劉 博，張 媛，袁 璐，曾 雪，李春雪，楊麗萍，王秀麗，辛凌翔，李 建，羅玉峰

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 海淀 100081；2.遼寧益康生物股份有限公司，遼寧 遼陽 111000；3.哈藥集團生物疫苗有限公司，黑龍江 哈爾濱 150069)

豬丹毒是由豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusiopathiae,E.rhusiopathiae)引起豬的一種急性、熱性傳染病[1]。急性型豬丹毒具有病程短、死亡率高等特點，再加上抗生素藥物使用的局限性，采用疫苗免疫接種是防控豬丹毒的首選[2-3]。

二〇一五版《中國獸藥典》中收錄的豬丹毒活疫苗有豬丹毒活疫苗GC42株、豬丹毒活疫苗G4T10株以及豬瘟、豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌病三聯(lián)活疫苗[4]?；罹嫈?shù)是豬丹毒類活疫苗質(zhì)量標準一個重要的檢驗參數(shù)。本試驗制備并標定了一批豬丹毒活疫苗活菌計數(shù)參考品[5]，以期可以對豬丹毒類活疫苗活菌計數(shù)進行質(zhì)控，以保證疫苗活菌計數(shù)檢驗結(jié)果的客觀公正，提高檢驗工作效率。

1 材料與方法

1.1 材料 豬丹毒活疫苗活菌計數(shù)參考品由遼寧益康生物股份有限公司制備?；罹嫈?shù)用馬丁瓊脂以及馬丁肉湯培養(yǎng)基由中海生物科技有限公司提供?；罹嫈?shù)用馬血清、一次性吸管，均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。培養(yǎng)皿購自青島金典生化器材公司。

1.2 方法

1.2.1 豬丹毒活疫苗活菌計數(shù)參考品的制備 采用豬丹毒桿菌弱毒株GC42制備一批(500瓶)豬丹毒活疫苗活菌計數(shù)參考品。按照現(xiàn)行《中國獸藥典》三部豬丹毒活疫苗質(zhì)量標準對參考品的性狀、純粹檢驗、活菌計數(shù)、真空度測定、剩余水分等參數(shù)進行檢驗[6]。檢驗參數(shù)均合格后，隨機抽取100瓶，快遞至A單位、B單位和C單位，收到樣品后及時放入-70 ℃以下冰箱中保存。

1.2.2 培養(yǎng)基的篩選 委托中海生物科技有限公司采購來源不同的6個批次的豬胃。按照《中國獸藥典》二〇一五版附錄中配方，配制了6批相應(yīng)的馬丁瓊脂以及馬丁肉湯培養(yǎng)基[7]。隨后隨機選取3瓶參考品，由2名檢驗員分別用6批次培養(yǎng)基對參考品進行計數(shù)并進行t檢驗以及穩(wěn)健統(tǒng)計分析。根據(jù)結(jié)果選擇適宜的培養(yǎng)基，統(tǒng)一換成翻口膠塞后，隨機挑選100瓶馬丁肉湯和100瓶馬丁瓊脂，郵寄至B單位和C單位。

1.2.3 均一度檢驗 由2名檢驗員隨機抽取10瓶參考品進行計數(shù)，分析變異系數(shù)。

1.2.4 參考品的協(xié)作標定 依照《中國獸藥典》2015年版三部通則“生物制品國家標準物質(zhì)制備和標定規(guī)定”，協(xié)作標定一共有A、B、C三家單位參加，每家單位2名檢驗員，每名檢驗員對3瓶參考品進行活菌計數(shù)，每瓶參考品進行2次重復(fù)試驗[8]。統(tǒng)計不同檢驗員在不同時間、不同實驗室活菌計數(shù)的結(jié)果。根據(jù)CNAS-GL02:2006《能力驗證結(jié)果的統(tǒng)計處理和能力評價指南》中穩(wěn)健統(tǒng)計方法[9]，計算Z比分值，去掉了可疑及不滿意的數(shù)據(jù)，將剩余數(shù)據(jù)計算出平均值和標準差，并將平均值加減2個標準差作為定值范圍。

1.2.5 運輸穩(wěn)定性試驗 考慮參考品在實際應(yīng)用中會存在長距離運輸?shù)那闆r，進行運輸過程的模擬，以評估參考品的穩(wěn)定性。首先由A單位2名檢驗員隨機抽取3瓶參考品進行計數(shù)。隨后在夏季和冬季分別讓B、C兩家單位寄3瓶參考品至A單位(運輸條件為將樣品與生物冰袋放置在隔熱泡沫箱內(nèi)，運輸時間48 h左右)，再由A單位2名檢驗員進行計數(shù)。

1.2.6 加速熱穩(wěn)定性試驗 參考品保存溫度為-70 ℃，試驗中進行了加速熱穩(wěn)定性試驗，以考核參考品在不同存放溫度下的穩(wěn)定性。隨機抽取參考品，分別置于2～8 ℃、25 ℃、37 ℃、-20 ℃條件下，每隔7 d隨機抽取3瓶進行活菌計數(shù)，共監(jiān)測6周，評估參考品的穩(wěn)定性。

1.2.7 參考品的保存期試驗 考慮到對保存期的延長有助于同批次參考品的應(yīng)用，參考品的保存期被制定在了-70 ℃。每2個月對參考品進行一次標定，并與協(xié)作標定的數(shù)據(jù)進行比較。每3個月對參考品的剩余水分含量、真空度進行測定。每6個月對參考品的性狀、純粹性進行測定。與初始值進行比較，以探索參考品的保存期。

1.2.8 參考品在檢驗中的初步應(yīng)用 在檢驗工作中對參考品進行了初步應(yīng)用。同一名檢驗員在5個批次檢品的檢驗中均同時對參考品進行計數(shù)，作為結(jié)果判定的標尺。

2 結(jié)果

2.1 參考品的制備與檢驗 豬丹毒活疫苗活菌計數(shù)參考品性狀為海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加生理鹽水后迅速溶解。純粹檢驗結(jié)果為5/5純粹生長。真空度測定結(jié)果為5/5紫色輝光。剩余水分測定結(jié)果為2.2%、2.4%、2.2%、2.2%，均小于3.0%?；罹嫈?shù)結(jié)果為9.8×108CFU/頭份。

2.2 培養(yǎng)基的篩選 a、b兩名檢驗員使用6批培養(yǎng)基對3瓶參考品計數(shù)(計數(shù)單位為×107CFU/頭份)，1號培養(yǎng)基計數(shù)結(jié)果為142、98、98、117、136、114；2號培養(yǎng)基計數(shù)結(jié)果為100、117、120、114、114、104；3號培養(yǎng)基計數(shù)結(jié)果為124、98、100、116、118、104；4號培養(yǎng)基計數(shù)結(jié)果為137、104、116、112、122、100；5號培養(yǎng)基計數(shù)結(jié)果為127、110、114、106、108、110；6號培養(yǎng)基計數(shù)結(jié)果為110、117、126、120、113、104。

分別將2、3、4、5、6號培養(yǎng)基的計數(shù)結(jié)果與1號培養(yǎng)基計數(shù)結(jié)果進行t檢驗，結(jié)果提示，相互之間沒有顯著差異，即6個批次的培養(yǎng)基質(zhì)量無顯著差異。將每批次的培養(yǎng)基6個計數(shù)結(jié)果進行穩(wěn)健統(tǒng)計分析，比對檢驗員數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。1～6號培養(yǎng)基穩(wěn)健分析結(jié)果(Z值)分別為1.0、-0.8、-1.5、0.5、3.4、2.7；-1.8、0.8、0.4、-0.3、-0.4、0；-0.1、-0.8、-1.3、0.3、0.4、0；0.7、-0.3、0、-1.1、1.1、-1.3；0.1、0.2、-0.1、-3.1、-1.5、1.7；-1.1、0.8、0.9、1.5、-0.5、-0.1。選擇檢驗員數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定的(Z值絕對值之和最小)3號培養(yǎng)基作為后續(xù)試驗所用的培養(yǎng)基。

2.3 均一度檢驗 2名檢驗員隨機抽取10瓶參考品進行計數(shù)(計數(shù)單位為×107CFU/頭份)。檢驗員a計數(shù)平均值為108，標準差為7.8，變異系數(shù)7%；檢驗員b計數(shù)平均值為106.5，標準差為6.8，變異系數(shù)為6%。2名變異系數(shù)均小于10%，說明樣品均一度良好。

2.4 協(xié)作標定 對3家單位協(xié)作標定結(jié)果進行穩(wěn)健統(tǒng)計分析(計數(shù)單位為×107CFU/頭份)。A單位計數(shù)結(jié)果/Z值分別為99/-0.4、95/-0.8、103/-0.1、76/-2.3、91/-1.1、83/-1.8、124/1.6、137/2.8、120/1.3、122/1.5、116/1.0、104/0.0；B單位計數(shù)結(jié)果/Z值分別為101/-0.3、106/0.2、107/0.3、121/1.4、97/-0.6、96/-0.7、111/0.6、117/1.1、112/0.7、117/1.1、102/-0.2、104/0.0；C單位計數(shù)結(jié)果/Z值分別為96/-0.6、115/0.9、96/-0.6、102/-0.2、112/0.7、94/-0.9、99/-0.4、103/-0.1、109/0.4、102/-0.2、108/0.4、97/-0.6。

去掉2個可疑及不滿意的數(shù)據(jù)(Z絕對值大于等于2)，將剩下的34個數(shù)據(jù)計算出平均值(105)和標準差(10)，參考品每頭份含活菌數(shù)為8.5×108～12.5×108CFU。

2.5 運輸穩(wěn)定性試驗 B、C兩家單位分別于2017年12月以及2018年7月寄3瓶參考品至A單位，A單位2名檢驗員對一共12瓶樣品進行計數(shù)(計數(shù)單位為×107CFU/頭份)。參考品夏季經(jīng)過運輸后，2名檢驗員計數(shù)結(jié)果分別為98、95、89、90、83、89、101、95、106、92、105、97；冬季經(jīng)過運輸后，2名檢驗員計數(shù)結(jié)果分別為96、97、90、89、99、101、112、101、95、103、98、95。計數(shù)結(jié)果均在參考品定值范圍內(nèi)，說明在48 h內(nèi)的運輸過程中參考品計數(shù)值可以保持穩(wěn)定。

2.6 加速熱穩(wěn)定性試驗 分別于第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天對保存于不同條件下的參考品進行計數(shù)，結(jié)果見圖1。

參考品在37 ℃保存7 d后，計數(shù)值降到協(xié)作標定的定值范圍之外；在25 ℃保存14 d后，計數(shù)值降到協(xié)作標定的定值范圍之外；在2～8 ℃保存參考品35 d后，計數(shù)值降到協(xié)作標定的定值范圍之外；在-20 ℃ 保存42 d后，計數(shù)值仍在協(xié)作標定的定值范圍內(nèi)。加速穩(wěn)定性試驗結(jié)果符合參考品的特性。

2.7 參考品的保存期試驗 分別于協(xié)作標定后第2、4、6、8、10、12、14、16月和18月由3家企業(yè)6名檢驗員按照對參考品進行計數(shù)，在穩(wěn)健統(tǒng)計剔除不滿意數(shù)據(jù)后，對剩余數(shù)據(jù)的平均值和中位值進行了分析，結(jié)果見圖2。

圖1 參考品加速熱穩(wěn)定性試驗Fig.1 Heat stability test of reference substance

圖2 參考品的保存期探索Fig.2 Retention period of reference substance

結(jié)果可見，每組數(shù)據(jù)的平均值和中位值均落在參考品的定值范圍內(nèi)，說明參考品保存在-70 ℃其活菌值可在18月內(nèi)保持穩(wěn)定。

于第3、6、9、12、15月和18月對參考品的剩余水分含量、真空度進行測定；于第6、12月和18月對參考品性狀、純粹性進行測定。結(jié)果提示，參考品性狀、純粹性、剩余水分含量在-70 ℃保存條件下，在18個月內(nèi)穩(wěn)定；真空度在3個月后，出現(xiàn)部分失真空的現(xiàn)象。

2.8 參考品的初步應(yīng)用 在檢驗工作中，對參考品進行了初步應(yīng)用。同一名檢驗員在5個批次的檢驗中均用到了參考品。結(jié)果見表1。

4次檢驗結(jié)果為參考品以及待檢疫苗檢驗結(jié)果均合格。值得注意的是，在第5批次疫苗檢驗時，出現(xiàn)參考品不在賦值范圍內(nèi)，但待檢疫苗合格的情況。出現(xiàn)這種情況，應(yīng)該直接重檢還是判定合格，還值得討論。

表1 參考品的初步應(yīng)用Table 1 Initial application of reference substance

3 討論

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2018年5月19日正式啟動實施獸用抗菌藥使用減量化行動。獸用細菌類疫苗將逐漸取代抗生素，成為細菌類疫病防控的主力。細菌類疫苗的質(zhì)量控制，是保證其發(fā)揮有效防控效果的關(guān)鍵。

在細菌類活疫苗的檢驗工作中，活菌計數(shù)是最基本的一個檢驗參數(shù)，通過對菌數(shù)進行測定，不僅能夠評價疫苗的免疫效力，還可以在效力檢驗免疫攻毒法中確定強毒攻毒的劑量。保障活菌計數(shù)結(jié)果的有效性和準確性，是細菌類生物制品檢驗工作的一個重點。為排除培養(yǎng)基和人員操作給活菌計數(shù)結(jié)果帶來的不確定性，使用活菌計數(shù)參考品，可以對檢驗過程進行監(jiān)督，使檢驗結(jié)果更為準確[10]。

根據(jù)《中國獸藥典》三部通則“獸用生物制品國家標準物質(zhì)制備和標定規(guī)定”、《中華人民共和國藥典》三部通則“生物制品國家標準物質(zhì)制備和標定規(guī)程”[11]以及《國家藥品標準物質(zhì)協(xié)作標定的技術(shù)要求與管理程序》[12]中對生物制品國家標準物質(zhì)制備及標定的要求，本試驗對豬丹毒活疫苗活菌計數(shù)參考品進行了制備和標定。參考品的性狀、純粹性、活菌計數(shù)、剩余水分含量、真空度均符合《中國獸藥典》中豬丹毒活疫苗質(zhì)量標準。由2名檢驗員對其均一性進行檢測，變異系數(shù)分別為7%和6%。通過協(xié)作標定，對參考品定值為每頭份含活菌數(shù)為8.5×108～12.5×108CFU。參考品在夏季和冬季由泡沫盒加冰袋的方式進行運輸不超過48 h，數(shù)值穩(wěn)定；其性狀、純粹性、剩余水分含量、參考品菌數(shù)均可在18個月內(nèi)可保持穩(wěn)定。目前本實驗室仍在對本批次參考品的保存期進行監(jiān)測，以期待可以延長其保存期。

由于本批參考品使用青瓶壓橡膠塞及卡鉑帽包裝，保存于-70 ℃時，出現(xiàn)了包裝口不再密閉而導(dǎo)致的失真空現(xiàn)象。然而由于保存條件穩(wěn)定，失真空并未對剩余水分含量及菌數(shù)造成影響。為了確保參考品的真空度，在以后參考品的生產(chǎn)過程中可以考慮用安瓿分裝。在對參考品進行試應(yīng)用時曾出現(xiàn)參考品計數(shù)結(jié)果不合格，但是待檢疫苗計數(shù)合格的現(xiàn)象?！睹绹F醫(yī)生物制品法規(guī)和技術(shù)標準》內(nèi)補充檢驗方法一章中規(guī)定，如果出現(xiàn)這種情況本次檢驗判定為無檢驗結(jié)果，采取企業(yè)內(nèi)部質(zhì)檢過程中的檢驗數(shù)據(jù)作為計數(shù)最終結(jié)果[10]?？紤]到中國國情，這類判定方法在中國不適用，因此針對本參考品，如果出現(xiàn)這種情況，考慮判定為本次檢驗無效，應(yīng)進行重檢。