劉 潔 米亞靜

(西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部細(xì)胞與遺傳教研室，陜西省西安市 710021，電子郵箱：1181418262@qq.com)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，主要臨床表現(xiàn)為慢性、進(jìn)行性加重的認(rèn)知功能障礙，是老年期癡呆最常見的類型[1]。AD的主要病理變化為細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)異常聚集形成淀粉樣斑塊，神經(jīng)元內(nèi)微管相關(guān)蛋白Tau過度磷酸化形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)，以及神經(jīng)元和突觸變性或丟失[2-3]。目前，AD的病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確，缺乏有效治療手段[4]。研究表明，蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)活性的抑制、海馬組織糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)表達(dá)的增加與微管相關(guān)蛋白Tau的過度磷酸化密切相關(guān)[5]；敲除成對(duì)免疫球蛋白樣受體B蛋白(paired immunoglobulin-like receptor B，PirB)基因或阻斷其表達(dá)，能促進(jìn)脊髓損傷動(dòng)物的神經(jīng)再生，并緩解Aβ對(duì)AD的影響[6]；促進(jìn)低密度脂蛋白相關(guān)受體1(low-density lipoprotein receptor-related protein 1，LRP-1)表達(dá)有助于Aβ經(jīng)血腦屏障外流[7]。尼莫地平是第二代二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，因具有脂溶性高等特點(diǎn)[8]，目前已被廣泛應(yīng)用于治療腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血等腦血管疾病。本研究通過共培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cell,BMEC)與大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte,Ast)建立體外血腦屏障模型，探討不同濃度尼莫地平對(duì)血腦屏障模型的Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)功能、PP2A活性和蛋白表達(dá)以及兔抗鼠晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)、LRP-1、PirB、GSK3β、磷酸化Tau(phosphorylated Tau,p-Tau)蛋白表達(dá)的影響，并分析其作用機(jī)制，以期為臨床上更好地治療和控制AD提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 大鼠Ast、大鼠BMEC、動(dòng)物Ast培養(yǎng)基、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基均購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司(批號(hào)：R1800、R1000、1831、1021)。Aβ1-42多肽購(gòu)自蘇州強(qiáng)耀生物科技有限公司(批號(hào)：04010011827)；尼莫地平注射液購(gòu)自山東新華制藥股份有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字H10950226)；V2460試劑盒購(gòu)自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司(批號(hào)：FS-ELISA-12595，規(guī)格：96T/48T)；二甲基亞砜、LRP-1、RAGE、p-Tau、PP2A、PirB、GSK3β單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：SIGMAD2650、RAB2984、RAB3015、RAB3409、RAB3145、RAB2973、RAB3047)；β-肌動(dòng)蛋白一抗購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司(批號(hào)：20161220)；聚偏二氟乙烯膜購(gòu)上海生工生物工程有限公司(批號(hào)：F619537)；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗購(gòu)自上海生工生物工程有限公司(批號(hào)：D110098)；蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司(批號(hào)：C510003、C503021)；蛋白凝膠成像儀購(gòu)自Bio-Rad公司(型號(hào)：Gel Doc XR+)；Transwell裝置(孔徑3.0 μm)購(gòu)自北京萌壯科技有限公司(批號(hào)：3415)；Aβ1-42多肽酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒、熒光素-葡聚糖4000(fluorescein-dextran 4000，F(xiàn)D4)及六氟異丙醇均購(gòu)自Sigma公司(批號(hào)：RAB1864、RAB1832、RAB1609)；三氣培養(yǎng)箱購(gòu)自北京美華儀科技有限公司(型號(hào)：MHY-29976)；Millicell-ERS電阻儀購(gòu)自北京明陽(yáng)科華生物科技有限公司(型號(hào)：MERS00002)；熒光分光光度計(jì)購(gòu)自天津良益科技有限公司(型號(hào)：LYF-300)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外血腦屏障模型的建立：參照文獻(xiàn)[9]利用Transwell裝置共培養(yǎng)Ast和BMEC，建立體外血腦屏障模型。將Ast調(diào)整為3×104個(gè)/cm2后種植在滌綸膜下層，便于細(xì)胞終足充分形成，2 d后將BMEC調(diào)整為4×104個(gè)/cm2后種植在滌綸膜上層。BMEC側(cè)為血管側(cè)，Ast側(cè)為腦側(cè)。使用顯微鏡觀察到細(xì)胞融合后，用Millicell-ERS電阻儀測(cè)定跨膜電阻，當(dāng)跨膜電阻達(dá)到(300±13.6)Ω/cm2時(shí)，提示體外血腦屏障模型建立成功。

1.2.2 Aβ1-42工作液的制備：參照文獻(xiàn)[10]制備Aβ1-42工作液。將1 mg Aβ1-42多肽溶于1 mL六氟異丙醇溶液中，充分溶解后，化學(xué)通風(fēng)櫥內(nèi)自然風(fēng)干。將風(fēng)干物在100%二甲基亞砜中重懸配成1 mmol/L儲(chǔ)存液，于-80℃冰箱中儲(chǔ)存，臨用前用動(dòng)物Ast培養(yǎng)基稀釋成工作液，終濃度為2 μmol/L。

1.2.3 藥物處理：利用上述已建好的體外血腦屏障模型，Ast組(設(shè)為對(duì)照組)用動(dòng)物Ast培養(yǎng)基于37℃、5% CO2下培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞備用；低、中、高濃度尼莫地平+Ast組分別加入含終濃度為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L的尼莫地平動(dòng)物Ast培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h，更換新鮮動(dòng)物Ast培養(yǎng)基繼續(xù)于37℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h，收集各組Ast備用。

1.2.4 跨膜電阻及FD4通透性的檢測(cè)：(1)各組細(xì)胞按1.2.3處理后24 h，加入新鮮的動(dòng)物Ast培養(yǎng)基。用Millicell-ERS電阻儀測(cè)定跨膜電阻值，減去無細(xì)胞的共培養(yǎng)池滌綸膜的跨膜電阻值，即得出細(xì)胞層跨膜電阻值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。(2)各組細(xì)胞按1.2.3處理后，將含終濃度為10 μmol/L FD4的動(dòng)物Ast培養(yǎng)基置于腦側(cè)作用60 min，收集血管側(cè)培養(yǎng)基，置于熒光分光光度計(jì)專用96孔板，于激發(fā)波長(zhǎng)480 nm、發(fā)射波長(zhǎng)520 nm處測(cè)量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算FD4濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.5 Aβ跨血腦屏障模型轉(zhuǎn)運(yùn)率的測(cè)定：取1.2.3各組細(xì)胞，腦側(cè)添加含2 μmol/L Aβ1-42多肽的Ast培養(yǎng)基，血管側(cè)添加普通培養(yǎng)基。37℃、5% CO2下培養(yǎng)60 min后，取50 μL血管側(cè)培養(yǎng)基，采用Aβ1-42多肽酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒檢測(cè)血管側(cè)培養(yǎng)基中Aβ1-42多肽含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.6 PP2A活性的檢測(cè)：取1.2.3各組細(xì)胞，采用V2460試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中PP2A活性，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.7 Ast細(xì)胞RAGE、LRP-1、PirB、PP2A、GSK3β、p-Tau蛋白表達(dá)的檢測(cè)：按照蛋白提取試劑盒說明書提取1.2.3各組Ast細(xì)胞中的總蛋白，采用二喹啉甲酸蛋白試劑盒測(cè)定各組Ast細(xì)胞總蛋白含量。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜上，添加LRP-1、RAGE、p-Tau、PP2A、PirB、GSK3β、β肌動(dòng)蛋白一抗(1 ∶500)，4℃冰箱孵育過夜。磷酸緩沖液洗滌后添加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000)，常溫下孵育2 h。采用Tanon 600圖像分析系統(tǒng)對(duì)LRP-1、RAGE、P-Tau、PP2A、PirB、GSK3β蛋白水平進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 尼莫地平對(duì)血腦屏障模型完整性的影響 4組的跨膜電阻和FD4通透性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 4組血腦屏障模型完整性相關(guān)指標(biāo)比較(x±s)

2.2 尼莫地平對(duì)Aβ跨血腦屏障模型外向轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 Ast組、低濃度尼莫地平+Ast組、中濃度尼莫地平+Ast組、高濃度尼莫地平+Ast組Aβ跨血腦屏障模型外向轉(zhuǎn)運(yùn)依次增多(均P<0.05)。見表2。

表2 4組Aβ跨血腦屏障模型外向轉(zhuǎn)運(yùn)情況比較(x±s，pg/mg)

2.3 尼莫地平對(duì)Ast細(xì)胞中PP2A活性的影響 Ast組、低濃度尼莫地平+Ast組、中濃度尼莫地平+Ast組、高濃度尼莫地平+Ast組Ast細(xì)胞中PP2A活性依次升高(均P<0.05)。見表3。

表3 4組Ast的PP2A活性比較[x±s，pmol/(g·min)]

2.4 尼莫地平對(duì)Ast細(xì)胞中LRP-1、RAGE、p-Tau、PP2A、PirB、GSK3β蛋白表達(dá)的影響 Ast組、低濃度尼莫地平+Ast組、中濃度尼莫地平+Ast組、高濃度尼莫地平+Ast組Ast中的LRP-1、PP2A蛋白相對(duì)表達(dá)水平依次升高，RAGE、p-Tau、PirB、GSK3β蛋白相對(duì)表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)。見表4、圖1。

表4 4組Ast中LRP-1、RAGE、p-Tau、PP2A、PirB、GSK3β蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

圖1 4組Ast中LRP-1、RAGE、p-Tau、PP2A、PirB、GSK3β蛋白表達(dá)情況

3 討 論

AD是臨床常見的退行性疾病，發(fā)病與年齡密切相關(guān)，發(fā)病人群以60歲以上老人為主[7]。隨著我國(guó)人口老齡化進(jìn)程加速，AD發(fā)病率逐年升高，65歲以上人群AD發(fā)生率為13%，85歲以上人群AD發(fā)病率則高達(dá)45%，預(yù)計(jì)到2050年世界范圍內(nèi)將有超過8 000萬人遭受AD困擾[11]，這給社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。Aβ是由39～42個(gè)氨基酸構(gòu)成的短肽，為淀粉樣前體蛋白的水解產(chǎn)物，其是AD發(fā)病的主要影響因素[12]，但具體的作用機(jī)理尚未完全闡明。本研究結(jié)果顯示，Ast組、低濃度尼莫地平+Ast組、中濃度尼莫地平+Ast組、高濃度尼莫地平+Ast組Aβ跨血腦屏障模型外向轉(zhuǎn)運(yùn)依次增多(均P<0.05)，呈劑量依賴性，另外4組的跨膜電阻、FD4通透性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，即各濃度尼莫地平均不影響血腦屏障模型的完整性，因此血管側(cè)Aβ1-42多肽含量增多并非因血腦屏障破壞導(dǎo)致Aβ漏出所致，這提示尼莫地平在一定程度可促進(jìn)Aβ外向轉(zhuǎn)運(yùn)，減少Aβ在腦內(nèi)的沉積。

研究顯示，在AD早期Ast被持續(xù)、廣泛激活[13]。激活的Ast可結(jié)合、攝取并降解胞外Aβ，從而減少Aβ在細(xì)胞外的沉積[14]。大腦中存在多種受體可介導(dǎo)Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)，其中RAGE作為一種多配體受體，可與Aβ結(jié)合，促使Aβ穿過血腦屏障進(jìn)入大腦并積聚；LRP-1作為清道夫受體，可幫助Aβ經(jīng)血腦屏障外流，在Aβ清除過程中發(fā)揮重要作用[7]。RAGE、LRP-1作為一對(duì)重要的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體，在維持腦Aβ平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用：LRP-1水平升高、RAGE水平降低會(huì)促進(jìn)Ast中Aβ外向轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制Aβ內(nèi)向轉(zhuǎn)運(yùn)，可促進(jìn)AD發(fā)病[15]。但具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，Ast組、低濃度尼莫地平+Ast組、中濃度尼莫地平+Ast組、高濃度尼莫地平+Ast組Ast中LRP-1蛋白表達(dá)依次升高，RAGE蛋白表達(dá)依次降低(均P<0.05)。這提示尼莫地平可劑量依賴性地上調(diào)星型膠質(zhì)細(xì)胞中LRP-1蛋白表達(dá)，下調(diào)RAGE蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)Aβ跨血腦屏障模型的外向轉(zhuǎn)運(yùn)，減少Aβ在Ast內(nèi)的沉積，表明尼莫地平可能對(duì)AD患者具有一定的治療作用。

AD的主要病理特征包括細(xì)胞外Aβ沉積形成神經(jīng)炎性斑，以及細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白磷酸化、聚集形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)[16]。研究表明，腦內(nèi)Aβ沉積可增加Tau蛋白過度磷酸化，引起腦內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)大量形成，進(jìn)而引發(fā)AD[17]。GSK-3β、PP2A是與AD發(fā)病密切相關(guān)的兩種蛋白磷酸酶[18]，降低PP2A蛋白表達(dá)，可增加GSK3β活性[19]，進(jìn)而加劇Aβ在胞內(nèi)沉積[20]。研究顯示，逍遙散可上調(diào)PP2A蛋白表達(dá)、下調(diào)GSK-3β蛋白表達(dá)，抑制可溶性Aβ前體蛋白在神經(jīng)元內(nèi)的沉積[17]，阻止AD進(jìn)程。PirB是一種免疫球蛋白樣受體，可通過與Aβ結(jié)合，減少胞漿PP2A蛋白表達(dá)，激活GSK3β，進(jìn)而增加Aβ在胞內(nèi)的沉積[21]。本研究結(jié)果顯示，Ast組、低濃度尼莫地平+Ast組、中濃度尼莫地平+Ast組、高濃度尼莫地平+Ast組Ast中PP2A活性及其蛋白表達(dá)依次升高，p-Tau、PirB、GSK3β蛋白表達(dá)依次降低(P<0.05)，提示尼莫地平可上調(diào)Ast中PP2A蛋白表達(dá)并促進(jìn)其活化，同時(shí)下調(diào)p-Tau、GSK3β、PirB蛋白表達(dá)，從而抑制Aβ在Ast內(nèi)的沉積，抑制Tau蛋白過度磷酸化，推測(cè)尼莫地平可能是通過減少神經(jīng)炎性斑及神經(jīng)元纖維纏結(jié)的形成，阻礙AD進(jìn)展。

綜上所述，尼莫地平可提高Ast中Aβ的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，減少Tau蛋白磷酸化，其機(jī)制可能與其下調(diào)RAGE、PirB、GSK3β表達(dá)，促進(jìn)PP2A、LRP-1蛋白表達(dá)有關(guān)。