曾慧慧 樊自強(qiáng) 楊 莉 段永霞 葉 帆 楊 柳 余邦良

(海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 海南?？?571199)

眼樹蓮（Dischidia chinensis），別名瓜子金、瓜子藤、滴錫藤、石仙桃、小耳環(huán)、上樹瓜子、樹上瓜子、上樹鱉、翼魚草，為蘿藦科眼樹蓮屬附生藤本植物，生長在低海拔至中海拔的山地林谷或曠地，在中國主要產(chǎn)于海南、廣東和廣西等省區(qū)［1］。眼樹蓮全株入藥，有清肺化痰、涼血解毒之功效，民間用于治療肺燥咳痰、咳血、百日咳、小兒疳積、痢疾、疥瘡毒膿、跌打腫痛、毒蛇咬傷［2］。海南黎族地區(qū)用其全草煮水熏眼，治療眼疾［3］?；酐惸莸龋?］研究了眼樹蓮全株中總酚和總黃酮的體外抗氧化活性。楊柳等［5-6］、洪家立等［7］、張?zhí)旎ǖ龋?］發(fā)現(xiàn)海南產(chǎn)眼樹蓮不同提取物具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性。余邦良等［9］首次從眼樹蓮乙酸乙酯中分離得到10 個單體化合物，大部分為萜類化合物，但是提取率較低。據(jù)文獻(xiàn)［10-12］報道，萜類化合物具有一定抗腫瘤活性，目前未見關(guān)于應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化方法篩選眼樹蓮中三萜類化合物提取工藝的報道。

為了從眼樹蓮中獲取更多量的三萜類化合物，探討一種高效提取方法，前期通過對比索氏提取與超聲提取2種實(shí)驗方法，發(fā)現(xiàn)超聲法提取眼樹蓮中三萜類化合物得率更高，因此選用超聲波提取眼樹蓮中三萜類化合物。通過單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化考察了各因素對提取得率的影響，期望建立一種快捷、簡便、高效的眼樹蓮三萜類化合物提取方法，為深入開發(fā)利用眼樹蓮奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥材和試劑

眼樹蓮藥材于2019 年3 月采自海南省?？谑谢鹕娇诘貐^(qū)，經(jīng)海南大學(xué)劉壽柏副教授鑒定，其為蘿藦科植物眼樹蓮，編號為YSL-201812；齊墩果酸，HPLC≥98.5%（上海源葉生物科技有限公司）；無水乙醇、香草醛、高氯酸、冰乙酸、乙酸乙酯、二甲苯均為分析純（廣東西隴化工試劑有限公司）。

1.1.2 儀器

LC-15C 高效液相色譜儀（日本島津）；722N可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；KQ5200E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ME204E 電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；TG16-WS 臺式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗儀器開發(fā)有限公司）；SSW-600-2S 電熱恒溫水浴箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；DFY-1000D 藥用粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；YRE-210D 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；DHG-9095A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；C-YLS-Q4 型耳片打孔器（北京哲成科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品提取液的制備

采集新鮮的海南本地眼樹蓮，切段，曬干，用粉碎機(jī)粉碎，過40 目篩，獲得3 kg 粉末；稱取3.0 g眼樹蓮粉末，置于錐形瓶中，加入溶劑混勻，以不同的超聲功率、溫度、提取時間、液料比進(jìn)行三萜類化合物的提取；超聲時間到了之后，抽濾得到提取液，超聲3次，合并濾液，備用［8］。

1.2.2 眼樹蓮中三萜類化合物的含量測定

1.2.2.1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考文獻(xiàn)［8，13-14］的方法，精密稱取齊墩果酸10.0 mg，以無水乙醇為溶劑，配制0.4 mg/mL 齊墩果酸溶液。量取0.2 mL 齊墩果酸溶液，于80℃水浴加熱至溶劑揮發(fā)完畢，加入5%香草醛—冰乙酸溶液0.3 mL、高氯酸0.7 mL，搖勻；于70℃水浴加熱15 min，冷卻至室溫，加入4 mL乙酸乙酯搖勻，即為齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；將齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液采用逐級稀釋法分別稀釋為12.0、10.0、8.0、6.0、4.0 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；以560 nm為掃描波長，以系列齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程及相關(guān)系數(shù)。

1.2.2.2 計算三萜類化合物得率

將1.2.1中所得眼樹蓮的三萜類化合物提取液成倍稀釋后，取稀釋后溶液5 mL，用1.2.2.1方法測定其吸光度值，記錄其吸光度值，根據(jù)以下公式，計算眼樹蓮三萜類化合物的得率［14］，用η表示。

式中：η，三萜類化合物得率；m，測得的吸光度在齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線上顯示的齊墩果酸（μg）；c，稀釋倍數(shù)；M，樣品質(zhì)量（g）。

前期實(shí)驗比較了多種溶劑的提取效果，發(fā)現(xiàn)將乙酸乙酯作為溶劑，提取眼樹蓮中三萜類化合物的得率較高，所以選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。

1.2.3 單因素實(shí)驗

以眼樹蓮中三萜類化合物得率為考察指標(biāo)，對超聲功率、提取溫度、提取時間、液料比進(jìn)行單因素實(shí)驗，考察這4個因素對三萜類化合物得率的影響。分別精確稱取3.0 g 眼樹蓮粉末5 份，分成5 個實(shí)驗組，每個實(shí)驗組均根據(jù)1.2.1 方法獲取眼樹蓮中三萜類化合物提取液；每個實(shí)驗組分別取3 份提取液，按照1.2.2 方法平行測定其三萜類化合物的得率，求其平均值［15］。在固定提取溫度均為45℃，超聲浸提時間均為30 min，液料比為30︰1（mL/g）的條件下，分別考察不同超聲功率（100、150、200、250、300 W）對三萜類化合物提取得率的影響；再根據(jù)實(shí)驗確定的功率條件，考察不同提取溫度（40、45、50、55、60℃）對三萜類化合物提取得率的影響；隨后分別考察不同超聲提取時間（20、30、40、50、60 min）、不同液料比 （10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）對三萜類化合物提取得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗設(shè)計

基于單因素實(shí)驗，選用Design Expert 11 軟件，根據(jù)Box-Behnken 模型的實(shí)驗設(shè)計原理，以眼樹蓮中三萜類化合物得率為響應(yīng)值，選擇超聲功率（A）、溫度（B）、時間（C）、液料比（D）4 個因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗，平行測定3次，求眼樹蓮中三萜類化合物平均得率，篩選出最佳提取工藝條件［16］。響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗因素和水平見表1。

表1 眼樹蓮中三萜類化合物響應(yīng)面因素和水平表

1.2.5 實(shí)驗條件對比

分別采用響應(yīng)面優(yōu)化后的實(shí)驗條件（1#）與張?zhí)旎ǖ龋?］優(yōu)化后的實(shí)驗條件（2#）來提取眼樹蓮三萜類化合物，以得率為考察因素進(jìn)行對比。

1.2.6 液相色譜鑒別［17］

1.2.6.1 色譜條件

Kromasil C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶0.2%磷酸水溶液（87∶13）；流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量為20μL。

1.2.6.2 供試品溶液的制備

采用響應(yīng)面優(yōu)化后的實(shí)驗條件（1#）與張?zhí)旎ǖ龋?］優(yōu)化后的實(shí)驗條件（2#），獲得眼樹蓮三萜類化合物，分別將其濃縮成浸膏，并用HPLC 級甲醇將其超聲溶解成2.00 mg/mL 的溶液，取上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，作為供試品溶液A，供試品溶液B。

1.2.6.3 對照品溶液的制備

精密稱取齊墩果酸20 mg 置于10 mL 容量瓶中，并用HPLC 級甲醇將其溶解成2.00 mg/mL 的齊墩果酸溶液，作為對照品溶液。

1.2.7 抗炎活性實(shí)驗

根據(jù)單因素實(shí)驗和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗結(jié)果確定較好的一組提取工藝，用楊柳等［5］的“二甲苯所致小鼠耳腫脹抗炎模型”方法，考察三萜類化合物的抗炎活性。取30 只雄性昆明種小鼠，分3 組，每組各10只；以48 mg/kg給藥劑量，作為藥物組；以1%的羧甲基纖維素水溶液作為空白對照組；以500 mg/kg 阿司匹林給藥劑量，作為陽性藥物組。參照楊柳等［5］的方法，計算三萜類化合物的的耳腫脹抑制率。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2016 作圖， SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Design-Expert 11 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y＝0.022 4x＋0.063 8，R2＝0.999 5。經(jīng)回歸分析可知，在4.0～12.0 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系，可用于計算三萜類化合物的得率。

2.2 單因素實(shí)驗結(jié)果

2.2.1 超聲功率對三萜類化合物得率的影響

由圖1 可知，超聲功率在200 W 以下，隨著提取功率的增加，三萜類化合物的得率也增大，至200 W 時三萜類化合物的得率達(dá)到最大值；功率為250 W 時，眼樹蓮中三萜類化合物的得率呈下降趨勢?？赡苁且驗槌暪β试?00 W 時，超聲波的空化作用與機(jī)械作用達(dá)到較好的結(jié)合點(diǎn)，眼樹蓮中三萜類化合物完全溶出［14］，故超聲功率選擇200 W為宜。

2.2.2 溫度對三萜類化合物得率的影響

由圖2 可知，超聲溫度＜55℃時，三萜類化合物得率隨著溫度升高而逐漸增加；超聲溫度＞55℃時，三萜類化合物得率有所下降。這是因為隨著提取溫度的上升，介質(zhì)擴(kuò)散速率加速，分子運(yùn)動劇烈增加，有利于提升三萜類化合物的得率［18-19］。但溫度過高，會影響三萜類化合物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致得率下降［20］，故選擇提取溫度為55℃。

2.2.3 超聲提取時間對三萜類化合物得率的影響

由圖3可知，提取時間對眼樹蓮三萜類化合物的得率有一定影響。30 min時三萜類化合物的得率提高比較明顯，40 min時三萜類化合物得率達(dá)到最大值（14.53 mg/g），隨后三萜類化合物的得率不斷下降。由于剛開始物料與溶劑的接觸越來越充分，因此得率逐漸增加，但隨時間的延長，雜質(zhì)的溶出增加，這可能降低了浸提速度［13-14］，因此選擇超聲提取時間40 min為宜。

2.2.4 液料比對眼樹蓮三萜類化合物得率的影響

由圖4可知，液料比對眼樹蓮三萜類化合物得率具有一定的影響。隨著液料比的增加，三萜類化合物得率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)液料比達(dá)到30∶1（mL/g）時，眼樹蓮中三萜類化合物得率達(dá)到最高。前期由于液料比過低，料液粘稠增加，超聲波空化作用減小，不利于超聲波在溶劑中的傳播擴(kuò)散［21］，所以隨著液料比的增加，眼樹蓮中三萜類化合物得率有所提高。但是液料比過大也會使溶劑和能耗增加，從而造成浪費(fèi)，并增加下一步濃縮工序的難度［8，14，22］，故選擇提取液料比為30∶1（mL/g）。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面模型建立與顯著性分析

基于單因素實(shí)驗結(jié)果，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化眼樹蓮三萜類化合物提取工藝［15］，響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗結(jié)果見表2。利用Design-Expert11 軟件對實(shí)驗所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，獲得以超聲功率（A）、溫度（B）、時間（C）、液料比（D）為因素水平，以眼樹蓮中三萜類化合物得率為評價指標(biāo)（Y）的二次多項回歸方程式：Y＝20.736＋1.87A－1.77B＋1.49C＋1.38D－0.982 5AB＋0.422 5AC＋1.51AD－0.547 5BC＋1.06BD＋0.955 0CD－2.82A2－3.05B2－2.06C2－3.15D2

表2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗結(jié)果

利用方差分析進(jìn)一步驗證模型的可靠性，實(shí)驗結(jié)果見表3。模型p值＜0.000 1，表明方程模型極其顯著，失擬項p值＞0.05，表明失擬不顯著，說明模型擬合程度較好［23-24］。用R2決定系數(shù)和R2Adj調(diào)整決定系數(shù)來檢查方程的擬合程度。實(shí)驗真實(shí)值與模型預(yù)測值的決定系數(shù)R2＝0.966 5、調(diào)整決定系數(shù)說明該模型擬合程度良好，可靠性較高，實(shí)驗值與預(yù)測值之間具有較高的關(guān)聯(lián)性［25］，可以利用該模型預(yù)測眼樹蓮三萜類化合物的最高得率；在所考察的獨(dú)立因素、因素間交互項及因素的二次項中，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2對眼樹蓮三萜類化合物得率影響極其顯著（p＜0.01），AB、AD、BD、CD對眼樹蓮三萜類化合物得率影響顯著（p＜0.05），這些因素對三萜類化合物得率影響較大，具有統(tǒng)計學(xué)意義，故認(rèn)為4個因素不僅其簡單的線性關(guān)系影響著得率，而且其交互項、二次項對得率均有一定的影響。方差分析表中各因素的F值反映因素對響應(yīng)值的重要性，F(xiàn)值越大，表明對響應(yīng)值的影響越大，重要性越大［26］。經(jīng)分析可知，各因素對眼樹蓮三萜類化合物得率影響程度大小順序為超聲功率（A）＞溫度（B）＞時間（C）＞液料比（D）。

表3 以三萜類化合物得率為響應(yīng)值回歸模型方差分析

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析及條件優(yōu)化

曲面圖和等高線圖可以形象地反映響應(yīng)值隨各因素的變化趨勢［26］。利用 Design-Expert11 軟件對上述實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，繪制出超聲功率、溫度、時間、液料比這4個因素之間的交互作用對三萜類化合物得率影響的響應(yīng)面，可以得到該模型的響應(yīng)面圖和等高線圖，見圖5。響應(yīng)面圖的曲面曲線走勢越陡，表明兩因素的交互作用越顯著［27］。等高線為橢圓形表示兩因素的交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著［28］。從圖5可知，提取功率（A）與液料比（D）的等高線呈橢圓，且兩者的響應(yīng)面圖形曲線走勢較陡，說明這兩因素對眼樹蓮三萜類化合物的得率影響極其顯著；提取功率（A）與提取溫度（B）、提取溫度（B）與液料比（D）、提取時間（C）與液料比（D）的等高線趨近于橢圓形，說明兩因素間交互作用對三萜類化合物得率影響顯著；提取功率（A）與提取時間（C）、提取溫度（B）與提取時間（C）的等高線均趨向圓形，說明兩個因素間的交互作用對三萜類化合物得率影響不顯著。以上響應(yīng)面圖形分析結(jié)果與方差分析（表3）相符合。根據(jù)建立的模型進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化分析，以得率的最高值為優(yōu)化目標(biāo)，得最優(yōu)工藝為：超聲功率225.57 W、溫度48.25℃、時間45.23 min、液料比23.55∶1（mL/g）。根據(jù)實(shí)驗條件進(jìn)行修正：超聲功率225 W、溫度48℃、時間46 min、液料比為23∶1（mL/g），并按照響應(yīng)面優(yōu)化后的條件采用含量測定方法進(jìn)行驗證實(shí)驗，實(shí)驗結(jié)果見表4，所得得率平均值為22.12 mg/g，RSD為0.3%，預(yù)測值22.20 mg/g，預(yù)測值與實(shí)際值誤差較小，說明響應(yīng)面優(yōu)化模型可靠，結(jié)果表明該實(shí)驗條件具有重現(xiàn)性、可控性。

表4 眼樹蓮中三萜類化合物驗證實(shí)驗結(jié)果

2.4 條件對比實(shí)驗結(jié)果

分別利用響應(yīng)面優(yōu)化后的實(shí)驗條件（1#）與張?zhí)旎ǖ龋?］優(yōu)化后的實(shí)驗條件（2#）提取三萜類化合物，2種方法的得率大小對比實(shí)驗結(jié)果見表5。結(jié)果表明，響應(yīng)面優(yōu)化的實(shí)驗條件得率較高，實(shí)驗溫度條件較為溫和。

表5 兩種種實(shí)驗條件提取三萜類化合物的得率比較結(jié)果

2.5 高效液相色譜鑒別結(jié)果

分別將1#和2#工藝提取得到眼樹蓮中三萜類化合物及齊墩果酸按照1.2.6.1的實(shí)驗條件進(jìn)行液相色譜測定，液相色譜圖見圖6。從圖6 可知其均含有相同出峰時間的物質(zhì)，說明眼樹蓮中含有三萜類提取物。

2.6 抗炎活性實(shí)驗結(jié)果

實(shí)驗結(jié)果見表6。眼樹蓮中三萜類化合物能夠抑制小鼠耳腫脹，與空白對照組比較，耳腫脹抑制率為69.1%，說明眼樹蓮中三萜類化合物具有抗炎活性。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

目前，關(guān)于植物三萜類化合物提取工藝的研究報道較多［14-16，18，21-23］，但對眼樹蓮三萜類化合物提取工藝的研究較少。李志等［14］采用超聲波輔助法對薏苡仁中三萜化合物提取工藝進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該方法得率較高，且設(shè)備簡單。蘇元元等［16］采用Box-Benhnken 響應(yīng)面分析法通過優(yōu)化獲得簡單、高效的提取夏枯草中三萜類化合物工藝。呂蘇珊［29］采用Box-Benhnken 響應(yīng)面分析法優(yōu)化蘿藦科黑骨藤皂苷類成分提取工藝，得到相關(guān)可靠參數(shù)。綜上研究可以看出，蘿藦科眼樹蓮三萜類化合物提取工藝可采用超聲波輔助提取及Box-Benhnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化。響應(yīng)面分析是通過設(shè)計合理實(shí)驗的方法，運(yùn)用多元二次回歸方程來擬合因素和響應(yīng)值的關(guān)系，尋找最佳響應(yīng)值的統(tǒng)計方法［30］。響應(yīng)面分析法與傳統(tǒng)的正交設(shè)計相比，既能體現(xiàn)提取過程中不同因素之間的交互作用關(guān)系，又能更加精確地篩選出最佳提取工藝，對于非線性響應(yīng)因素的預(yù)測具有較強(qiáng)的指導(dǎo)性，應(yīng)用價值

較高［31］。

表6 眼樹蓮中三萜類化合物抗炎活性實(shí)驗結(jié)果

3.2 結(jié)論

本研究在單因素的基礎(chǔ)上，選擇對三萜類化合物得率影響較大的因素，通過響應(yīng)面分析法對眼樹蓮三萜類化合物提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，最后確定其最佳提取工藝：超聲功率225 W、溫度48℃、時間46 min、液料比為23∶1（mL/g），在此條件下，眼樹蓮的三萜類化合物得率可達(dá)到22.12 mg/g，得率明顯高于張?zhí)旎ǖ龋?］用正交法優(yōu)化的條件。獲取的三萜類化合物經(jīng)高效液相色譜鑒定可知其含有三萜類物質(zhì)，通過小鼠耳腫脹實(shí)驗可知其具有一定抗炎活性。本研究結(jié)果說明該工藝具有較好的應(yīng)用價值，為深入研究眼樹蓮提供一定的參考價值和理論依據(jù)。