乙醇濃度、提取時(shí)間和提取溫度不變時(shí)，料液比不斷增加，迷迭香酸的得率近乎直線(xiàn)上升，原因是溶劑量越多，原料與溶劑可以更好地接觸，當(dāng)料液比為1∶50時(shí)得率達(dá)到最大，而1∶60時(shí)得率下降，因此選取最佳的料液比為1∶50。由圖5可知，其他因素不變，乙醇濃度在30%～40%之間時(shí)，得率隨乙醇濃度的增大也隨之增大，40%、50%、60%時(shí)得率相同且達(dá)到最大，之后得率隨乙醇濃度的增大反而急速減小，可能乙醇濃度越大，將紫蘇中的其他物質(zhì)提取出來(lái)，迷迭香酸提取受到了影響，因此最佳的乙醇濃度為40%。由圖6可知，提取時(shí)間在20～35 min時(shí)，得率在緩慢穩(wěn)定上升，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到35 min時(shí)得率最高，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，得率略微下降，所以35 min為提取的最佳時(shí)間。由圖7可知，迷迭香酸得率隨提取溫度的升高先驟然增大，55 ℃時(shí)有最大得率，高于55 ℃后，得率先緩慢下降，65 ℃后又急速下降，可能是溫度過(guò)高，迷迭香酸在高溫下降解或轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，因此最佳的提取溫度為55 ℃?？梢?jiàn)提取時(shí)間對(duì)迷迭香酸提取率的影響不顯著，而其他3個(gè)因素對(duì)迷迭香酸的提取有顯著影響，所以進(jìn)一步選擇料液比、乙醇濃度和提取溫度3個(gè)對(duì)迷迭香酸得率影響較大的因素做響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

為了研究響應(yīng)值與3個(gè)變量之間的邏輯關(guān)系，用Design-Expert 10.0軟件中的Box-Behnken對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。迷迭香酸得率(Y)與料液比(A)、乙醇濃度(B)和提取溫度(C)之間的二次多項(xiàng)式方程:Y=0.16+0.016A+0.012B-0.0001826C+0.005959AB+0.005977AC+0.006262BC-0.012A2-0.026B2-0.016C2。

表3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Response surface analysis test design and results

用Design-Expert 10.0軟件對(duì)所得的回歸方程進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腜值是0.0005，遠(yuǎn)低于0.01，表明該試驗(yàn)的模型是極顯著的，失擬項(xiàng)的P值為0.515>0.05，說(shuō)明誤差不顯著，而且模型線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2為95.74%，調(diào)整決定系數(shù)RAdj2為90.27%，表明該模型具有很高的擬合度，因此該模型可以用來(lái)分析和預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。一次項(xiàng)A，B及二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果有顯著影響(P<0.05)。

表4 回歸方程各項(xiàng)方差的分析結(jié)果Table 4 Analysis results of variances of regression equations

2.4.2 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

響應(yīng)面圖及對(duì)應(yīng)的等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖8。

a.乙醇濃度(%)與料液比(g/mL)

b.提取溫度(℃)與料液比(g/mL)

c.提取溫度(℃)與乙醇濃度(%)

由圖8中a可知，乙醇濃度為30%～40%時(shí)，料液比不斷增大，迷迭香酸得率也在不斷增大，只是越往后增大的幅度不大，乙醇濃度在40%～50%之間，迷迭香酸得率隨料液比的增大而增大，增大幅度較大，當(dāng)料液比為1∶40～1∶50時(shí)，迷迭香酸得率隨乙醇濃度的增大呈現(xiàn)先升后緩慢下降的趨勢(shì)；而料液比為1∶50～1∶60時(shí)，迷迭香酸得率隨乙醇濃度的增加急劇升高且無(wú)明顯下降趨勢(shì)。由圖8中b可知，當(dāng)提取溫度在50～55 ℃范圍內(nèi)，迷迭香酸得率隨料液比的增大緩慢上升，55～60 ℃時(shí)迷迭香酸得率隨料液比增大先迅速升高到最高點(diǎn)后緩慢下降；而當(dāng)料液比一定時(shí)，迷迭香酸得率隨著提取溫度的增大呈現(xiàn)出先增后降的趨勢(shì)。由圖8中c可知，當(dāng)提取溫度為50～55 ℃時(shí)，迷迭香酸得率隨乙醇濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且上升和下降趨勢(shì)顯著；提取溫度在55～60 ℃范圍內(nèi)，迷迭香酸得率隨乙醇濃度的增加先呈現(xiàn)大幅度升高后趨于平緩；而乙醇濃度固定不變時(shí)，迷迭香酸含量隨溫度的變化先小幅度上升后小幅度下降。

2.4.3 試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

用軟件分析后，提取迷迭香酸最優(yōu)條件是料液比為1∶57.804、乙醇濃度為43.427%、提取溫度56.064 ℃， 為了試驗(yàn)的可行性修正為料液比為1∶60、乙醇濃度為40%、提取溫度為55 ℃。取1 g粉碎后的單面紅紫蘇葉，按照上述最優(yōu)條件做3次驗(yàn)證試驗(yàn)，迷迭香酸平均得率為0.161%±0.002%，與理論值0.164%相近，因此說(shuō)明該響應(yīng)面設(shè)計(jì)十分合理。

2.5 微生物發(fā)酵對(duì)單面紅紫蘇不同部位中RosA含量的影響

用酵母菌和干酪乳酸菌發(fā)酵單面紅，單面紅中迷迭香酸含量變化情況見(jiàn)圖9。

圖9 微生物發(fā)酵紫蘇Fig.9 Microbial fermentation of perilla

由圖9可知，單面紅無(wú)論是用酵母菌還是乳酸菌發(fā)酵，其中的迷迭香酸含量都大大減少了，比較直觀(guān)的是紫蘇葉和紫蘇桿。酵母菌發(fā)酵后紫蘇葉中的迷迭香酸含量從1.27 mg/g驟降至0.008 mg/g，降了99.4%，紫蘇桿中的迷迭香酸含量從0.39 mg/g驟降為0.01 mg/g，降了97.4%；而干酪乳酸菌發(fā)酵之后紫蘇葉和桿分別下降了98.4%和9%。酵母菌發(fā)酵紫蘇籽后迷迭香酸含量從1.0 mg/g減少為0.54 mg/g，減少了46%；干酪乳酸菌發(fā)酵后紫蘇籽中的迷迭香酸含量從1.0 mg/g減少為0.25 mg/g，減少了75%。推測(cè)其原因，一方面可能是微生物在發(fā)酵過(guò)程中，迷迭香酸作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被微生物利用代謝掉了，另一方面可能是紫蘇中的多酚氧化酶在相應(yīng)的環(huán)境活性增強(qiáng)，將迷迭香酸氧化為其他物質(zhì)。

2.6 紫蘇籽發(fā)芽對(duì)RosA含量的影響

處理后雙面紅紫蘇籽沒(méi)有萌芽狀態(tài)，單面紅和紫蘇3號(hào)紫蘇籽在培養(yǎng)箱中發(fā)芽后迷迭香酸含量變化見(jiàn)圖10。

圖10 發(fā)芽后迷迭香酸含量Fig.10 Rosemary acid content after germination

由圖10可知，單面紅紫蘇籽發(fā)芽后迷迭香酸含量從未發(fā)芽時(shí)的1.0 mg/g升高到1.5 mg/g，升高了50%，紫蘇3號(hào)紫蘇籽中迷迭香酸含量從未發(fā)芽時(shí)的0.8 mg/g下降到0.5 mg/g，降低了37.5%，而雙面紅未能發(fā)芽，由此可見(jiàn)通過(guò)籽發(fā)芽處理可以顯著提高單面紅籽中迷迭香酸含量。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)用乙醇水溶液來(lái)提取3種不同品種紫蘇中的迷迭香酸，過(guò)程簡(jiǎn)單，通過(guò)水浴加熱，使細(xì)胞高溫破碎，其中的迷迭香酸大量流出，相對(duì)于酶法提取來(lái)說(shuō)也減少了雜質(zhì)的引入，減少了后期的純化步驟。迷迭香酸的分布和含量具有一定的多樣性，不同品種紫蘇中迷迭香酸的含量不同，同一品種不同部位的含量也不同，試驗(yàn)處理中由山西省百草盛生物科技有限公司提供的單面紅紫蘇葉中迷迭香酸含量最高，為1.61 mg/g。Design-Expert 10.0軟件中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化出提取迷迭香酸的最佳條件為料液比1∶60、乙醇濃度40%、提取溫度55 ℃。在最優(yōu)條件重復(fù)3次試驗(yàn)，得出迷迭香酸得率為0.161%±0.002%，比黃丹丹等人用酶輔助超聲提取高了0.018%，進(jìn)一步通過(guò) HPLC-MS來(lái)鑒定提取液中的目標(biāo)物，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物的一級(jí)質(zhì)譜圖和二級(jí)質(zhì)譜圖與迷迭香酸標(biāo)品完全相同，由此確定試驗(yàn)的目標(biāo)產(chǎn)物為迷迭香酸。

用真菌酵母菌和細(xì)菌干酪乳酸菌分別發(fā)酵單面紅，發(fā)現(xiàn)單面紅的葉、籽、桿中迷迭香酸含量都大大減少了。酵母菌在缺氧環(huán)境下，將紫蘇中的糖類(lèi)轉(zhuǎn)化為二氧化碳和乙醇，迷迭香酸結(jié)構(gòu)中含有羧基，乙醇中的羥基和羧基在合適的條件下可能會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，相類(lèi)似乳酸菌異型發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇也可能會(huì)與迷迭香酸中的羧基發(fā)生反應(yīng)，降低了迷迭香酸含量。其次，紫蘇細(xì)胞壁有多酚氧化酶的存在，發(fā)酵過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生促進(jìn)多酚氧化酶活性的物質(zhì)，使得迷迭香酸含量大大減少，這與Seyed M B H等用植物乳桿菌發(fā)酵伏?；ㄖ?，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后花汁總酚類(lèi)化合物、花色苷和抗壞血酸含量顯著降低的結(jié)論一致[20]。而單面紅紫蘇籽發(fā)芽以后，迷迭香酸含量比發(fā)芽之前增加了50%，可能與發(fā)芽過(guò)程中酶的作用、促進(jìn)活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化有關(guān)，這與余茜等人用鹽發(fā)芽大豆使大豆酚類(lèi)物質(zhì)富集的結(jié)論一致，但富集的機(jī)理需進(jìn)一步研究。