林佳旭，王介淞，楊雅明，黃 娟，單 虎

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109)

犬瘟熱 (Canine distemper，CD) 是一種可導(dǎo)致多種動物共患的高度接觸性傳染病，在自然條件下，最為易感的動物以犬科、鼬科、貓科等肉食獸為主，感染后的死亡率極高。其病原犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae) 麻疹病毒屬(Morbillivirus)[1]，為有囊膜的單股負(fù)鏈 RNA 病毒，主要編碼有 6 個結(jié)構(gòu)蛋白，其中，基質(zhì)蛋白(Matrix protein,M)是最小的結(jié)構(gòu)蛋白，約為 37 kD，具有高度保守性[2]，在病毒的感染中起到極其重要的作用[3]。

免疫接種是目前防制犬瘟熱的主要手段，滅活苗對CDV強毒攻擊不能提供完全的保護(hù)，因此，弱毒活疫苗被廣泛應(yīng)用于犬和經(jīng)濟(jì)動物犬瘟熱的防制。商品化犬瘟熱弱毒疫苗的疫苗毒株多是通過將分離的強毒株經(jīng)異種動物(雪貂等)、雞胚或細(xì)胞連續(xù)傳代以致弱，如CDV/R-20/8株、Onderstepoort株等，但是這種致弱方法獲得的弱毒株存在毒力返強的風(fēng)險，而且疫苗株對野生動物有不同程度的致病性[4]；少數(shù)商品化犬瘟熱弱毒疫苗的疫苗毒株是從自然界分離篩選獲得的自然弱毒株，如用于狐貍的CDV-11株，是從體溫一過性升高的犬分離獲得，對犬、貉、水貂、狐貍均安全[5]，但該疫苗株在動物體內(nèi)可自主復(fù)制，在免疫接種時存在散毒風(fēng)險，對野生動物的安全性也未知。與傳統(tǒng)致弱方式相比，以反向遺傳學(xué)為基礎(chǔ)，利用病毒拯救及點突變毒力相關(guān)位點的方法獲得減毒株，具有病毒致弱方式明確、疫苗更加安全等優(yōu)點[6-8]；將病毒基因組某個復(fù)制必須蛋白基因缺失，獲得病毒復(fù)制缺陷毒株，該毒株只能在提供該蛋白的細(xì)胞上復(fù)制，在其他細(xì)胞或動物體內(nèi)均無復(fù)制性，已經(jīng)在其他負(fù)鏈病毒，如水泡性口炎病毒獲得成功[9]。CDV M蛋白既是復(fù)制必須蛋白，也是毒力相關(guān)蛋白[10-12]，是構(gòu)建CDV復(fù)制缺陷毒株的理想靶蛋白。

本試驗旨在建立一種能穩(wěn)定表達(dá)狐貍源犬瘟熱病毒 M 蛋白的細(xì)胞系，該細(xì)胞系可為后續(xù)CDV復(fù)制缺陷毒株的拯救提供復(fù)制許可細(xì)胞，也可為CDV M 蛋白功能的進(jìn)一步研究提供一種過表達(dá)細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞、犬瘟熱病毒及陽性血清 質(zhì)粒pCI-neo、質(zhì)粒pEGFP-N1、Vero-SLAM 細(xì)胞、狐貍源犬瘟熱病毒分離毒株SD16F、犬源犬瘟熱病毒陽性血清均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器XhoI 和NotI 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶和ExTaq酶等，均購自 TaKaRa 公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒、DMEM 培養(yǎng)基、G418 硫酸鹽溶液，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000，購自Invitrogen 公司；兔抗犬 IgG 二抗，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒 pCI-neo-M 的構(gòu)建

1.2.1.1 PCR 擴(kuò)增 根據(jù)本實驗室保存的犬瘟熱流行毒株 SD16F 的核苷酸序列，應(yīng)用Primer 5.0 軟件在保守區(qū)設(shè)計上、下游引物，SD16F-M-F：5′-CCGCTCGAGGCCACCATGACTGAGGTGTACGACTT-CG-3′；SD16F-M-R：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTAGAGAATTTTGAAAAGACCCTG-3′，序列中有下劃線的部分為XhoI 和NotI 酶切位點，有黑色加粗下劃線的部分為 Kozak 序列，以犬瘟熱流行毒株 SD16F 為模板，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為:dNTP 2 μL、M上游引物 1 μL、M下游引物 1 μL、cDNA 2 μL、ExTaq酶 0.5 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、ddH2O 16 μL。擴(kuò)增程序為:94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共 30個循環(huán)；72 ℃終延伸 10 min。

1.2.1.2 載體的構(gòu)建與鑒定 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 1% 瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)膠回收后，膠回收產(chǎn)物與 pCI-neo 載體同時經(jīng)XhoI 和NotI 限制性內(nèi)切酶雙酶切，T4連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個菌落搖菌培養(yǎng)后，進(jìn)行菌液 PCR 鑒定，鑒定為陽性的菌液提取重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒，經(jīng)測序驗證序列正確。陽性重組菌大量培養(yǎng)后經(jīng)無內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒使其達(dá)到可轉(zhuǎn)染細(xì)胞用標(biāo)準(zhǔn)，檢測質(zhì)粒濃度后，標(biāo)記放置于-80 ℃ 冰箱待用。

1.2.2 細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染及M基因表達(dá)鑒定

1.2.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1天，取生長狀態(tài)良好，細(xì)胞密度適宜的 Vero-SLAM 細(xì)胞鋪 96 孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到 85% 左右，將 pCI-neo-M 重組質(zhì)粒用無血清 opti-MEM 培養(yǎng)液做適當(dāng)稀釋后，參照轉(zhuǎn)染試劑 Lipo2000 說明書，以0.2 μg/孔劑量轉(zhuǎn)染至 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并設(shè)置 pEGFP-N1 對照孔、pCI-neo 空質(zhì)粒對照孔、脂質(zhì)體對照孔和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對照孔。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2.2 RT-PCR 鑒定 轉(zhuǎn)染細(xì)胞 48 h 后，在倒置顯微鏡下觀察空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞無異常，在倒置熒光顯微鏡下觀察 pEGFP-N1 對照孔有綠色熒光，表明轉(zhuǎn)染試驗成功。提取 pCI-neo-M 轉(zhuǎn)染孔、細(xì)胞對照組孔細(xì)胞總 RNA，經(jīng)DpnI 酶處理后進(jìn)行 RT-PCR 試驗檢測目的蛋白的轉(zhuǎn)錄。

1.2.2.3 間接免疫熒光鑒定 以犬瘟熱病毒陽性血清為一抗、兔抗狗 IgG 為二抗對 pCI-neo-M 轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對照組進(jìn)行 IFA 試驗驗證 M 蛋白的表達(dá)情況。

1.2.3 Vero-SLAM-M 細(xì)胞系的構(gòu)建

1.2.3.1 細(xì)胞 G418 篩選濃度的確定 取傳代后生長狀態(tài)良好、細(xì)胞密度適宜的 Vero-SLAM 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，使用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，鋪滿 24 孔板，細(xì)胞數(shù)為 2×104個/孔，培養(yǎng)過夜后吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2次，每孔加入含有不同濃度梯度 G418 的 DMEM 篩選培養(yǎng)基(濃度依次為 0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 μg/mL和1 100 μg/mL)，每個梯度設(shè) 2 個重復(fù)孔。每 3 d 更換1次篩選培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng) 10～14 d，每天觀察記錄細(xì)胞的死亡情況，以第 10 天細(xì)胞全部死亡的最低 G418 濃度為 Vero-SLAM 的最適篩選濃度。

1.2.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及克隆篩選 按“1.2.2.1”步驟以 2 μg/孔的劑量將 pCI-neo-M 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至 6 孔板 Vero-SLAM 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后的 Vero-SLAM 細(xì)胞培養(yǎng) 3 d 后更換含最適 G418 篩選濃度的 DMEM 篩選培養(yǎng)基，每 3 d 換新的篩選培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng) 12 d。每天觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，待對照孔細(xì)胞達(dá)到 90% 以上死亡時，用胰酶消化存活的 Vero-SLAM 細(xì)胞，適當(dāng)稀釋后傳入 25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。如此連續(xù)克隆陽性細(xì)胞 3 次，篩選2～3株 可穩(wěn)定表達(dá)M的 Vero-SLAM 細(xì)胞 G418 抗性克隆株。將陽性細(xì)胞克隆株更換為一半最適 G418 篩選濃度的 DMEM 培養(yǎng)基連續(xù)傳代 10 次以上，按常規(guī)方法凍存、復(fù)蘇，觀察該抗性克隆株傳代的穩(wěn)定性。

1.2.3.3 M 基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平的檢測 選取 1 株 Vero-SLAM-M 細(xì)胞克隆株的第 F5、F10 代細(xì)胞提取總RNA，按照“1.2.2.2”方法對克隆株進(jìn)行 mRNA 水平檢測；以犬瘟熱病毒陽性血清為一抗、兔抗犬 IgG 為二抗對 Vero-SLAM-M 細(xì)胞克隆株F10代按“1.2.2.3”方法進(jìn)行 IFA 試驗驗證 M 蛋白的表達(dá)情況，同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCI-neo-M 的 Vero-SLAM 細(xì)胞作為陰性對照組。

1.2.3.4 細(xì)胞生長曲線測定 取傳代后生長狀態(tài)良好、密度適宜的 Vero-SLAM-M 細(xì)胞系經(jīng)胰酶消化后，使用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，鋪24孔板，細(xì)胞數(shù)為 2×104個/孔，共18孔。連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至 6 d，每培養(yǎng)24 h取3孔細(xì)胞計數(shù)取平均值。同時設(shè)其親本 Vero-SLAM 細(xì)胞對照，根據(jù)計數(shù)結(jié)果繪制細(xì)胞一步生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 pCI-neo-M 表達(dá)載體構(gòu)建 以狐貍源犬瘟熱流行毒株 SD16F 為模板，按方法“1.2.1.1”PCR 擴(kuò)增獲得與預(yù)期大小(1 008 bp)相符目的片段(圖1)。該片段克隆至 pCI-neo 質(zhì)粒，經(jīng)XhoI 和NotI 限制性內(nèi)切酶雙酶切后，獲得大小約為 1 008 bp和5 427 bp的2個條帶(圖2)，測序結(jié)果表明，真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，并命名為pCI-neo-M。

2.2M基因的瞬時表達(dá) pCI-neo-M 重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Vero-SLAM細(xì)胞后，提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR擴(kuò)增獲得與預(yù)期大小(1 008 bp)相符目的片段(圖3)。經(jīng) IFA 試驗驗證，pCI-neo-M轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察有特異性綠色熒光(封三彩版圖4)，表明pCI-neo-M質(zhì)粒能在Vero-SLAM細(xì)胞中表達(dá)M蛋白。

圖1 M 基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of M geneM：DL-2 000 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～2：M 基因的PCR 產(chǎn)物；3：陰性對照M:DL-2 000 DNA Marker;1～2:PCR product of M gene;3:Negative control

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Digestion results of recombinant plasmidM1：DL-10 000 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；M2：DL-5 000 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：重組質(zhì)粒用 Xho I/ Not I 酶雙酶切；2：重組質(zhì)粒用 Xho I 酶單酶切M1:DL-10 000 DNA molecular weight standard;M2:DL-5 000 DNA molecular weight standard;1:Recombinant plasmid digested by Xho I/ Not I；2:Recombinant plasmid digested by Xho I

圖3 RT-PCR鑒定M 基因的轉(zhuǎn)錄Fig.3 Expression of M gene identified by RT-PCRM：DL-2 000 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的Vero-SLAM細(xì)胞；2：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的Vero-SLAM細(xì)胞M:DL-2 000 DNA Marker;1:Vero-SLAM cells transfected with pCI-neo;2:Vero-SLAM cells transfected with pCI-neo-M

2.3 G418 最適濃度測定結(jié)果 Vero-SLAM 細(xì)胞加入不同梯段濃度G418培養(yǎng)液后，從第2天起500 μg/mL及以上濃度篩選組均有少量細(xì)胞死亡。篩選至10 d，300 μg/mL組達(dá)到40%細(xì)胞死亡，700 μg/ mL組達(dá)到90%細(xì)胞死亡，超過900 μg/mL各組細(xì)胞均已全部死亡(封三彩版圖5)，確定Vero-SLAM 細(xì)胞對G418最適篩選濃度為 900 μg/mL。

2.4 Vero-SLAM-M 細(xì)胞系的構(gòu)建 對G418篩選細(xì)胞克隆株的F5、F10代進(jìn)行M基因 mRNA 的 RT-PCR 檢測，結(jié)果顯示均擴(kuò)增得到1 008 bp特異性陽性條帶(圖6)，證明 F5、F10 代均有M基因的轉(zhuǎn)錄。以犬瘟熱病毒陽性血清為一抗、兔抗犬IgG為二抗的間接免疫熒光試驗證明M基因在細(xì)胞克隆株的F10 代仍有蛋白水平的表達(dá)(封三彩版圖7)。將該穩(wěn)定表達(dá)M蛋白的細(xì)胞株命名為 Vero-SLAM-M 細(xì)胞。

圖6 pCI-neo-M穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的RT-PCR鑒定Fig.6 Identification of pCI-neo-M in stably transfected cells by RT-PCRM：DL-2 000 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：pCI-neo-M穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Vero-SLAM細(xì)胞(F5 代)；2：pCI-neo-M穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Vero-SLAM細(xì)胞(F10 代)M:DL-2 000 DNA Marker;1:The F5 passage of Vero-SLAM cells transfected stably with pCI-neo-M;2:The F10 passage of Vero-SLAM cells transfected stably with pCI-neo-M

2.5 Vero-SLAM-M 細(xì)胞系生長曲線 Vero-SLAM-M 細(xì)胞系連續(xù)傳代 10 代以上，經(jīng)過凍存、復(fù)蘇后，該細(xì)胞系的生長周期、細(xì)胞傳代后的狀態(tài)依然較為穩(wěn)定。通過細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞生長曲線發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞系與其親本 Vero-SLAM 細(xì)胞生長特性基本保持一致(圖8)。

3 討論

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)和 G418 藥物篩選技術(shù)，成功構(gòu)建出了可穩(wěn)定表達(dá)犬瘟熱病毒M基因的 Vero-SLAM-M細(xì)胞系。為了有效的提高M(jìn)基因的表達(dá)水平，本試驗在M基因上游引入了能增強蛋白翻譯功能的Kozak序列[13]。本試驗選用的載體pCI-neo，為新霉素篩選標(biāo)記，是不帶EGFP熒光蛋白的載體，因此無法借助其表達(dá)的強綠色熒光來輔助細(xì)胞克隆的挑選純化。但表達(dá)載體與Vero-SLAM細(xì)胞基因組完成隨機重組后 EGFP 蛋白表達(dá)是無法直接反映出M基因表達(dá)量的，因此仍需借助IFA試驗來完成M基因蛋白表達(dá)量的鑒定[14]。因本實驗室尚未獲得針對M蛋白的特異性單克隆或多克隆抗體，本試驗采用犬源犬瘟熱病毒陽性血清作為一抗，兔抗犬 IgG 作為二抗，通過間接免疫熒光試驗驗證了M蛋白的瞬時表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)。

圖8 Vero-SLAM-M 細(xì)胞系和 Vero-SLAM 細(xì)胞系一步生長曲線Fig.8 Growth curve of the Vero-SLAM-M cells and Vero-SLAM cells

本試驗收集了 Vero-SLAM-M 細(xì)胞系 F5、F10代及其親本Vero-SLAM 細(xì)胞，分別提取細(xì)胞總 RNA 后進(jìn)行 RT-PCR 試驗，試驗結(jié)果證明，M基因在該 Vero-SLAM-M 細(xì)胞克隆株的 F5、F10 代次中均有轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。以犬瘟熱病毒陽性血清為一抗、兔抗犬 IgG 為二抗的間接免疫熒光試驗證明，M基因在該 Vero-SLAM-M細(xì)胞克隆株的 F10 代仍有蛋白水平的表達(dá)。繪制 Vero-SLAM-M 細(xì)胞系與其親本 Vero-SLAM 細(xì)胞系生長曲線測定結(jié)果顯示，2種細(xì)胞系在生長特性及生長周期等方面基本保持一致，Vero-SLAM-M 細(xì)胞系培養(yǎng)到第4天時進(jìn)入對數(shù)生長期，5 d 時進(jìn)入細(xì)胞生長平臺期。在培養(yǎng)的1～5 d 中帶M基因重組質(zhì)粒的細(xì)胞系生長情況與親本細(xì)胞差異并不大，但在第5天當(dāng)其達(dá)到細(xì)胞數(shù)量的頂峰后，帶有重組質(zhì)粒的細(xì)胞系凋亡速度明顯慢于普通親本細(xì)胞，且細(xì)胞數(shù)量的頂峰值要高于親本細(xì)胞，推測產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因可能是 G418 的壓力作用導(dǎo)致 Vero-SLAM-M 細(xì)胞生長密度增加，且細(xì)胞更為耐受。

雖然國內(nèi)外研究人員陸續(xù)研制出不同類型的犬瘟熱疫苗[15]，但目前仍多依賴于弱毒疫苗對犬瘟熱進(jìn)行預(yù)防，但弱毒苗在使用過程中存在著一定的缺陷，例如毒力返祖、極易引起一過性免疫抑制、首免易受母源抗體干擾等情況[16]，還會促進(jìn)CDV野毒的基因進(jìn)化[17]。因此，近些年更多的研究人員致力于尋求更為安全有效的新型疫苗。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù)的深入發(fā)展與廣泛應(yīng)用，犬瘟熱病毒新型疫苗得到廣泛的研制與發(fā)展，如基因工程亞單位疫苗及重組活載體疫苗等[18-19]，新型疫苗的開發(fā)極大的克服了常規(guī)疫苗的不足。本試驗建立的細(xì)胞系為后續(xù)犬瘟熱病毒致病機制的研究帶來了極大的方便，也為犬瘟熱病毒 M 蛋白的功能測定及新型犬瘟熱基因工程疫苗的研制創(chuàng)造了便利條件。