黨如意，畢友坤,王 斌，葉 超，張 娜，楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

2018年5月份西北部甘肅省某肉牛場(chǎng)發(fā)生疫情，短時(shí)間內(nèi)有20余頭牛發(fā)病，其中有11頭發(fā)生猝死。病發(fā)前1個(gè)多月，該肉牛場(chǎng)先后從甲、乙兩地購(gòu)回2批共20余頭7～10月齡的小牛，2批牛間隔半月時(shí)間。2018年5月初，先是從乙地購(gòu)回的牛發(fā)病，后波及甲地牛和本場(chǎng)牛，前后不到1個(gè)月時(shí)間，牛陸續(xù)發(fā)病達(dá)27頭，死亡11頭，病死率達(dá)40%以上。結(jié)合臨床癥狀和剖檢結(jié)果，懷疑為牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染，為確診疫情，結(jié)合臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室診斷等，最終確診為牛病毒性腹瀉/黏膜病繼發(fā)產(chǎn)氣莢膜梭菌感染。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)樣品和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無菌采集該養(yǎng)殖場(chǎng)病死牛的心臟、脾臟、肺臟、腸組織以及腸道黏膜刮取物各2份(編號(hào)分別為1和2)，其中1份用于總RNA提取，-80 ℃保存；1份用于細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定；昆白系小鼠,購(gòu)自中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)；W0841 BVDV陽(yáng)性毒株,購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 主要試劑 TRIzol試劑，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa公司)；RT-PCR反轉(zhuǎn)試劑盒以及PCR Mix，購(gòu)自GenStar康潤(rùn)生物公司；藥敏紙片，購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物 利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)BVDV鑒定引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為218 bp，設(shè)計(jì)好的引物由西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司合成。

1.4 方法

1.4.1 牛病毒性腹瀉病毒PCR檢測(cè) 用無菌的剪刀和鑷子分別采取送檢材料肺臟和腸道黏膜刮取物各2.0 g于組織研磨器中，充分研磨后，加入10 mL PBS混勻，以3 000 r/min離心5 min后，取1.0 mL上清液于1.5 mL無菌管中，2份樣品分別編號(hào)為1和2，備用。TRIzol法提取病毒總RNA，使用GenStar反轉(zhuǎn)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4.2 細(xì)菌學(xué)診斷 無菌操作取病死牛心、肝、肺及腸等病料，分別接種血平板，37 ℃進(jìn)行有氧和厭氧培養(yǎng) 24 h。離心管收集病牛腸及內(nèi)容物，于80 ℃水 浴10 min，離心，取上清液接入肉肝湯中，37 ℃ 厭氧培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色。取肉肝湯培養(yǎng)物繼續(xù)接種血平板，厭氧培養(yǎng)36 h。

1.4.3 動(dòng)物接種試驗(yàn) 取100 μL上述培養(yǎng)物腹腔注射3只昆白系小鼠，以生理鹽水作為對(duì)照。觀察小鼠狀態(tài)，如有死亡對(duì)其進(jìn)行剖檢。

1.4.4 藥物敏感性試驗(yàn) 采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法對(duì)分離菌進(jìn)行18種抗生素的藥敏試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷 病牛體溫升高，精神沉郁，口鼻、唇齒等黏膜充血、出血、潰瘍，流涎，出現(xiàn)腹瀉，糞便呈水樣、惡臭。重癥牛結(jié)膜發(fā)紺，瀕死期很短，僅3～5 min，蹬腿掙扎。

2.2 PCR檢測(cè) PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1，片段大小為218 bp，測(cè)序結(jié)果序列和NCBI中登錄的BVDV序列比對(duì)，二者同源性為100%。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果M：DL-2 000 DNA Marker;1：陽(yáng)性對(duì)照;2：陰性對(duì)照;3、4：病料樣品

2.3 細(xì)菌學(xué)診斷 厭氧培養(yǎng)18 h后，肉肝湯呈現(xiàn)渾濁狀，有氣泡。培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色發(fā)現(xiàn)散在或成對(duì)的革蘭陽(yáng)性大桿菌。培養(yǎng)物接種血平板，厭氧培養(yǎng)36 h，血平板上長(zhǎng)出1～3 mm大小、表面光滑并呈半透明狀的圓屋頂樣菌落，周圍有溶血環(huán)。25 ℃放置1 h左右，溶血環(huán)外圍的紅細(xì)胞變?yōu)闇\綠色。革蘭染色鏡檢為散在或成對(duì)的革蘭陽(yáng)性大桿菌，兩端略微鈍圓，基本無鏈狀排列。將其純化接到牛乳中厭氧培養(yǎng)6 h后，牛乳爆裂。取血平板上的菌落進(jìn)行α毒素檢測(cè)，利用16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，確定為產(chǎn)氣莢膜梭菌。

2.4 小鼠接種試驗(yàn) 腹腔接種 4 h后小鼠死亡。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)心、肺病變不明顯，肝臟充血、色暗紅、易碎，脾臟充血，腎臟充血、質(zhì)地軟，胃壁變薄、內(nèi)有氣體，腸充氣、壁薄有出血，十二指腸變紅色。將小鼠肝、腸、脾、腎進(jìn)行染色鏡檢，均可見散在或成對(duì)的革蘭陽(yáng)性大桿菌，兩端略微鈍圓。

2.5 藥敏試驗(yàn) 按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表1。

表1 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

牛病毒性腹瀉/黏膜病(BVD-MD)，是由牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)引起牛、羊和豬等動(dòng)物的一種接觸傳染性疾病[1]。BVD-MD發(fā)生后，牛抵抗力下降，腸道菌群紊亂，極易誘發(fā)外源或條件性致病原感染，加劇病情和死亡。產(chǎn)氣莢膜梭菌，屬典型的條件致病菌，革蘭染色陽(yáng)性，菌體兩端鈍圓，能形成芽孢[2]。當(dāng)牛從污染的環(huán)境中攝取其菌體或芽孢，或由其他因素導(dǎo)致牛的胃腸道內(nèi)環(huán)境破壞、腸道菌群失調(diào)、免疫力下降時(shí)，菌體便可侵襲繁殖并產(chǎn)生大量毒素，使牛發(fā)病。

鑒于牛病毒性腹瀉繼發(fā)產(chǎn)氣莢膜梭菌在牛場(chǎng)的發(fā)病率和致死率都很高，對(duì)該病的防治提出建議，為類似病例診斷和治療提供參考。首先對(duì)有臨床表現(xiàn)的牛進(jìn)行隔離，以對(duì)癥治療、解毒保肝為原則，結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)發(fā)病牛給以抗病毒及抗梭菌類藥物，如病毒唑、黃芪多糖、環(huán)丙沙星或慶大霉素，輔以中成藥解毒劑、肝泰樂等。病情嚴(yán)重者，配合葡萄糖溶液靜脈注射，并適量給予碳酸氫鈉、維生素C和維生素K3等[3-4]。徹底清理廄舍內(nèi)所有病牛排泄物以及被污染的墊料、食槽、用具等，并進(jìn)行消毒，圈舍外及舍內(nèi)過道全部撒以生石灰或漂白粉。暫停青貯飼料喂牛，對(duì)隔離牛給以優(yōu)質(zhì)青粗飼料。選用質(zhì)量可靠的牛病毒性腹瀉/黏膜病滅活苗、弱毒苗[5]，以減少發(fā)病造成的損失。

發(fā)病牛場(chǎng)采取上述處理措施后，再未出現(xiàn)新的病例。而且被隔離的病牛經(jīng)治療全部恢復(fù)。牛病毒性腹瀉/黏膜病在該省牛群中普遍存在，隱性感染情況嚴(yán)重[6]。該牛場(chǎng)此次發(fā)病，源于其外購(gòu)?；貓?chǎng)前未做檢疫，并直接與本場(chǎng)其他牛進(jìn)行混群飼養(yǎng)，從而導(dǎo)致病毒性腹瀉/黏膜病的發(fā)生和傳播。發(fā)病牛因消化道受損，導(dǎo)致消化機(jī)能紊亂、腸道微生物菌群平衡失調(diào)、免疫力和抵抗力下降，產(chǎn)氣莢膜梭菌伺機(jī)感染并產(chǎn)生毒素，兩病合力，加之處置不及時(shí)，從而造成部分牛死亡的嚴(yán)重?fù)p失。此事件進(jìn)一步提醒廣大養(yǎng)殖者，引種或者外購(gòu)動(dòng)物，必須加強(qiáng)隔離檢疫，防止牛源生物制品的BVDV污染[7]，以免造成不必要的損失。以養(yǎng)牛業(yè)為主的地區(qū)，可根據(jù)養(yǎng)殖情況、牛病毒性腹瀉/黏膜病血清抗體監(jiān)測(cè)情況等，制定切實(shí)可行的控制或根除計(jì)劃，以達(dá)到本病的地區(qū)凈化。