魏旭靜,李林,張紅真,王景,徐靜

（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院產(chǎn)科，河北 石家莊 050000）

子宮內(nèi)膜癌是女性常見的惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，探討其發(fā)生發(fā)展機(jī)制對其診治及改善其預(yù)后具有重要價(jià)值。近年來，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移及其分子機(jī)制方面的研究取得了巨大進(jìn)步，長鏈非編碼核糖核酸（long non coding RNA，LncRNA）在胚胎發(fā)育、基因表達(dá)和腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用，多種LncRNA 參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過程［1］。近年來研究［2］發(fā)現(xiàn)：LncRNA CCAT1 在多種惡性腫瘤的增殖和侵襲遷移過程中發(fā)揮重要作用，在子宮內(nèi)膜癌中的作用也受到研究者關(guān)注，YU 等［3］研究發(fā)現(xiàn)：LncRNA CCAT1 可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和遷移。但其通過何種信號(hào)通路在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用尚不清楚。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad 信號(hào)通路參與子宮內(nèi)膜癌的增殖及侵襲遷移過程，SAHOO 等［4］研究顯示：抑制細(xì)胞外基質(zhì)介導(dǎo)的TGF-β 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可抑制子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)通過觀察沉默CCAT1 對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移及TGF-β/Smad 信號(hào)通路的影響，探討其在子宮內(nèi)膜癌中的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人子宮內(nèi)膜癌Ishiwaka 細(xì)胞株和正常人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞THESC（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；Lipofectamine 2000 試劑盒（美國Invitrogen 公司），CCAT1 模擬物siRNA（CCAT1-siRNA）和陰性對照模擬物siRNA（廣州博銳生物科技公司），ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒、Trizol 試劑、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒、LY364947（TGF-β/Smad 抑制劑）和結(jié)晶紫（美國Sigma 公司），CCK8 試劑、胰蛋白酶和DMEM 培養(yǎng)基（美國BPB 公司），兔抗人增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、鋅指轉(zhuǎn)錄因子（snail）、凋亡抑制蛋白（Twist）、白細(xì)胞抑制因子2/3（Smad2/3）、磷酸化Smad 2/3（p-Smad2/3）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）和兔抗人TGF-β1 單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司）；Multiskan?FC 酶標(biāo)儀、Applied Biosystems PCR 儀和NERL?流式細(xì)胞儀（美國賽默飛世爾科技公司），Transwell 小室（美國TaKaRa 公司）等。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)Ishiwaka 細(xì)胞和T-HESC 細(xì)胞置于DMEM（含雙抗和10%胎牛血清）培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后每2 d 換液1 次，細(xì)胞生長至達(dá)80%以上融合時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）法檢測Ishiwaka 細(xì)胞和T-HESC 細(xì)胞中CCAT1 mRNA 表達(dá)水平取Ishiwaka 和T-HESC 細(xì)胞，加入Trizol裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR 法檢測細(xì)胞中CCAT1 mRNA 表達(dá)水平；CCAT1上游引物：5'-CCATTCCATTCATTTCTCTTTCCTA-3'，下游引物：5'-GGCGTAGGCGATTGGGGATCG-3'。PCR 反應(yīng)條件：95℃、30 s；95℃、5 s，58℃、30 s，72℃、30 s，共42 個(gè)循環(huán)。以U6 為內(nèi)參照。每組設(shè)7 個(gè)復(fù)孔。以2－ΔΔCt法計(jì)算細(xì)胞中CCAT1 mRNA 表達(dá)水平。

1.4 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期的Ishiwaka細(xì)胞分為空白對照組、陰性對照組、CCAT1-siRNA 組和CCAT1-siRNA+LY364947 組，將各組對數(shù)生長期的Ishiwaka 細(xì)胞接種到6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)90%以上融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，陰性對照組轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA，CCAT1-siRNA 組轉(zhuǎn)染CCAT1-siRNA，CCAT1-siRNA+LY364947 組轉(zhuǎn)染 CCAT1-siRNA 同時(shí)加入LY364947（3 μL）［5］，空白對照組不轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格參照Lipofectamine 2000 試劑盒說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24 h 后采用RT-PCR 法檢測細(xì)胞中CCAT1 mRNA 表達(dá)水平，方法同“1.2”。

1.5 CCK8 法檢測Ishiwaka 細(xì)胞增殖能力取各組生長良好的Ishiwaka 細(xì)胞接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24、48 和72 h 時(shí)每孔分別加入10 μL 的CCK8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，每組設(shè)7 個(gè)復(fù)孔。酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處各孔吸光度（A）值，以A 值表示細(xì)胞增殖能力。

1.6 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測各組侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)取各組生長狀態(tài)良好的Ishiwaka 細(xì)胞用雙無培養(yǎng)基懸浮，將含血清的正常培養(yǎng)基加入24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入Transwell 小室，調(diào)整各組細(xì)胞個(gè)數(shù)，使200 μL 培養(yǎng)液中含5×104個(gè)細(xì)胞，將各組細(xì)胞放入Transwell 小室培養(yǎng)24 h，然后取出小室，甲醇固定30 min，棉簽擦去內(nèi)室細(xì)胞，用 結(jié)晶紫染色30 min，纖維鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)前用基質(zhì)膠包被小室，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.7 Western blotting 法檢測Ishiwaka 細(xì)胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail、Twist、Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達(dá)水平取各組轉(zhuǎn)染24 h 細(xì)胞加入蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測細(xì)胞蛋白濃度。取100 μg 蛋白電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、5% 脫脂奶粉封閉，加入一抗： 兔抗人PCNA、E-cadherin、vimentin、snail、Twist、Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 單克隆抗體，稀釋比例1：200，過夜孵育。加入二抗（1：5 000）孵育2 h，以β-actin 為內(nèi)參，化學(xué)發(fā)光法顯色，每組設(shè)7 個(gè)復(fù)孔，凝膠電泳成像儀采集圖像，Quantity One 軟件分析條帶灰度值。目標(biāo)蛋白表達(dá)水平=目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同細(xì)胞中CCAT1 mRNA 表達(dá)水平、各組細(xì)胞增殖能力、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail、Twist、Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達(dá)水平經(jīng)檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同細(xì)胞中 CCAT1mRNA 表達(dá)水平Ishiwaka 細(xì)胞中CCAT1 mRNA 表達(dá)水平（1.94±0.17）明顯高于T-HESC 細(xì)胞（1.00±0.09）（t=12.929，P＜0.01）。

2.2 各組Ishiwaka 細(xì)胞中CCAT1 mRNA 表達(dá)水平與空白對照組（1.00±0.08）和陰性對照組（0.99±0.10）比較，CCAT1-siRNA 組和CCAT1-siRNA+LY364947 組Ishiwaka 細(xì)胞中CCAT1 mRNA 表達(dá)水平（0.52±0.06 和0.49±0.07）明顯降低（P＜0.01），空白對照組與陰性對照組及CCAT1-siRNA 組與CCAT1-siRNA +LY364947 組Ishiwaka 細(xì)胞中CCAT1 表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 各組Ishiwaka 細(xì)胞增殖能力培養(yǎng)24 h，各組Ishiwaka 細(xì)胞增殖能力比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；培養(yǎng)48 和72 h，與空白對照組和陰性對照組比較，CCAT1-siRNA組和CCAT1-siRNA+LY364947 組Ishiwaka 細(xì)胞增殖能力明顯降低（P＜0.05），與 CCAT1-siRNA 組比較，CCAT1-siRNA+LY364947 組Ishiwaka 細(xì)胞增殖能力明顯降低（P＜0.05），空白對照組與陰性對照組Ishiwaka 細(xì)胞比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組Ishiwaka 細(xì)胞增殖能力Tab.1 Proliferation rates of Ishiwaka cells in various groups(n＝7，)

表1 各組Ishiwaka 細(xì)胞增殖能力Tab.1 Proliferation rates of Ishiwaka cells in various groups(n＝7，)

*P＜0.05 compared with blank control group；△P＜0.05 compared with negative control group；#P＜0.05 compared with CCAT1-siRNA group.

2.4 各組Ishiwaka 細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)與空白對照組和陰性對照組比較，CCAT1-siRNA 組和 CCAT1-siRNA+LY364947 組Ishiwaka 細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)明顯降低（P＜0.05）；與CCAT1-siRNA 組比較，CCAT1-siRNA+LY364947 組Ishiwaka 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)明顯降低（P＜0.05），空白對照組與陰性對照組Ishiwaka 細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2、圖1和圖2。

表2 各組Ishiwaka 細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)Tab.2 Number of invasion and migration cells in Ishiwaka cells in various groups(n＝7，)

表2 各組Ishiwaka 細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)Tab.2 Number of invasion and migration cells in Ishiwaka cells in various groups(n＝7，)

*P＜0.05 compared with blank control group；△P＜0.05 compared with negative control group；#P＜0.05 compared with CCAT1-siRNA group.

2.5 各組Ishiwaka 細(xì)胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail 和Twist 蛋白表達(dá)水平與空白對照組和陰性對照組比較，CCAT1-siRNA 組和CCAT1-siRNA+LY364947 組Ishiwaka 細(xì)胞中PCNA、vimentin、snail 和Twist 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與CCAT1-siRNA 組比較，CCAT1-siRNA+LY364947 組 Ishiwaka 細(xì)胞E-cadherin 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），其他蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05），但空白對照組與陰性對照組Ishiwaka 細(xì)胞中上述蛋白表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3和圖3。

表3 各組Ishiwaka 細(xì)胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail 和Twist 蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of PCNA,E-cadherin,vimentin,snail and Twist proteins in Ishiwaka cells in various groups(n＝7，)

表3 各組Ishiwaka 細(xì)胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail 和Twist 蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of PCNA,E-cadherin,vimentin,snail and Twist proteins in Ishiwaka cells in various groups(n＝7，)

*P＜0.05 compared with blank control group；△P＜0.05 compared with negative control group；#P＜0.05 compared with CCAT1-siRNA group.

圖3 Western blotting 法檢測Ishiwaka 細(xì)胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail 和Twist 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Expression levels of PCNA，E-cadherin，vimentin，snail and Twist proteins in Ishiwaka cells in virous groups determined with Western blotting method

2.6 各組Ishiwaka 細(xì)胞中Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達(dá)水平與空白對照組和陰性對照組比較，CCAT1-siRNA 組和CCAT1-siRNA +LY364947 組Ishiwaka 細(xì)胞中p-Smad2/3 和TGF-β1蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與CCAT1-siRNA 組比較，CCAT1-siRNA+LY364947 組Ishiwaka 細(xì)胞中p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；空白對照組與陰性對照組Ishiwaka 細(xì)胞中p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4和表4。

圖4 Western blotting 法檢測Ishiwaka 細(xì)胞中Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expressions of Smad2/3，p-Smad2/3 and TGF-β1 proteins in Ishiwaka cells in various groups determined by Western blotting method

表4 各組Ishiwaka 細(xì)胞中Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達(dá)水平Tab.4 Expression levels of Smad2/3,p-Smad2/3 and TGF-β1 proteins in Ishiwaka cells in various groups (n＝7，)

表4 各組Ishiwaka 細(xì)胞中Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達(dá)水平Tab.4 Expression levels of Smad2/3,p-Smad2/3 and TGF-β1 proteins in Ishiwaka cells in various groups (n＝7，)

*P＜0.05 compared with blank control group；△P＜0.05 compared with negative control group；#P＜0.05 compared with CCAT1-siRNA group.

3 討論

LncRNA 是非編碼RNA 家族成員，長度大于200 nt，不具備蛋白質(zhì)編碼功能，在染色質(zhì)修飾、表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多方面發(fā)揮重要調(diào)控作用，可促進(jìn)蛋白基因表達(dá)，也可抑制基因表達(dá)［6］。近年來研究［7-8］顯示：多種LncRNA 與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑癌或促癌作用，與靶蛋白組織的復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和侵襲遷移中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。LncRNA CCAT1 位于c-Myc 的一個(gè)增強(qiáng)子區(qū)，在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)［9］，與多種惡性腫瘤的預(yù)后關(guān)系密切，如CCAT1 可靶向miR-219a 調(diào)節(jié)宮頸癌HeLa 細(xì)胞生長、侵襲和遷移［10］；激活CCAT1 可通過調(diào)節(jié)SPRY4 和HOXB13 在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)影響食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和遷移［11］；LncRNA CCAT1可被c-Myc 激活促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移［12］。潘洪麗等［13］對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中LncRNA CCAT1 表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)：子宮內(nèi)膜癌組織中LncRNA CCAT1 呈高水平表達(dá)，沉默子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中LncRNA CCAT1 水平可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲和遷移。本文作者對子宮內(nèi)膜癌Ishiwaka 細(xì)胞中LncRNA CCAT1 水平研究發(fā)現(xiàn)：Ishiwaka 細(xì)胞中LncRNA CCAT1 mRNA 表達(dá)水平升高，沉默Ishiwaka 細(xì)胞LncRNA CCAT1 表達(dá)可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。但LncRNA CCAT1 在子宮內(nèi)膜癌中的作用機(jī)制尚不清楚。

多種信號(hào)通路參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過程，其中TGF-β/Smad 信號(hào)通路為子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移過程中的重要通路之一。TGF-β/Smad 信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑制和促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的雙重作用，在惡性腫瘤的起始階段，TGF-β/Smad 信號(hào)通路可抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制惡性腫瘤的發(fā)展；在惡性腫瘤的晚期，TGF-β/Smad 信號(hào)通路可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程［14］。TGF-β/Smad 信號(hào)通路在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞免疫逃避、細(xì)胞轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)血管生成等，促進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)展［15-16］。

LncRNA CCAT1 可通過多種信號(hào)通路參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如LncRNA CCAT1 通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移過程［17］；LncRNA CCAT1 在惡性腫瘤中的作用與CCAT1 可影響惡性腫瘤細(xì)胞EMT 有關(guān)［18］；LncRNA CCAT1 通過miR-490-3p上調(diào)TGF-β 受體1 從而促進(jìn)TGF-β1 誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞EMT［19］。LncRNA CCAT1 可通過TGF-β 誘導(dǎo)細(xì)胞EMT，EMT 在細(xì)胞的侵襲遷移中發(fā)揮重要作用［20］，因此推測LncRNA CCAT1 在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移中的作用可能與TGF-β/Smad 信號(hào)通路及EMT 有關(guān)。本研究結(jié)果顯示：沉默CCAT1 及加入TGF-β/Smad 信號(hào)抑制劑均可降低細(xì)胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail、Twist、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達(dá)水平，細(xì)胞中E-cadherin 蛋白表達(dá)水平升高。PCNA 在細(xì)胞核中合成，檢測細(xì)胞中PCNA 蛋白水平可用于評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖狀態(tài)［21］。E-cadherin 為重要的維持上皮細(xì)胞表型的細(xì)胞間黏附分子，E-cadherin 表達(dá)缺失或者表達(dá)降低是EMT 的重要標(biāo)志［22］。Vimentin 為間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，其水平升高也是EMT 的標(biāo)志物［23］。snail 和Twist 為TGF-β/Smad 信號(hào)通路的上游轉(zhuǎn)錄因子，二者水平升高可促進(jìn)TGF-β/Smad 信號(hào)通路激活［24-25］。p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達(dá)水平可反映TGF-β/Smad 信號(hào)通路狀況，p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達(dá)水平升高表明TGF-β/Smad 信號(hào)通路激活；反之，p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白水平降低表明TGF-β/Smad 信號(hào)通路受到抑制。因此，本研究中沉默CCAT1 及加入TGF-β/Smad 信號(hào)抑制劑均可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，降低細(xì)胞中PCNA、Ecadherin、vimentin、snail、Twist、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表達(dá)水平，細(xì)胞中E-cadherin 蛋白表達(dá)水平升高，表明沉默CCAT1 抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的機(jī)制可能與抑制TGF-β/Smad 信號(hào)通路激活、從而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞EMT 有關(guān)。

綜上所述，沉默LncRNA CCAT1 對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移具有抑制作用，其機(jī)制可能與沉默LncRNA CCAT1 可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞TGF-β/Smad 信號(hào)通路活化從而抑制EMT有關(guān)。