高圣風 楊開虎 劉愛勤 茍亞峰 孫世偉 王 政 孟倩倩

(1 中國熱帶農業(yè)科學院香料飲料研究所 海南萬寧 571533;2 海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質調控重點實驗室 海南萬寧 571533;3 云南農業(yè)大學熱帶作物學院 云南普洱 665000)

胡椒瘟病廣泛分布于世界上所有胡椒生產國家和地區(qū)，也是危害中國胡椒生產的首要病害，其病原物是辣椒疫霉（Phytophthora capsiciLeon.）［1-2］。該病害于 20 世紀 70 年代在中國海南主產區(qū)一度爆發(fā)流行，摧毀了大片胡椒園，致使海南省胡椒種植面積縮減20%以上［3-4］。胡椒瘟病主要危害胡椒主蔓基部，植株染病后死亡率極高，可隨風雨和農事操作向四周迅速傳播，控制病源和切斷傳播途徑是防控該病害的一貫方針［3-4］。

游動孢子在有水環(huán)境中能夠識別寄主并主動游到寄主表面完成侵染，是辣椒疫霉最主要的侵染源和傳播形式［5-6］。游動孢子的數(shù)量多少是決定辣椒疫霉病害能否爆發(fā)流行的關鍵，也是國內外科學家關注的熱點。程穎超等［7］分析了Actin基因序列差異并特異性引物YM2F/YM2R，開發(fā)了基于實時熒光定量PCR的游動孢子定量檢測技術，以監(jiān)測和評估病害發(fā)生趨勢。Dong 等［8］基于辣椒疫霉ITS 序列的特異性和環(huán)介導等溫擴增（LAMP），建立了更為簡便快速的辣椒疫霉定性檢測技術。Ivey 等［9］開發(fā)了利用熒光染料 FUN-1 實時監(jiān)測辣椒疫霉游動孢子產量的方法。明確自然環(huán)境中影響胡椒瘟病菌游動孢子產量的因素，是認識和防控該病害的重要基礎。

培養(yǎng)基對辣椒疫霉游動孢子產量的影響廣受關注。已報道的辣椒疫霉產孢培養(yǎng)基種類有很多，包括V8 蔬菜汁培養(yǎng)基（V8），黑麥培養(yǎng)基（RA）、胡蘿卜培養(yǎng)基 （CA）、大豆培養(yǎng)基 （BA） 等等［9-12］。但是，不同來源的菌株在相同培養(yǎng)基上的游動孢子產量存在差異。張榮等［13］采用光照誘導的方法分析了來源于廣州的辣椒疫霉在5種培養(yǎng)基上的游動孢子產量，發(fā)現(xiàn)其在燕麥瓊脂培養(yǎng)基上產生游動孢子的數(shù)量最多。侯全剛［14］對同樣5 種培養(yǎng)基開展研究，發(fā)現(xiàn)分離自青海循化縣的辣椒疫霉在馬鈴薯培養(yǎng)基上的游動孢子產量顯著高于其他培養(yǎng)基［14］。

影響辣椒疫霉游動孢子產量的環(huán)境因素有很多，其中光照是公認的誘導辣椒疫霉產生游動孢子的必要條件。王曉敏等［15］和李立鳳等［16］分析不同光照方式對辣椒疫霉游動孢子產量的影響，發(fā)現(xiàn)持續(xù)黑暗培養(yǎng)無法產生游動孢子，全光照條件下游動孢子產量顯著高于間歇性光照，全光培養(yǎng)條件下游動孢子產量隨光照時間的延長而增多［15-16］。許亞池等［12］研究發(fā)現(xiàn)，黑暗培養(yǎng) 5 d 的辣椒疫霉菌經光照誘導后可以產生多達106個/mL的游動孢子，加入無菌水淹沒菌絲能夠顯著提高游動孢子產量。蘭成忠等［10］研究發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉經黑暗培養(yǎng)后，用玻棒將菌絲輕輕涂抹壓倒后再光照誘導，獲得的游動孢子產量顯著高于加無菌水淹沒菌絲后直接光照誘導［10］。誘導辣椒疫霉產孢的溫度條件通常認為25～26℃最佳，但是不同來源的菌株間也存在差異。侯全剛［14］發(fā)現(xiàn)分離自青海循化縣的辣椒疫霉在22～32℃均可產孢，30℃時產孢量最高。此外，自然環(huán)境中作物根系分泌物對辣椒疫霉游動孢子產量也有影響。王繼元等［17］發(fā)現(xiàn)，在不同抗性的品種之間，抗病強的辣椒品種PRMND 和DNP56 的根系分泌物能夠顯著抑制辣椒疫霉游動孢子囊形成，而感病品種‘科星6號’則沒有明顯差異。

以上相關研究中的辣椒疫霉菌株均分離自辣椒、南瓜等溫帶蔬菜作物。胡椒瘟病菌雖然屬于辣椒疫霉種，但是其在遺傳學系統(tǒng)發(fā)育樹上與來源于溫帶的辣椒、茄子等作物上的辣椒疫霉菌，分屬不同的分類亞群［18］。目前尚未見胡椒瘟病菌產孢影響因素相關報道。前期，本研究室建立了胡椒瘟病孢子囊及游動孢子誘導方法，在V8 培養(yǎng)基上連續(xù)光照培養(yǎng)可以誘導產生大量的游動孢子［19］。在此基礎上，本研究分析光照強度、溫度、相對濕度和pH 變化對胡椒瘟病菌產孢的影響，為認識胡椒瘟病成災機制和建立針對性病害防控措施奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及保存

胡椒瘟病菌（P. capsici）分離自海南省萬寧市胡椒病株，由本研究室近期分離鑒定，室溫保存于PDA斜面試管中。

1.1.2 培養(yǎng)基

誘導胡椒瘟病菌產孢所用的培養(yǎng)基為10% V8蔬菜汁瓊脂（V8-A）培養(yǎng)基，配制方法如下： 將V8 蔬菜汁在5 000 g 條件下離心5 min，取上清液100 mL，加入CaCO31 g、瓊脂粉20 g，用去離子水定容至1 000 mL，調節(jié)pH 至7.0，分裝后于121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 不同環(huán)境條件下胡椒瘟病菌游動孢子誘導

將胡椒瘟病菌接種在V8-A平板中央，用錫紙包裹避光，在26℃條件下黑暗培養(yǎng)7 d 后解除錫紙；用無菌玻璃棒輕輕涂壓菌絲使其貼附于平板表面，在恒溫光照培養(yǎng)箱（珠江牌，LRH-800-GSI Plus）中誘導產孢48 h，每個平板加入無菌水10 mL，先4℃恒溫1 h 后再26℃恒溫1 h，使游動孢子充分釋放；在此基礎上，將“在恒溫光照培養(yǎng)箱中誘導產孢48 h”階段設置不同的光照強度、溫度、相對濕度、pH 等環(huán)境條件處理，檢測不同條件對胡椒瘟病菌游動孢子產量的影響。所有試驗均設置3個重復。按環(huán)境因子分別將各試驗處理介紹如下。

1.2.1.1 光照強度

共設置6 個處理，光照強度分別為黑暗處理、200、2 000、5 000、10 000 和 20 000 lx。其中黑暗處理用雙層錫紙包裹；光照條件通過恒溫光照培養(yǎng)箱設置，用照度計（Spectrum，3414FQF）確認平板放置位點的實際光照強度，當光照強度無法達到設定值時添加適量的白光LED燈補光。按照6 個不同光照強度進行游動孢子誘導，其他試驗條件均為26℃、pH7.0、密封平板內自然濕度。

1.2.1.2 溫度

共設置5個處理，溫度分別為15、20、25、30和35℃。溫度條件通過光照培養(yǎng)箱（珠江牌，LRH-800-GSI Plus）進行設置。培養(yǎng)箱內實際溫度通過溫濕度計（OMEGA，OM-HL-SH-TH）進行確認。按照5個不同溫度條件進行游動孢子誘導，其他試驗條件均為光照強度5 000 lx、pH7.0、密封平板內自然濕度。

1.2.1.3 濕度

共設置5 個處理，相對濕度分別約為50%、65%、85%、95%和99%。無菌環(huán)境的濕度條件通過以下方法獲得：在容量為1 L 的燒杯中加入800 mL蛭石后用封口膜封口，以121℃滅菌30 min 后放入90℃電熱恒溫鼓風干燥箱中干燥24 h，在超凈工作臺中分別加入無菌水0、75、150、300、600 mL，置于26℃恒溫24 h，使用溫濕度計（OMEGA，OMHL-SH-TH） 檢測燒杯中空氣濕度分別約為50%、65%、85%、95%和99%；在超凈工作臺中將待誘導產孢的平板去除上蓋，放入燒杯中的蛭石上，封口后放入光照培養(yǎng)箱中，在5 000 lx、26℃、pH 7.0條件下誘導游動孢子。

1.2.1.4 pH

共設置7 個處理，pH 值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0。將磷酸氫鹽緩沖液（gibco，1×PBS）加無菌水稀釋10 倍，使用pH 計（Mettler-Toledo ， SevenCompact S210） 調節(jié)pH至各梯度值，形成7 種不同pH 的處理液；分別向待誘導產孢的平板中加入10 mL 處理液浸泡菌絲，以形成不同的pH環(huán)境，在5 000 lx、26℃、液體環(huán)境條件下誘導游動孢子，后期不再加入無菌水。

1.2.2 游動孢子產量調查

將產孢平板中液體輕輕搖晃均勻，吸取20μL滴加在血球計數(shù)板（XB-K-25）上，輕輕蓋上蓋玻片，置于奧林巴斯IX73 顯微鏡載物臺上，用10×40 倍視野進行觀察。每個平板制作3 個臨時裝片，每個裝片統(tǒng)計中央大方格四角處4個方格內的游動孢子總數(shù)（n100），根據(jù)公式計算游動孢子濃度［12］：游動孢子濃度（個/mL）＝n100×4×104。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0 軟件進行分析處理，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），費雪最小顯著差異檢驗（Fisher’sleast-signifi‐cant difference test，LSD）（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 光照強度對游動孢子產量的影響

結果顯示，在其他因素一致的情況下，光照強度對胡椒瘟病菌游動孢子產量影響很大（圖1）。隨著光照強度在0～20 000 lx 逐步增強，胡椒瘟病菌游動孢子產量呈拋物線趨勢。黑暗條件下不產生游動孢子，隨光照增強產孢量迅速上升；在5 000 lx條件下產孢量達到頂峰，為1.10×106個/mL，分別是 2 000 和 10 000 lx 條件下的 6.89 倍和 12.40 倍；在10 000 lx條件下產孢量僅有8.89×104個/mL，與20 000 lx 條件下的產孢量無顯著性差異（p＜0.05）。

2.2 溫度因素對游動孢子產量的影響

結果顯示，在其他因素一致的情況下，溫度條件變化能夠明顯影響胡椒瘟病菌游動孢子產量（圖2）。在15～35℃培養(yǎng)條件下，均能誘導胡椒瘟病菌產生游動孢子，其產量隨溫度上升呈拋物線趨勢。在25℃條件下的產孢量最高，達1.11×106個/mL；拋物線在頂點左右基本對稱，在20和30℃條件下也能產生大量游動孢子，分別為5.82×105和7.29×105個/mL；在15 和35℃條件下的產孢量遠低于其他溫度條件，處于1×104個/mL 水平。除了15 和35℃2 個處理之間的產孢量差異不顯著之外，其他所有處理間均存在顯著性差異（p＜0.05）。

2.3 濕度因素對游動孢子產量的影響

結果顯示，在其他因素一致的情況下，相對濕度因素對胡椒瘟病菌游動孢子產量具有一定的影響（圖3）。隨著相對濕度在50%～99%逐步上升，胡椒瘟病菌游動孢子產量呈先略微上升再明顯下降的趨勢。相對濕度在50%和60%條件下，產孢量分別為1.01×106和1.16×106個/mL，但二者間差異不顯著；隨濕度上升游動孢子產量呈顯著下降趨勢；99%濕度條件下的產孢量低于95%濕度條件，但差異不顯著（p＜0.05）。

2.4 pH因素對游動孢子產量的影響

結果顯示，在其他因素一致的情況下，環(huán)境pH 變化對胡椒瘟病菌游動孢子產量影響較大（圖4）。隨著pH 在4.0～10.0 逐步上升，胡椒瘟病菌游動孢子產量呈先升后降的拋物線趨勢。pH 6.0～8.0 時產孢量較高，其中pH 7.0 的產孢量最高，為5.14×104個/mL；過酸（≤pH 5.0）或者過堿（≥pH 9.0）的環(huán)境中游動孢子產量均迅速下降。

3 討論與結論

3.1 討論

眾多研究表明，辣椒疫霉在黑暗條件不產生游動孢子，光照是誘導產孢的重要前提條件。但是，侯全剛［14］、王曉敏等［15］和李立鳳等［16］研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)光照比間歇式光照更有利于辣椒疫霉產生游動孢子，并未計量光照強度。何烈干等［20］、劉裴清等［21］和蘭成忠等［22］研究認為，誘導辣椒疫霉產孢的光照強度分別為2 000、800 和500 lx不等。本研究首次分析了不同光照強度對胡椒瘟病菌游動孢子產量的影響，發(fā)現(xiàn)5 000 lx光照強度下胡椒瘟病菌游動孢子產量最高，該光照強度遠高于上述研究中的光照強度。需要注意的是，胡椒瘟病菌雖然屬于辣椒疫霉，但是其在遺傳學系統(tǒng)發(fā)育樹上與來源于溫帶的辣椒、茄子等溫帶作物上的辣椒疫霉分屬不同的分類亞群［18］，推測來自熱帶的胡椒瘟病菌最適光照強度高于來自溫帶的辣椒疫霉。另外，陰雨天氣室外的光照強度范圍是50～500 lx，晴天室外光照強度范圍是10 000～100 000 lx。所以推測，自然環(huán)境中陰雨過后至天氣轉晴前這段時間的光照條件最適合胡椒瘟病菌產生游動孢子。

國內外報道中，誘導辣椒疫霉產生游動孢子的溫度條件通常為 25～28℃［1，9-13，15-16］，但也有例外，侯全剛［14］發(fā)現(xiàn)分離自青海線椒上的辣椒疫霉在30℃時產孢量最高［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，胡椒瘟病菌最適產孢溫度是25℃，在20～30℃均能產生大量游動孢子，該最適產孢溫度與當前國內外普遍選用的游動孢子誘導溫度一致。桑利偉等［2-3］報道稱，中國胡椒主產區(qū)海南省胡椒瘟病周年均可發(fā)生，4月和10月是病害發(fā)生高峰期，該地區(qū)周年溫度條件中，2～12 月份平均溫度均在20～30℃，僅1月份平均溫度略低（約18℃），2個發(fā)病高峰期的月平均溫度均約為26℃。由此推測，胡椒瘟病在海南周年均可發(fā)生可能與全年溫度均較適合產孢有關，病害發(fā)生率與游動孢子產量可能呈正相關關系。

對于辣椒疫霉產生游動孢子的濕度條件，國內外多采用環(huán)境自然濕度或者室內培養(yǎng)時平板內的自然濕度［1，9-16］，尚未見關于環(huán)境濕度對產孢量影響的研究，這可能與建立無菌恒濕的環(huán)境條件難度大有關。本研究嘗試向無菌燒杯里加入不同比例的干燥蛭石和水以建立不同濕度梯度的無菌環(huán)境，發(fā)現(xiàn)在恒溫條件下不同處理的燒杯中，空氣相對濕度呈現(xiàn)較為穩(wěn)定的濕度梯度?；诖搜b置，本研究首次分析了空氣濕度對胡椒瘟病菌游動孢子產量的影響，結果發(fā)現(xiàn)，在50%～99%的濕度范圍內，胡椒瘟病菌均有較高的產孢量（≥2.27×105個/mL），其中相對濕度較低 （50% 和65%）時的產孢量顯著高于高濕度條件（≥85%），說明胡椒瘟病菌可能偏好在較為干燥的環(huán)境中產孢。

本研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境條件為pH 7.0 時，胡椒瘟病菌游動孢子產量最高，這與侯全剛［14］報道一致。此外，本研究為了創(chuàng)建不同pH 梯度的產孢環(huán)境，在誘導產孢平板上加入了不同pH 的PBS 緩沖液浸泡菌絲，但是獲得的游動孢子產量最大僅為5.14×104個/mL，遠低于其他3 種因素試驗中的最大產孢量（約1.0×106個/mL），說明磷酸緩沖液浸泡不利于胡椒瘟病產生游動孢子。

3.2 結論

研究結果表明，光照強度、溫度、相對濕度、pH 等環(huán)境因素均對胡椒瘟病菌游動孢子產量具有顯著影響，胡椒瘟病菌產生游動孢子最適宜的環(huán)境條件約為：光照強度5 000 lx、溫度25℃、相對濕度65%、pH 7.0。