羅 浩 吳志洪 鐘 江 張 衍 馮 杲

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，南寧市 530023，電子郵箱:luohao1943@163.com)

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis,AD)和銀屑病是最常見的兩種慢性炎癥性皮膚病，雖然兩者都是公認(rèn)的遺傳和免疫介導(dǎo)的皮膚病，但是導(dǎo)致皮膚炎癥的確切機(jī)制尚未完全清楚。目前，高通量測序是研究疾病基因遺傳學(xué)機(jī)制的熱點(diǎn)之一?；诟咄科脚_的RNA測序允許同時比較數(shù)千個信使RNA，而在轉(zhuǎn)錄水平上微小RNA(microRNA,miRNA)可以靶向調(diào)控大量信使RNA，通過這種方式識別組織炎癥反應(yīng)的疾病特異性模式。Nomura等[1]對上述兩種皮膚病皮損組織中12 000個基因進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因在AD及銀屑病中的表達(dá)相似；其中編碼CC亞家族趨化因子的一組基因在AD中的表達(dá)明顯增加，而編碼CXC亞家族趨化因子的一組基因在銀屑病皮損中的表達(dá)明顯增加，而兩者分別趨化輔助性T細(xì)胞(helper T cell,Th)1和Th2，浸潤炎癥細(xì)胞的差異性解釋了AD與銀屑病炎癥反應(yīng)類型的不同。然而目前還沒有研究針對這兩種炎癥性皮膚病的復(fù)雜基因表達(dá)進(jìn)行miRNA差異性分析。本研究采用高通量測序?qū)D和銀屑病之間差異性表達(dá)的miRNA進(jìn)行篩選，然后分析差異miRNA靶基因涉及的生物過程和信號通路，從而了解miRNA在這兩種炎癥性皮膚病中的作用機(jī)制，為這兩種常見皮膚病的診斷和治療提供新的方向。

1 資料和方法

1.1 高通量測序標(biāo)本來源 選取2017年9月至2018年9月在我院皮膚科確診的8例AD患者(AD組)和8例銀屑病患者(銀屑病組)為研究對象，其中AD患者符合Williams診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，銀屑病組患者符合尋常型銀屑病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。納入標(biāo)準(zhǔn)：2個月內(nèi)未使用抗組胺藥物、類固醇皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)劑等藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心、腦、肺、腎臟器疾病及高血壓等疾患。其中AD組男性4例、女性4例，年齡(26.5±10.6)歲；銀屑病組男性5例、女性3例，年齡(32.2±8.4)歲。兩組患者的性別構(gòu)成、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者及家屬了解研究詳情并簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 RNA保護(hù)液(ABI公司，批號:N8080119)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司，批號:15596-026)，Illumina TruSeq Small RNA Preparation試劑盒(Illumina公司，批號：RS-200-0036)，RNA連接酶(Thermo公司，批號：EL0021)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司，批號：K1691)，RNA酶(Thermo公司，批號：EN0601)，QuantiNova SYBR Green PCR Kit(500)試劑盒(QIAGEN公司，批號：208054)；熒光定量PCR儀(ABI公司，型號：7500)；分光光度計(Thermo公司，型號：BioMate160)。

1.3 高通量測序方法

1.3.1 標(biāo)本獲?。浩つw活檢前均停用局部類固醇皮質(zhì)激素或鈣調(diào)磷酸酶抑制劑2周以上。選取患者四肢典型皮損，常規(guī)消毒皮膚后，行病理活檢時留取直徑3～4 mm組織，放入凍存管中，加入RNA保護(hù)液，液氮速凍后放入-80℃保存。

1.3.2 總RNA提?。喝龃娴臉?biāo)本進(jìn)行瞬時離心后，TRIzol一步法提取組織中總RNA，用分光光度計分析RNA濃度及純度，瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。

1.3.3 文庫的構(gòu)建與測序：利用Illumina TruSeq Small RNA Preparation試劑盒構(gòu)建Illumina文庫。(1)在 RNA連接酶(RNA與連接酶比例約為4 ∶1)的作用下加上3′端和5′端的堿基序列。(2)使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA樣本反轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入RNA酶去除未反轉(zhuǎn)錄為cDNA的RNA，反應(yīng)條件為37℃逆轉(zhuǎn)錄15 min，98℃ 5 min，使酶失活后置于冰上。(3)使用QuantiNova SYBR Green PCR Kit(500)試劑盒行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系10 μL，包括2×濃縮的實(shí)時定量PCR預(yù)混液5 μL，引物A 0.5 μL，引物B 0.5 μL，熒光染料0.05 μL，模板cDNA 1 μL，無酶水2.95 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min，95℃變性2 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。(4)采用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測miRNA的文庫質(zhì)量。用Illumina HiSeq 2500測序平臺對該文庫進(jìn)行高通量測序。

1.3.4 測序數(shù)據(jù)分析和處理：篩選所有的原始測序序列，去除測序接頭、低質(zhì)量的堿基(堿基含2個以上的錯配，單個堿基重復(fù)超過6個)和高通量測序讀數(shù)(reads)，保留修剪后長度大于17nt的reads。使用FANSe3超高精度序列比對算法，將各樣本測序得到的reads與人類基因組參考序列進(jìn)行比對，篩選出已知miRNA序列并分類注釋，根據(jù)RPKM值(每百萬reads中來自某一基因每千堿基長度的reads數(shù))來估算基因表達(dá)豐度；同時采用edgeR軟件包進(jìn)行差異基因分析，篩選差異miRNA時需從差異倍數(shù)(fold change,FC)和顯著水平P值兩個方面進(jìn)行評估，本次分析中差異基因的篩選閾值設(shè)定為:|log2(FC)|>1且P<0.01。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證

1.4.1 標(biāo)本來源：另外選取同期于我院皮膚科就診的AD、銀屑病患者各3例，排除和納入標(biāo)準(zhǔn)同1.1。AD組男性1例、女性2例，年齡(31.1±11.8)歲；銀屑病組男性2例、女性1例，年齡(35.8±10.4)歲。選取在我院激光美容科切除的3份無病理改變皮膚組織作為正常對照組，分別來源于1例男性、2例女性，年齡(36.0±12.3)歲。3組研究對象的性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。所有研究對象及家屬均了解研究詳情并簽署了知情同意書。

1.4.2 引物設(shè)計： 為驗(yàn)證高通量測序的結(jié)果，選取上、下調(diào)表達(dá)差異顯著的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)中檢索核苷酸序列，并用Primer 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計保守區(qū)域的特異性上、下游引物，見表1。

表1 實(shí)時熒光定量PCR引物基因序列

1.4.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測：采用TRIzol法提取組織的總RNA后，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，均按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。使用QuantiNova SYBR Green PCR Kit(500)試劑盒行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系10 μL，包括2×濃縮的實(shí)時定量PCR擴(kuò)增的預(yù)混液5 μL，引物A 0.5 μL，引物B 0.5 μL，熒光染料0.05 μL，模板cDNA 1 μL，無酶水2.95 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min，95℃變性2 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。根據(jù)所得的Ct值，以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算AD皮損組織miRNA相對于銀屑病皮損組織miRNA的相對表達(dá)量。

1.5 生物信息學(xué)分析 應(yīng)用 Human TargetScan(http://www.targetscan.org/) 、miRanda(http://www.miranda.org/)、miRBase(http://www.mirbase.org/)等軟件對差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測。對獲得的靶基因取交集后，采用分析軟件topGO(version 2.18.0)對所有靶基因進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析，包括分子功能、生物過程、細(xì)胞組分3個方面。采用KOBAS軟件進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。以校正后P<0.05為顯著性閾值得出GO高頻率注釋及基因集合富集的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)miRNA的篩查結(jié)果 共篩選出204個差異表達(dá)的miRNA，其中168個表達(dá)上調(diào)，36個表達(dá)下調(diào)，見圖1。顯著上調(diào)的基因有hsa-miRNA-133a-3p、hsa-miRNA-1-3p、hsa-miRNA-206、hsa-miRNA-133b、hsa-miRNA-133a-5p等，顯著下調(diào)的基因有hsa-miRNA-122-5p、hsa-miRNA-199b-3p、hsa-miRNA-196a-5p等，見表2。

圖1 兩組樣本差異表達(dá)miRNA火山圖

表2 log2(FC)較大的miRNA

2.2 實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果 根據(jù)測序結(jié)果，選取上調(diào)、下調(diào)差異顯著的hsa-miRNA-133a-3p、hsa-miRNA-199b-3p進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果歸一化后提示，AD中hsa-miRNA-133a-3p相對表達(dá)量為(6.02±2.36)，與銀屑病相比上調(diào)約5倍，hsa-miRNA-199b-3p相對表達(dá)量為(1.81±0.73)，與銀屑病相比下調(diào)約2倍，與測序結(jié)果大致相符。

2.3 生物學(xué)分析結(jié)果 針對上下調(diào)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，取交集后進(jìn)行GO功能分析。 結(jié)果顯示GO分析中預(yù)測的靶基因主要位于細(xì)胞器、細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)等部位；分子功能主要富集在蛋白結(jié)合、離子結(jié)合、核酸結(jié)合、有機(jī)環(huán)狀化合物結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性及催化活性等；生物學(xué)功能主要富集于生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞代謝、有機(jī)物代謝、大分子的代謝及氮化合物代謝過程等。分別根據(jù)分子功能、生物功能、細(xì)胞組成3個部分的顯著性差異基因個數(shù)分布情況，選取富集度最高的10條進(jìn)行展示(見表3)。在GO注釋分類的基礎(chǔ)上進(jìn)行KEGG信號通路富集，結(jié)果顯示差異基因主要涉及代謝途徑、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號通路、EB病毒感染、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路、黏著斑、人類嗜T細(xì)胞病毒Ⅰ型(human T-lymphotropic virus Ⅰ,HTLV-Ⅰ)感染、癌癥通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)及軸突導(dǎo)向等，部分結(jié)果見表4。采用散點(diǎn)圖對KEGG富集部分分析結(jié)果進(jìn)行圖形化展示，P值最小的20條通路條目見圖2。

表3 差異表達(dá)miRNA預(yù)測靶基因的GO聚類分析

表4 差異基因KEGG代謝通路分析

圖2 KEGG通路富集圖

3 討 論

miRNA是一類單鏈非編碼RNA，通過與其靶基因mRNA分子的3′端非編碼區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，可以對基因組中的大部分基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[4]。既往有研究對AD和銀屑病兩種皮膚病皮損組織中miRNA的表達(dá)進(jìn)行分析[5-6]，然而目前尚無研究針對這兩種炎癥性皮膚病的復(fù)雜基因表達(dá)進(jìn)行miRNA差異性對比分析。本研究采用高通量測序技術(shù)對AD和銀屑病的miRNA進(jìn)行分析篩選，比較兩者的基因表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)與銀屑病相比，AD有204個miRNA表達(dá)差異，包括168個表達(dá)上調(diào)的miRNA(hsa-miRNA-133a-3p、hsa-miRNA-1-3p、hsa-miRNA-206、hsa-miRNA-133b、hsa-miRNA-133a-5p等)和36個表達(dá)下調(diào)的miRNA(hsa-miRNA-122-5p、hsa-miRNA-199b-3p、hsa-miRNA-196a-5p等)，進(jìn)一步比較hsa-miRNA-133a-3p、hsa-miRNA-199b-3p的驗(yàn)證結(jié)果與檢測結(jié)果， 發(fā)現(xiàn)這兩個基因的驗(yàn)證結(jié)果與檢測結(jié)果具有較好的一致性，說明測序數(shù)據(jù)的可靠性。通過生物信息學(xué)篩選差異表達(dá)miRNA的靶基因并取交集后，進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，AD與銀屑病相比，差異靶基因多富集在蛋白結(jié)合、離子結(jié)合、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞代謝等分子功能和生物功能上，多涉及代謝途徑、PI3K/Akt信號通路、EB病毒感染及MAPK信號通路等。

miRNA-133是細(xì)胞發(fā)育、增殖及心臟病和癌癥發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子。miRNA-133在絕大部分腫瘤如胃癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌中表達(dá)下調(diào)[7-8]，miRNA-133不僅能夠使細(xì)胞周期停滯在G2-M期，還可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[9]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miRNA-133a通過靶向調(diào)控Akt和MAPK通路，抑制結(jié)直腸癌及乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[10-11]。miRNA-133還能通過靶基因白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶負(fù)向調(diào)控Toll樣受體信號通路，導(dǎo)致核因子κB轉(zhuǎn)錄激活，最終參與對炎癥反應(yīng)的控制[12]。在頭頸部鱗癌和膀胱癌細(xì)胞系中，miRNA-133直接調(diào)控谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶P1，而該酶通過與Toll樣受體級聯(lián)反應(yīng)中的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2同源分子相互作用，參與腫瘤壞死因子-α觸發(fā)的信號激活[13]。CXC趨化因子受體4已被證實(shí)為人類miRNA-133的靶標(biāo)，其通過控制G蛋白信號傳導(dǎo)和PI3K/Akt信號傳導(dǎo)途徑與促炎反應(yīng)相關(guān)[14]。以上研究均表明miRNA-133與PI3K/Akt信號通路、Toll樣受體信號通路之間存在聯(lián)系。既往已有研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活參與銀屑病的發(fā)病過程[15-16]。而PI3K/Akt通路激活后促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖,抑制分化，并增加抗凋亡的核因子κB信號，不僅可以抵抗銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的死亡[17]，還可以促進(jìn)細(xì)胞因子表達(dá)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[18]。

miRNA-1、miRNA-133a/b和miRNA-206在鼻黏膜中廣泛表達(dá)，其中循環(huán)中的miRNA-206和miRNA-133b表達(dá)水平被認(rèn)為是過敏和哮喘狀態(tài)的生物標(biāo)志物[19]。而CD4+T淋巴細(xì)胞中miRNA-133b和miRNA-206的共表達(dá)被認(rèn)為對Th17細(xì)胞具有特異性,而作為Th17型免疫反應(yīng)的新型生物標(biāo)志物[20]。在肺部疾病中，miRNA-1受到血管內(nèi)皮生長因子抑制后導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞Th2型炎癥反應(yīng)激活，促進(jìn)活化T細(xì)胞的募集、嗜酸性炎癥及Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生[21]。Th2型細(xì)胞因子白細(xì)胞介素13能夠通過PI3K/Akt3與蛋白激酶C-d信號通路，平衡調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶13的表達(dá)，從而參與組織重塑，減少膠原降解而誘導(dǎo)AD真皮增厚[22]。其他miRNA如miRNA-206、miRNA-125b、miRNA-29和miRNA-196a等也能通過調(diào)控膠原蛋白、整合素及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，在皮膚纖維化的發(fā)展中發(fā)揮作用[23-24]。

miRNA-199家族包括miRNA-199a和miRNA-199b，兩者在結(jié)構(gòu)上只相差幾個堿基，呈高度同源。miRNA-199是在癌癥中研究較多的一種miRNA，其已經(jīng)被證明參與各種類型癌癥的發(fā)生發(fā)展，包括髓母細(xì)胞瘤、絨毛膜癌、慢性髓細(xì)胞白血病、結(jié)直腸癌及腎細(xì)胞癌等[25-27]。然而，目前關(guān)于miRNA-199在皮膚疾病中的作用研究仍較少。Sonkoly等[28]采用微陣列技術(shù)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)AD皮損中miRNA-199b表達(dá)下調(diào)。楊志波等[15]的研究表明，miRNA-199a能夠抑制銀屑病患者皮損中低氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)，而低氧誘導(dǎo)因子能影響丙酮酸氫化酶的活性，從而導(dǎo)致糖代謝紊亂以及蛋白降解途徑中斷,進(jìn)而影響血管增生及表皮細(xì)胞的增殖，從而參與銀屑病的發(fā)病機(jī)制。此外，miRNA-199還監(jiān)管脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后基因的調(diào)節(jié)，在脂質(zhì)代謝中具有重要作用。已有研究表明，高脂飲食可導(dǎo)致小鼠脂肪組織中miRNA-199a-3p表達(dá)降低，miRNA-199a-3p通過直接靶向硬脂酰輔酶a去飽和酶的3′-未翻譯區(qū)來調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化[18]。Gao等[29]也發(fā)現(xiàn)miRNA-199通過調(diào)節(jié)帕霉素激酶調(diào)控褐色脂肪的生成和產(chǎn)熱能力，在抗肥胖及代謝紊亂性疾病中發(fā)揮作用。而miRNA-122與膽固醇穩(wěn)態(tài)、脂肪酸代謝和脂肪生成也密切相關(guān)，研究結(jié)果顯示，高脂肪喂養(yǎng)的小鼠體內(nèi)沉默miRNA-122后脂肪酸合成與氧化的相關(guān)基因(如脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A羧化酶1、乙酰輔酶A羧化酶2)發(fā)生了改變，肝脂肪變性減少[30-31]。由此可見，miRNA-199、miRNA-122等miRNA分子與脂質(zhì)代謝通路之間密切相關(guān)。而有學(xué)者通過微陣列技術(shù)篩選出179個差異基因進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因與銀屑病的關(guān)系最為密切[32]。

本研究獲得的AD與銀屑病之間差異表達(dá)的miRNA，如miRNA-203、miRNA-146a、miRNA-21和miRNA-125b等，都不是AD和銀屑病中關(guān)注度較高的miRNA，大多數(shù)是在腫瘤、脂質(zhì)代謝、炎癥方面發(fā)揮作用；并且在AD和銀屑病中出現(xiàn)上、下調(diào)控差異的miRNA的靶基因涉及細(xì)胞功能和信號通路有相同也有差異。這或?yàn)榉治鲞@兩種炎癥性皮膚病基因?qū)W差異，以及尋找有利于診斷和治療的新基因靶點(diǎn)提供新的方向和基礎(chǔ)。