游雨欣

摘要：由植物病毒感染引起的作物歉收是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的持續(xù)問題。為了最大程度地減少病毒造成的破壞并確保農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，探索快速準(zhǔn)確的檢測方法來控制這些植物病毒非常重要。而PCR和建立在PCR基礎(chǔ)上的分子生物學(xué)技術(shù)以其靈敏、快速、簡便等優(yōu)點在植物病害檢測中得到了廣泛應(yīng)用[1]。本綜述就此著重論述PCR相關(guān)技術(shù)的多種分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其在植物病毒檢測中的應(yīng)用，并對未來研究植物病毒檢測方面做出了展望。

關(guān)鍵詞：PCR技術(shù);植物病毒;檢測

植物病毒已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一百余年，但是仍然沒有有效的方法來預(yù)防和治愈。中國有的植物病毒種類繁多，每年都會對作物的產(chǎn)量和質(zhì)量產(chǎn)生重大影響。、因此，缺乏有效的控制劑會導(dǎo)致很高的經(jīng)濟(jì)損失，建立方便，高效和快速的植物病毒檢測方法是解決問題的關(guān)鍵。

目前用于病毒檢測法主要是酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），盡管ELISA的檢測靈敏度遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)生物學(xué)方法，但仍存在一些難以檢測和含量少的韌皮部病毒的缺陷[2]。而PCR及其相關(guān)技術(shù)以其快速、靈敏和準(zhǔn)確等優(yōu)點已廣泛應(yīng)用于植物病毒的檢測。本文評述了近年來RT-PCR技術(shù)在植物病毒檢測中應(yīng)用，及以其為基礎(chǔ)衍生出來的一些分子生物技術(shù)，為進(jìn)后續(xù)的研究提供參考價值。

1反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

RT-PCR已被遍及用于植物病毒疾病的檢測中，通常包含四個步驟：從待測樣品中提取病毒RNA，cDNA的逆轉(zhuǎn)錄合成，目標(biāo)cDNA片段的PCR擴(kuò)增以及PCR產(chǎn)物的電泳檢測，添加病毒的特異性引物以完成病毒的檢測[3]。葉明等[4]基于Taq聚合酶的聚合酶活性并具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的特征，發(fā)現(xiàn)僅在Taq聚合酶的作用下即可完成RT-PCR擴(kuò)增。

現(xiàn)如今隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，傳統(tǒng)的RT-PCR檢測技術(shù)也在不斷完善，主要集中在RT-PCR反應(yīng)程序和反應(yīng)體系、病毒RNA的提取、PCR產(chǎn)物的檢測、特異性的提高等方面，也因此不斷拓寬了一系列的新方法。

1.1多重RT-PCR檢測技術(shù)

多重RT-PCR（m-RT-PCR）對常規(guī)RT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行改進(jìn)，在同一RT-PCR反應(yīng)體系中使用多對分別針對不同病毒的引物，在一個PCR反應(yīng)中同時擴(kuò)增多種病毒的基因片段，它可以同時檢測多種病毒，提高了檢測效率。m-RT-PCR也可對同一種病毒進(jìn)行多重檢測，降低假陽性的出現(xiàn)。

張威等[5]基于馬鈴薯生產(chǎn)領(lǐng)域中發(fā)病率高、易發(fā)生復(fù)合感染的PV、PVY和PLRV病毒，建立了m-RT-PCR檢測體系。DNAstar軟件測序結(jié)果顯示，PLRV、PVY、PVS擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小與預(yù)期一致，序列與相應(yīng)病毒序列同源性達(dá)98%以上，驗證了m-RT-PCR檢測結(jié)果的可靠性。因此，RT-PCR檢測技術(shù)真正投入實際應(yīng)用的發(fā)展方向?qū)⑹莔-RT-PCR技術(shù)。

1.2免疫捕捉RT-PCR檢測技術(shù)

免疫捕捉RT-PCR（IC-RT-PCR）是結(jié)合免疫學(xué)和RT-PCR建立的檢測方法。IC-RT-PCR操作過程：用特異性抗體捕獲病毒顆粒后，進(jìn)行熱變性，然后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增和電泳檢測。陳建軍[6]等使用IC-RT-PCR檢測-Ⅲ葡萄葉卷曲病毒，建立IC的檢測方法，RT-PCR方法極大拓寬了病毒檢測領(lǐng)域，彌補(bǔ)了ELISA和RT-PCR以及這兩種方法的一些不足，是一種較可行的病毒檢測方法。

1.3試管捕捉-RT-PCR檢測技術(shù)

TC-RT-PCR是在普通RT-PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新方法。它不需要提取RNA，但使用了一個病毒檢測和基因克隆技術(shù)，它結(jié)合了非特異性結(jié)合的病毒粒子與試管和RT-PCR擴(kuò)增外殼蛋白，以避免RNA降解與普通RT-PCR可以獲得相同的結(jié)果，該技術(shù)已被應(yīng)用于一些植物病毒的檢測。

沈建國等[7]建立了大豆種皮上BPMV的TC-RT-PCR檢測方法，既不需要特異性抗血清，也不需要提取高純度的RNA，并且避免了使用有機(jī)溶劑，并且操作簡便，因此具有良好的應(yīng)用價值，不僅適合于少量大豆種子直接檢測BPMV，還可以用于ELISA試驗陽性，用于大豆種子實驗。

1.4核酸序列依賴性擴(kuò)增檢測技術(shù)

NASBA最先由Guatellietal.等[8]提出，接著Compton[9]對此進(jìn)行了完善，并且更進(jìn)一步來系統(tǒng)說明。NASBA是一種基于PCR的恒溫擴(kuò)增技術(shù)，適用于單鏈RNA的一步擴(kuò)增和檢測。與PCR原理不同，NASBA由一對引物引導(dǎo)。在含有T7RNA聚合酶，RNAseH，逆轉(zhuǎn)錄酶AMV和NTP的反應(yīng)系統(tǒng)中，核苷酸序列的等溫擴(kuò)增是通過連續(xù)且均勻的體外特異性酶促反應(yīng)進(jìn)行的。NASBA的應(yīng)用十分廣泛，常用于檢測帶有豆類病毒的草莓干痘病毒，南芥菜花葉病毒，柑桔裂皮，柑桔病毒IV，馬鈴薯葉片卷曲病毒等。

1.5 環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)

LAMP是一種特異性，靈敏和簡單的新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)是利用BstDNA聚合酶鏈置換活性提供反應(yīng)動力學(xué)，在恒溫短時（30～60 min）的條件下完成目標(biāo)DNA的有效擴(kuò)增，反應(yīng)分為兩個階段，即反應(yīng)物啞鈴模板合成，循環(huán)開始時的基因擴(kuò)增，延伸和循環(huán)階段[10]。

Fukuta等[11]開發(fā)了一種基于CaMV35S啟動子的LAMP檢測方法，可以檢測出0.5%?5%的轉(zhuǎn)基因大豆及其制品。孫敏[12]等使用LAMP方法檢測花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子，其靈敏度高達(dá)0.002%。

2展望

農(nóng)藥的過度使用，環(huán)境變化和全球化加劇植物病毒的傳播和發(fā)展，使植物病毒的檢測變得更加重要。生物檢測簡單明了，但由病毒-宿主相互作用引起癥狀常常被混淆，因此開發(fā)出基于分子生物學(xué)的植物病毒血清學(xué)檢測方法，并已被廣泛使用，其中包括LAMP等溫核酸擴(kuò)增方法，包括比常規(guī)PCR更高的PCR方法，并且作為檢測植物病毒敏感性更高的一部分。并且正在被應(yīng)用。

隨著生物學(xué)的發(fā)展，植物病毒的檢測技術(shù)也在不斷發(fā)展，例如，研究了基于微流控芯片技術(shù)和microRNA深度測序技術(shù)的檢測方法或?qū)⑵鋺?yīng)用于植物病毒的檢測。研究了使用磁珠和橫流紙傳感器進(jìn)行傳統(tǒng)免疫測定和色譜分析的反應(yīng)（RPCR），它們克服了單一方法的缺點，使檢測更加高效和靈敏。為避免單一技術(shù)的缺陷，檢測結(jié)合兩種以上技術(shù)的方法越來越受到人們的重視，有望成為未來植物病毒檢測技術(shù)的主要研究方向，并成為一種強(qiáng)大的病毒識別工具。

References

[1]. 盧會翔等， 甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）和甘薯褪綠矮化病毒（SPCSV）熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016. 49（01）： 90-102.

[2]. 吳興泉等， 馬鈴薯病毒的RT-PCR檢測技術(shù)評述. 中國馬鈴薯[J]， 2011. 25（04）： 251-254.

[3]. 秦文韜等， 環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）及其在植物病毒檢測中的研究進(jìn)展. 中國農(nóng)學(xué)通報[J]， 2013. 29（21）： 170-174.

[4]. 葉明等， 單酶法RTP-CR檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒. 華北農(nóng)學(xué)報[J]， 2002（01）： 41-45.

[5]. 張威等， 三種馬鈴薯病毒多重RT-PCR檢測體系建立. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報[J]， 2014. 45（05）： 13-18.

[6]. 陳建軍等， IC-RT-PCR檢測葡萄卷葉病毒Ⅲ的研究. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)[J]， 2006（08）： 109-112.

[7]. 沈建國等， TC/IC-RT-PCR檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）[J]， 2012. 41（01）： 13-17.

[8]. Guatelli， J.C.， et al.， Isothermal， in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1990. 87（19）： p. 7797-7797.

[9]. Compton， J.， Nucleic acid sequence-based amplification[J]. Nature， 1991. 350（6313）： p. 91-200.

[10]. Notomi， T.， et al.， Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic acids research， 2000. 28（12）： p. E63-E63.

[11]. Fukuta， S.， et al.， Detection of Ceratocystis Fimbriata from Fig Tree and Soil by the Loop-mediated Isothermal Amplification （LAMP） Method[J]. Research Bulletin of the Aichi-ken Agricultural Research Center， 2009（41）： p. 1-6.

[12]. 孫敏等， 花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子LAMP檢測方法的建立[J]. 食品科技， 2010. 35（04）： 255-258.