高華娟 黃小靖 郭麗宏 何文勝

摘要 目的：探究并分析加味香砂六君子湯通過抑制Wnt信號(hào)通路對(duì)胃癌大鼠樁蛋白（paxillin）、大鼠凋亡相關(guān)蛋白（RelA）表達(dá)的影響。方法：選取健康成年Wistar大鼠120只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和觀察組，每組60只，對(duì)2組大鼠進(jìn)行胃癌造模處理，對(duì)照組大鼠又隨機(jī)分為未處理組、處理（生理鹽水）后8周組、處理（生理鹽水）后12周組，每組20只。觀察組大鼠又隨機(jī)分為未處理組、處理（湯藥）后8周組、處理（湯藥）后12周組，每組20只。觀察2組大鼠處理前、處理后8周、處理后12周paxillin、RelA。結(jié)果：2組大鼠處理前后體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），2組大鼠處理前體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），處理后，2組大鼠體質(zhì)量有所降低，但觀察組大鼠降低程度明顯小于對(duì)照組（P<0.05）;2組大鼠處理前后wnt-1、paxillin、RelA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），2組大鼠處理前wnt-1、paxillin、RelA水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），處理后，2組大鼠wnt-1、paxillin、RelA水平呈降低趨勢(shì)，但觀察組大鼠wnt-1、paxillin、RelA水平明顯小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：加味香砂六君子湯能有效通過抑制wnt以降低胃癌大鼠paxillin、RelA的表達(dá)。

關(guān)鍵詞? 胃癌;大鼠;樁蛋白;大鼠凋亡相關(guān)蛋白;加味香砂六君子湯;信號(hào)通路;體質(zhì)量;表達(dá)

Effect of Jiawei Xiangsha Liujunzi Decoction on Gastric Cancer Rats

GAO Huajuan¹， HUANG Xiaojing²， GUO Lihong¹，HE Wensheng¹

（1 fujian college of bioengineering， Fuzhou 350007， China; 2 Department of general surgery， fuzhou first hospital， Fuzhou 350000， China）

Abstract Objective：To explore and analyze the effect of Jiawei Xiangsha Liujunzi Decoction on the expression of paxillin （post protein） and RelA （apoptotic related protein） in gastric cancer rats by inhibiting Wnt signaling pathway.Methods：120 healthy adult Wistar rats were randomly divided into control group and observation group， 60 rats in each group.Gastric cancer modeling treatment were done for 2 groups of rats.Rats in control group were randomly divided into untreated group， 8 weeks after treatment （saline） group and 12 weeks after treatment （saline） group， 20 rats in each group.The rats in the observation group were randomly divided into untreated group， 8 weeks after treatment （decoction） group and 12 weeks after treatment （decoction） group， 20 rats in each group.Paxillin and RelA were observed before treatment， 8 weeks after treatment and 12 weeks after treatment of the two groups.Results：There was significant difference in the quality of rats between the two groups before and after treatment （P<0.05）.There was no significant difference in the quality of rats between the two groups before treatment （P>0.05）.After treatment， the quality of rats in the two groups decreased， but the degree of reduction in the observation group was significantly lower than that in the control group （P<0.05）.The levels of wnt-1， paxillin and RelA in the two groups before and after treatment were significantly different （P<0.05）.There was no significant difference in the levels of wnt-1， paxillin and RelA between the two groups before treatment （P>0.05）.After treatment， the levels of wnt-1， paxillin and RelA in the two groups decreased， but the levels of wnt-1， paxillin and RelA in the observation group were significantly lower than those in the control group （P<0.05）.Conclusion：Jiawei Xiangsha Liujunzi Decoction can effectively inhibit the expression of paxillin and RelA in gastric cancer rats by inhibiting wnt.

Keywords Gastric cancer; Rat; Pile protein; Rat apoptosis-related protein; Jiawei Xiangsha Liujunzi Decoction; Signaling pathway; Quality; Expression

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.08.009

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在我國(guó)各種惡性腫瘤中發(fā)病率居首位，胃癌發(fā)病有明顯的地域性差別，在我國(guó)的西北與東部沿海地區(qū)胃癌發(fā)病率比南方地區(qū)明顯為高[1]。近年來，隨著人們生活節(jié)奏的加快以及生活壓力的逐漸增大，消化道腫瘤的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[2]。目前，胃癌的主要治療方式就是手術(shù)治療，但是對(duì)于部分尚未達(dá)到手術(shù)指針或者無法耐受手術(shù)的患者，藥物有著重要的治療作用。加味香砂六君子湯是一味常用的中藥，由黨參、白術(shù)、茯苓、陳皮等組成[3]。消化性潰瘍（胃及十二指腸潰瘍）、胃炎合并上消化道出血是中醫(yī)內(nèi)科學(xué)常見的病癥，屬中醫(yī)內(nèi)科“胃脘痛”“血證”的范疇。此外，加味香砂六君子湯對(duì)于脘腹脹滿、隱痛、噯氣、泛酸、畏寒怯冷、便溏、便頻等癥狀也有較好的效果。近來，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加味香砂六君子湯能有效調(diào)控大鼠胃黏膜癌癥相關(guān)因子的表達(dá)，可能有助于癌癥的治療[4]。為此，我們將加味香砂六君子湯用于胃癌模型大鼠的處理中，望探究其對(duì)胃癌大鼠的影響，現(xiàn)將報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康成年Wistar大鼠120只（清潔級(jí)，體質(zhì)量180～220 g），使用C060滅菌的商品化大鼠飼料，自由飲水采食，自然光照，飼養(yǎng)溫度18～]25 ℃，飼養(yǎng)濕度60%～70%。本實(shí)驗(yàn)通過醫(yī)學(xué)倫理學(xué)審查（倫理審批號(hào)：1702234）

1.1.2 藥物 加味香砂六君子湯配方：太子參]50 g、白術(shù)50 g、茯苓50 g、半夏50 g、陳皮50 g、木香50 g、甘草50 g、砂仁50 g、黃芪30 g、竹茹30 g、刺五加30 g、半枝蓮10 g、莪術(shù)10 g，共計(jì)510 g。配自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥局，生產(chǎn)批號(hào)：H2182322。

1.1.3 試劑與儀器 N-甲基-N-亞硝基-N-硝基胍（MNNG，購(gòu)自日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：h2173722）;雷尼替?。ń鲄R仁藥業(yè)有限公司，批號(hào)：yn18392ag007）。維酶素片（北海陽(yáng)光藥業(yè)有限公司，批號(hào)：yg166304）。兔抗人PTEN（批號(hào)：1862831）、FAK（批號(hào)：18239G04）、paxillin單克隆抗體（批號(hào)：72160703-8）購(gòu)于ABcam公司;Anti-PTEN抗體（批號(hào)：1727se18329），Anti-FAK抗體（批號(hào)：Y22173829N），Anti-paxillin抗體（批號(hào)：1626173HX301），通用型SP試劑盒SP-9000（批號(hào)：36268319），DAB顯色試劑盒（批號(hào)：H237623812）均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將Wistar大鼠120只按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對(duì)照組和觀察組，對(duì)2組大鼠進(jìn)行胃癌造模處理，對(duì)照組大鼠又隨機(jī)分為未處理組、處理（生理鹽水）后8周組、處理（生理鹽水）后12周組，每組20只。觀察組大鼠又隨機(jī)分為未處理組、處理（湯藥）后8周組、處理（湯藥）后12周組，每組20只。大鼠之間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)食狀態(tài)正常。造模方法：造模方法參考等人在研究[5]中的造模方法進(jìn)行造模，造模處理2個(gè)月。

1.2.2 給藥方法 觀察組大鼠中未處理組直接處死。處理8周以及12周組大鼠給予加味香砂六君子湯10 g/kg，療程分別為8周以及12周，并分別于8周及12周處死。加味香砂六君子湯采取常規(guī)煎法，共煎出藥液200 mL，濃縮至100 mL（配置成生藥濃度為5 g/mL的水煎膏）。10 mL/瓶，高壓（0.1～0.15 kPa）20 min滅菌后，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?duì)照組大鼠（未處理組）直接處死，其余大鼠給予生理鹽水1 mL灌胃（0.5 g/kg），1次/d，處理8周以及12周組大鼠分別于8周以及12周處死。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 所有大鼠處死后對(duì)胃癌組織進(jìn)行活檢，并送病理檢查。胃黏膜Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵因子Wnt-1采用Real Time PCR技術(shù)檢測(cè)，Paxillin、RelA表達(dá)采用免疫組化法測(cè)定，RelA水平采用平均光密度表示。實(shí)驗(yàn)室檢查由我院兩名檢驗(yàn)科人員操作，試驗(yàn)相關(guān)試劑及試劑盒由我院中心實(shí)驗(yàn)室提供。觀察2組大鼠處理前、處理后8周、處理后12周質(zhì)量、wnt-1表達(dá)、paxillin、RelA表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，所得數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。采用t檢驗(yàn)以及重復(fù)方差分析統(tǒng)計(jì)計(jì)量資料;采用卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)資料，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠質(zhì)量比較 2組大鼠處理前后體質(zhì)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），2組大鼠處理前體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），處理后，2組大鼠體質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，但觀察組大鼠體質(zhì)量明顯大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 2組大鼠wnt-1表達(dá)比較 2組大鼠處理前后wnt-1差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），2組大鼠處理前wnt-1比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），處理后，2組大鼠wnt-1呈降低趨勢(shì)，但觀察組大鼠wnt-1明顯小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 2組大鼠paxillin水平比較 2組大鼠處理前后paxillin水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），2組大鼠處理前paxillin水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（]P>0.05），處理后，2組大鼠paxillin水平呈降低趨勢(shì)，但觀察組大鼠paxillin水平明顯小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3，圖1。

2.4 2組大鼠RelA水平比較 2組大鼠處理前后RelA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），2組大鼠處理前RelA水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），處理后，2組大鼠RelA水平呈降低趨勢(shì)，但觀察組大鼠RelA水平明顯小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表4，圖2。

3 討論

香砂六君子湯由黨參、白術(shù)、茯苓、炙甘草、陳皮、制半夏、廣木香、砂仁所組成，曾改名為健脾和胃湯[6]。該方重點(diǎn)和胃暢中，治療脾胃虛弱、脘腹脹滿、隱痛、噯氣、泛酸等癥。目前常用于治療消化性潰瘍、胃炎等，本方如加黃芪，以參、芪補(bǔ)氣攝血;加炮姜，溫中止血，《本草經(jīng)讀》：“中者土也，土虛則寒，而此能溫之[7]。止血者，以陽(yáng)虛則陰必走，得暖則血自歸經(jīng)也”。香附有行血中之氣，止血而不留瘀。本方益氣健脾統(tǒng)血，溫胃散寒止血，臨床運(yùn)用效果確切，且能治療脾胃虛寒諸癥，增強(qiáng)脾胃運(yùn)化功能。為此，筆者將其用于胃癌大鼠并探究其對(duì)胃癌大鼠的腫瘤相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的影響。

Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑是一組信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其以蛋白質(zhì)開始，所述蛋白質(zhì)通過細(xì)胞表面受體將信號(hào)傳遞到細(xì)胞中[8-9]。Wnt信號(hào)途徑用的只有2種信號(hào)傳導(dǎo)方式：胞間交流（旁分泌）或者相同細(xì)胞的交流（自分泌）。這些信號(hào)通路都在動(dòng)物中在遺傳上是高度保守的，這也意味著它們?cè)趧?dòng)物種間時(shí)很相似的。

Paxillin是一種蛋白質(zhì)，在人類由編碼PXN基因。Paxillin在表達(dá)黏著斑非橫紋肌細(xì)胞中，并在costameres的橫紋肌細(xì)胞，以及其功能是黏附細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)。PXN基因的突變以及Paxillin的異常表達(dá)與各種癌癥的進(jìn)展有關(guān)。Paxillin已被證明在幾種癌癥類型的患者中具有臨床重要作用[10-11]。Paxillin的增強(qiáng)的表達(dá)已在癌前區(qū)域被檢測(cè)增生，鱗狀化生和杯狀細(xì)胞化生，以及發(fā)育異常的病變和癌的高風(fēng)險(xiǎn)患者的肺腺癌。RELA，也稱為p65，是參與NF-κB異二聚體形成，核轉(zhuǎn)位和活化的REL相關(guān)蛋白。RELA的磷酸化和乙?；荖F-κB活化所需的關(guān)鍵翻譯后修飾，RELA也被證明可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，RELA的激活與多種類型的癌癥正相關(guān)。作為NF-κB的原型異二聚體復(fù)合物成員，與p50一起，RELA在經(jīng)典NF-κB活化和核轉(zhuǎn)位過程中與細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的各種蛋白質(zhì)相互作用。

本研究中，2組大鼠處理前后質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），2組大鼠處理前質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），處理后，2組大鼠質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，但觀察組大鼠質(zhì)量明顯大于對(duì)照組（P<0.05），此結(jié)果表明，加味香砂六君子湯能有效改善胃癌大鼠消化功能，減少大鼠體質(zhì)量的下降。能有效降低胃癌大鼠paxillin、RelA的表達(dá)。You等[15]也在研究得出相似結(jié)論，這有可能與wnt信號(hào)通路的抑制有關(guān)。Cho等[14]也在研究中發(fā)現(xiàn)，加味香砂六君子湯能有效增加大鼠體質(zhì)量，可能與改善大鼠消化功能有關(guān)。

本文證實(shí)了加味香砂六君子湯可以通過抑制Wnt信號(hào)通路影響胃癌大鼠paxillin、RelA的表達(dá)，為胃癌的病理生理學(xué)研究提供了相關(guān)研究證據(jù)。本文也有不足之處，如樣本數(shù)量，若需進(jìn)一步研究加味香砂六君子湯對(duì)胃癌大鼠病理生理的影響，需要更大的樣本量的支持。

參考文獻(xiàn)

[1]孟濤.加味香砂六君子湯用于胃癌化療消化道反應(yīng)緩解中的療效觀察[J].臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)（連續(xù)型電子期刊），2017，4（10）：1941，1943.

[2]徐洋.加味香砂六君子湯治療中晚期胃癌的臨床分析[J].大家健康：中旬版，2016，10（11）：81-81.

[3]張焱，何立人.從濕濁內(nèi)結(jié)、土濕侮木辨治高血壓病[J].上海中醫(yī)藥雜志，2006，40（6）：17-18.

[4]Li Hui，Wang Ziwei，Zhang Wei，et al.VGLL4 inhibits EMT in part through suppressing Wnt/beta-catenin signaling pathway in gastric cancer[J].Medical oncology，2015，32（3）：11-12.

[5]張楊，沈文娟.欣胃顆粒對(duì)胃癌前病變大鼠Wnt信號(hào)通路作用機(jī)制的研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2016，44（4）：18-20.

[6]田俊清.六君子湯加減方治療脾氣虛弱型晚期胃癌的臨床價(jià)值體會(huì)[J].臨床研究，2019，27（8）：11-13.

[7]胡冠鵬.香砂六君子湯合益胃湯在晚期胃癌化療患者中的作用探討[J].黑龍江中醫(yī)藥，2019，48（2）：17-18.

[8]徐建林.參芪苡術(shù)湯聯(lián)合化療治療中晚期胃癌的近期療效評(píng)價(jià)及其機(jī)制研究[D].南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2017.

[9]吳佳慧.化痰消瘀方對(duì)胃癌前病變大鼠PTEN、FAK、paxillin表達(dá)的影響[D].南京：南京醫(yī)科大學(xué)，2016.

[10]岳紅剛，李露霞，袁丹迪.六君子湯對(duì)胃癌術(shù)后恢復(fù)期患者血清 miR-25的調(diào)節(jié)作用[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2019，32（13）：1981-1983.

[11]Guo，Jinbao，F(xiàn)u，Zhongxue，Wei，Jinlai et al.PRRX1 promotes epithelial-mesenchymal transition through the Wnt/beta-catenin pathway in gastric cancer[J].Medical oncology，2015，32（1）：12-13.

[12]戎云霞，朱春寧，顧根網(wǎng).加減香砂六君子湯配合化療治療胃癌的臨床觀察[J].健康之友，2019，30（16）：285.

[13]Zhang，Xiao Tian，Wang，Wei，Zhu，Qiang et al.Treatment of esophageal-gastric double primary cancer by pedunculated remnant gastric interposition，esophageal-gastric anastomosis and gastrojejunal Billroth II anastomosis：A case report[J].Oncology letters，2015，10（2）：891-894.

[14]Cho，Young Sin，Chung，Il-Kwun，Kim，Ji Hyun et al.Risk Factors of Developing Interval Early Gastric Cancer After Negative Endoscopy[J].Digestive Diseases and Sciences，2015，60（4）：936-943.

[15]You，Tiangeng，Gao，Wei，Wei，Jun et al.Overexpression of LIMK1 promotes tumor growth and metastasis in gastric cancer[J].Biomedicine & amp，2015，69（8）：96-101.