李 真 沈 璟

［對(duì)外經(jīng)濟(jì)貿(mào)易大學(xué)附屬中學(xué)（北京市第九十四中學(xué)） 北京 100102］

原生質(zhì)體融合是植物體細(xì)胞雜交的第1 步，屬于人教版教材高中生物學(xué)選修3《細(xì)胞工程》中的重要內(nèi)容?！镀胀ǜ咧猩飳W(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)（2017年版）》［1］在概念4“動(dòng)物細(xì)胞工程”的大概念下，要求學(xué)生“概述植物體細(xì)胞雜交是將不同植物體細(xì)胞在一定條件下融合成雜合細(xì)胞”，通過(guò)該部分的學(xué)習(xí)能針對(duì)生產(chǎn)或生活的某一需求，在細(xì)胞工程中選用恰當(dāng)?shù)募夹g(shù)和方法提出初步的設(shè)想。而教材中未開(kāi)展這一部分的實(shí)驗(yàn)，造成學(xué)生僅掌握基本知識(shí)，未形成直觀的認(rèn)識(shí)，為了使學(xué)生深入理解教材內(nèi)容和相關(guān)知識(shí)點(diǎn)，并對(duì)植物原生質(zhì)體制備和融合的過(guò)程有感性認(rèn)識(shí)，筆者在課下帶領(lǐng)興趣小組進(jìn)行了前期實(shí)驗(yàn)摸索和改進(jìn)，課上通過(guò)改進(jìn)后的流程，使學(xué)生成功觀察到原生質(zhì)體的融合過(guò)程。

1 實(shí)驗(yàn)材料、酶解時(shí)間和PEG 濃度的設(shè)定

教材中提到番茄和土豆原生質(zhì)體融合，本實(shí)驗(yàn)希望用生活中常見(jiàn)的蔬菜和開(kāi)花植物進(jìn)行探究。在設(shè)計(jì)前學(xué)生通過(guò)查閱文獻(xiàn)找到酶解液的配方，選擇PEG 誘導(dǎo)融合，選擇何種實(shí)驗(yàn)材料、該酶解液配方是否適用于所選材料的酶解、酶解時(shí)間如何掌握，針對(duì)這些問(wèn)題需進(jìn)行初步探究，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方案詳見(jiàn)表1。

表1 設(shè)計(jì)角度與實(shí)驗(yàn)方案

2 實(shí)驗(yàn)步驟［2］

1）配制酶解液（10 mL）：稱(chēng)取甘露醇0.72 g，纖維素酶0.1 g，離析酶0.01 g，果膠酶0.01 g，100 mmol／L 2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES）500 μL，55℃加熱10 min，冷卻至室溫加入牛血清蛋白（BSA）0.015 g，100 mmol／L CaCl2800 μL，加水定容至10 mL。

2)配制0.4 mol／L 甘露醇和0.16 mol／L 的CaCl2溶液（pH＝5.8～6.2）和PEG 溶液［20%～40%（w／v）PEG6000，CaCl20.01 mol／L，KH2PO40.00074 mol／L，山梨醇0.1 mol／L］備用。

3）在玻璃平皿上滴加1 mL 左右0.4 mol／L甘露醇溶液，取洗凈晾干的新鮮材料，用解剖刀切成細(xì)絲狀，盡量保證刀口平齊。

4）用尖頭鑷子夾取細(xì)絲輕柔緩慢地放入酶解液中，25℃、60 r／min 培養(yǎng)1～6 h。

5）取出酶解后的原生質(zhì)體，置于6 cm 一次性塑料平皿蓋子上過(guò)200 目或100 目篩子。

6）濾液轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，500 轉(zhuǎn)離心1 min，去上清液，加入1 mL 0.16 mol／L CaCl2溶液，重懸浮原生質(zhì)體。

7）將2 種原生質(zhì)體等量混合后，靜置10 min。

8）滴入等量的PEG 液，靜置15 min 后，顯微鏡下觀察并拍照記錄。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 不同酶解時(shí)間的影響 本研究用纖維素酶、果膠酶和離析酶（具有半纖維素酶和果膠酶活性）配制酶解液，以酶解法制備原生質(zhì)體。由于小白菜的葉片光滑、平直、無(wú)毛，且主葉脈明顯，便于操作，所以先嘗試使用小白菜作為實(shí)驗(yàn)材料探究。切取1 g 小白菜細(xì)絲放入10 mL 酶解液中，震蕩培養(yǎng)酶解1～6 h 后取出，用5 mL CaCl2溶液重懸原生質(zhì)體，隨后使用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)完整的原生質(zhì)體數(shù)量，3 次生物學(xué)重復(fù)分別計(jì)數(shù)后求平均值。結(jié)果如圖1所示，原生質(zhì)體的數(shù)量呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，酶解1～3 h 后視野下可見(jiàn)的原生質(zhì)體數(shù)量較少，4 h 后視野下可見(jiàn)完整的原生質(zhì)體數(shù)量大幅增加，多達(dá)2.2×105個(gè)／mL，且大部分原生質(zhì)體完整性較好呈圓球形，4 h 后隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，視野下可見(jiàn)的完整原生質(zhì)體數(shù)量逐漸減少，6 h 時(shí)大部分原生質(zhì)體已破損，呈圓球狀完整原生質(zhì)體的數(shù)量大幅降低，可能是由于酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)原生質(zhì)體造成一定程度的破壞。

圖1 不同酶解時(shí)間原生質(zhì)體數(shù)量統(tǒng)計(jì)

3.2 不同材料的影響 為了獲得更多的原生質(zhì)體同時(shí)便于觀察融合程度，本研究中共選擇具有3種顏色的8 種實(shí)驗(yàn)材料，基于小白菜酶解時(shí)間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別用250 mL 錐形瓶震蕩培養(yǎng)4 h 后顯微鏡下觀察（圖2）。鈣菜、快菜、生菜、小白菜、油菜、油麥菜原生質(zhì)體完整性都較好；從數(shù)量看，400 倍視野下生菜、小白菜的制備效果顯著優(yōu)于其他材料；從顏色看，小白菜和鈣菜的綠色較其他4 種材料略深，這可能與植物的葉片厚度、葉片的形態(tài)、細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有關(guān)。除此之外，視野下可見(jiàn)棣棠花（圖2G）和紫甘藍(lán)（圖2H）在酶解4 h 后原生質(zhì)體均完整性好、數(shù)量滿(mǎn)足融合需要。

圖2 不同材料酶解4 h 后的原生質(zhì)體

3.3 不同PEG 濃度的影響 在原生質(zhì)體融合時(shí)，使用不同濃度的PEG 融合效果和處理時(shí)間存在較大差異，本實(shí)驗(yàn)中使用小白菜和紫甘藍(lán)酶解4 h 后加入不同濃度PEG 誘導(dǎo)15 min。結(jié)果顯示（圖3），20% PEG 誘導(dǎo)15 min，大部分原生質(zhì)體僅是距離靠近但并未融合，使用30% PEG 誘導(dǎo)開(kāi)始觀察到原生質(zhì)體的融合，而40% PEG 造成多個(gè)原生質(zhì)體的多聚融合，不利于結(jié)果的觀察。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體融合的程度逐漸增加。

圖3 不同PEG 濃度下原生質(zhì)體的融合情況

4 結(jié)論

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，不同酶解時(shí)間、不同實(shí)驗(yàn)材料、不同PEG 濃度都會(huì)影響原生質(zhì)體的制備和融合效果。酶解時(shí)間4 h 時(shí)原生質(zhì)體數(shù)量最多、完整性最好；實(shí)驗(yàn)材料選擇紫甘藍(lán)、棣棠和小白菜，前二者具有獨(dú)特的顏色便于觀察融合情況，而根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果制備綠色的原生質(zhì)體選擇生菜或小白菜效果較好，但是由于生菜獨(dú)特的羽狀葉，在切取過(guò)程中難度大、耗時(shí)長(zhǎng)，最終選擇小白菜制備綠色的原生質(zhì)體；使用濃度為20%和30%的PEG 都可誘導(dǎo)原生質(zhì)體的融合，但是低濃度需要的誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)，高濃度能適當(dāng)縮短誘導(dǎo)時(shí)間。為了提供更多的可選材料，讓學(xué)生在短時(shí)間觀察到多種明顯的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)保證充足的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備時(shí)間，最終選用小白菜（綠色）、棣棠花（黃色）、紫甘藍(lán)（紫色），酶解4 h 后使用30% PEG 誘導(dǎo)原生質(zhì)體的融合。

利用顯微鏡進(jìn)行觀察，學(xué)生可直觀地觀察到不同顏色不同材料的原生質(zhì)體融合過(guò)程（圖4），課堂上要求學(xué)生用手機(jī)拍照并標(biāo)注使用材料、放大倍數(shù)等信息上傳到班級(jí)群內(nèi)（圖5）。

圖4 以紫甘藍(lán)和小白菜為例的原生質(zhì)體融合

圖5 學(xué)生拍攝的圖片

5 討論

不同植物酶解時(shí)間有較大差異。例如，珠眉海棠根采用兩步法酶解需要25℃、40 min［3］；秀珍菇需要30℃酶解3 h［4］；穆惠敏等［5］在28℃情況下，酶解100 min 制備紫菜的原生質(zhì)體；杜小云等［6］建立“紅顏”草莓瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，需要31℃酶解10 h。由于不同植物材料的木質(zhì)化程度不同，酶解時(shí)間從幾十分鐘到十幾小時(shí)變化較大。本實(shí)驗(yàn)中用不同時(shí)間酶解小白菜葉片，4 h 時(shí)完整的可后續(xù)使用原生質(zhì)體數(shù)量最多，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體數(shù)量逐漸降低，4 h 后細(xì)胞已充分酶解，而震蕩處理會(huì)造成原生質(zhì)體的損傷，所以酶解時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

珠眉海棠根可采用一步法或兩步法酶解，但是兩步法效果更優(yōu)［3］；齊耀程［7］在制備三生煙葉片與煙花的原生質(zhì)體時(shí)，葉片最佳制備條件為1%纖維素酶、0.5%的離析酶、酶解4 h，而煙花最佳制備條件為0.8%纖維素酶、0.4%的離析酶、酶解2 h，可見(jiàn)不同的實(shí)驗(yàn)材料影響酶解的條件。在本實(shí)驗(yàn)中選用常見(jiàn)菜的葉片為材料，方便獲得，葉片當(dāng)中含有較多的薄壁組織，酶解較其他植物器官容易。

一般所用的PEG 相對(duì)分子質(zhì)量為1 000 ～6 000，PEG 分子量大于1 000 時(shí)，才能誘導(dǎo)原生質(zhì)體達(dá)到緊密的粘連和較為理想的融合效果［8］。廣藿香原生質(zhì)體融合時(shí)，使用40% PEG6000 化學(xué)促融30 min，聚合率可達(dá)57.19%［9］；白色金針菇菌株3W4 和白色金針菇菌株FMY1203 為親本，雙親原生質(zhì)體使用40% PEG 進(jìn)行融合處理［10］；康林芝等［11］使用25%PEG4000 將金針菇與平菇融合。本實(shí)驗(yàn)中使用的是PEG6000，PEG 的濃度較低或處理時(shí)間過(guò)短，會(huì)導(dǎo)致融合效果不理想；濃度過(guò)高或處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)原生質(zhì)體的毒害作用增強(qiáng)，可能造成原生質(zhì)體的活性喪失或減少異核體的融合率。本實(shí)驗(yàn)中40%的PEG6000 處理很可能是由于濃度過(guò)高，造成異核體融合率顯著降低，而同種植物的原生質(zhì)體融合程度大幅增高。

6 小結(jié)

《普通高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)（2017年版）》［1］對(duì)教師的教學(xué)和學(xué)生的能力提出了更高的要求，教師應(yīng)該為學(xué)生的科學(xué)探究和科學(xué)思維能力的培養(yǎng)提供更多的機(jī)會(huì)，生物學(xué)科是實(shí)驗(yàn)學(xué)科，知識(shí)的掌握和運(yùn)用應(yīng)當(dāng)從實(shí)驗(yàn)中來(lái)，到生活中去，真正將看不見(jiàn)摸不到的知識(shí)轉(zhuǎn)變成看得見(jiàn)摸得著的實(shí)驗(yàn)，讓學(xué)生體會(huì)到生物學(xué)科的應(yīng)用和魅力。本節(jié)課是對(duì)選修教材的開(kāi)發(fā)和拓展，通過(guò)筆者的引導(dǎo)，學(xué)生自主開(kāi)展實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，深刻體會(huì)到思考在前行動(dòng)在后的重要性，實(shí)驗(yàn)需要想清楚、設(shè)計(jì)好、再行動(dòng)；同時(shí)在操作過(guò)程中學(xué)生體會(huì)到每一個(gè)環(huán)節(jié)的設(shè)計(jì)都要嚴(yán)謹(jǐn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的獲得需要反復(fù)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)探究是一個(gè)曲折的過(guò)程，需要不斷的調(diào)整、嘗試、重復(fù)。此外本節(jié)課也能很好檢驗(yàn)學(xué)生對(duì)知識(shí)的掌握情況，只有辨別出完整原生質(zhì)體觀察到融合的情況，才能拍照上傳，完成課上任務(wù)。筆者認(rèn)為這是一節(jié)體現(xiàn)生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)、有借鑒價(jià)值的實(shí)驗(yàn)課。