裴丹,劉學

（錦州醫(yī)科大學人體解剖學教研室，遼寧 錦州 121000）

中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）損傷往往伴隨著血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）破壞，浸潤的粒細胞和CNS 固有的膠質(zhì)細胞過度增殖并分泌各種細胞因子和生長因子引發(fā)炎癥反應(yīng)［1］。在損傷的CNS 各種軸突生長抑制因子，如硫酸軟骨素蛋白多糖（chondroitinsulphateproteoglycans，CSPGs），聚集在損傷周圍形成瘢痕區(qū)［2］。抑制瘢痕形成可能是中樞神經(jīng)損傷后促進軸突再生的新方法。與配體發(fā)生特異性結(jié)合的血小板衍生生長因子受體α（platelet-derived growth factor receptor α，PDGFRα），使受體二聚化暴露活性位點從而激發(fā)酪氨酸激酶的活性，激活受體的自體磷酸化［3］。作用于核內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)錄因子，使細胞發(fā)生一系列的表型改變，促進細胞的生長、分裂［4］和增殖。小鼠腦損傷后在損傷周圍會出現(xiàn)磷酸化的血小板衍生生長因子受體α（phosphorylated platelet-derived growth factor receptor α，p-PDGFR α）表達水平升高，而p-PDGFRα 表達水平升高是否也與膠質(zhì)細胞增殖及瘢痕形成有關(guān)尚未見相關(guān)報道。因此，本研究進一步探討PDGFRα 與細胞增殖及瘢痕形成的相關(guān)性，并觀察PDGFRα 抑制劑AG1296 對細胞增殖和瘢痕形成的影響，以期為神經(jīng)損傷后的再生修復(fù)治療提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器48 只8 周齡SPF 級雄性BALB/c 小鼠（中國醫(yī)科大學實驗動物部），體質(zhì)量為25～35 g，動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（遼）2013-0001。兔抗p-PDGFRα 和兔抗PDGFRα（美國Santa Cruz 公司），鼠抗GAPDH單克隆抗體（美國Proteintech 公司），辣根酶標記的羊抗兔和羊抗鼠IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、兔抗離子鈣接頭蛋白分子1（ionized calcium binding adaptor molecule 1，IBA-1）、兔抗Ⅳ型膠原蛋白（type Ⅳcollagen，Col Ⅳ）、兔抗NG2、兔抗纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）和兔抗CD45（英國Abcam 公司）。小鼠腦立體定位儀（型號DW-2000，成都泰盟科技有限公司），高壓滅菌器（型號VPV-5032，長春百奧技術(shù)有限公司），塑料薄膜封口機（型號SF300，溫州興業(yè)機械設(shè)備有限公司），轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司），恒溫水浴箱（型號HHS21-6-S，上海躍進公司），水平搖床（型號WD-9405A，北京六一儀器廠）。

1.2 實驗動物模型的制備及分組按照白丹等［5］的方法制備小鼠黑質(zhì)紋狀體通路損傷模型。用10%水合氯醛按體質(zhì)量0.03 mL·g－1腹腔注射麻醉后固定在小鼠腦功能立體定位儀上。門齒欄設(shè)置成比耳屏線低3 mm。剪掉頭皮頂部毛后消毒并在中央縱向切開，清除顱頂骨膜，在前囟點右后方1.5 mm 處用牙鉆緩慢鉆出一個約1 mm×2 mm 的長方形缺口，暴露大腦。將寬度為1.5 mm 的切刀固定在直線型立體框架內(nèi)，在右側(cè)顱骨中線外側(cè)0.5 mm，前囟點后1.5 mm 處，距離大腦表面深度5.5 mm 插入切刀。然后緩慢拔出刀片，止血縫合。將模型小鼠按照損傷后注入物質(zhì)不同分為2 組：黑質(zhì)紋狀體路部分切斷+PDGFRα 抑制劑AG1296注入組（AG1296 組），24 只小鼠，手術(shù)后連續(xù)3 d內(nèi)應(yīng)用微量注射器沿損傷處注入AG1296，每日5 μL（5 mmol·L－1）；二甲基亞砜（DMSO）對照組（DMSO 組），24 只小鼠，手術(shù)后連續(xù)3 d 應(yīng)用微量注射器注入同等劑量的DMSO。

1.3 取材及制片2 組小鼠損傷后分別在1、4、7 和14 d 取腦，每次取6 只小鼠。各組每個時間點取3 只小鼠行心臟灌流沖洗，以損傷側(cè)小鼠大腦半球的損傷部位為中心，取前后2 mm 腦組織迅速放入－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩ＪＳ? 只小鼠行心臟灌流固定用于免疫組織化學染色，取腦組織4%多聚甲醛后固定過夜，逐級脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。5 μm 厚度水平連續(xù)切片，貼到多聚賴氨酸預(yù)處理的玻片烘干備用。

1.4 免疫組織化學染色檢測各組小鼠腦組織中p-PDGFRα、GFAP、IBA-1、NG2、CD45、FN 和ColⅣ的蛋白表達石蠟切片脫蠟水化，用0.01 mol·L－1的檸檬酸鹽緩沖液微波沸騰修復(fù)，過氧化氫阻斷，非免疫動物血清封閉，一抗p-PDGFRα（1∶100）、GFAP（1∶1 000）、IBA-1（1∶200）、NG2（1∶200）、CD45（1∶100）、FN（1∶200）和ColⅣ（1∶500），按比例稀釋后滴至切片組織處4℃孵育過夜，生物素標記的二抗（S-P試劑盒C 溶液），孵育10 min。鏈霉菌抗生素-過氧化物酶溶液（S-P 試劑盒D 溶液）孵育10 min 后DAB 溶液顯色，顯微鏡下觀察。自來水沖洗，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察免疫陽性產(chǎn)物的位置、分布、染色強弱及陽性細胞數(shù)，圖像用NIS-Elements F 系統(tǒng)拍片后以TIF 文件保存。

1.5 Western blotting 法檢測各組小鼠腦組織中p-PDGFR-α、PDGFR-α、GFAP 和IBA-1 蛋白表達水平用0.9%生理鹽水沖洗剪碎腦組織，添加組織質(zhì)量4 倍的含1% PMSF 的RIPA 裂解液后，超聲粉碎機粉碎，4℃裂解30 min。4℃、12 000 r·min－1離心30 min，取上清液即為所得組織蛋白，BCA蛋白試劑盒進行蛋白定量，配置上樣體系，上樣體積10 μL，加入5×loading buffer 2 μL，剩余體積用PBS 緩沖液補齊，100℃、5 min 蛋白變性后-80℃保存。配置8%和10%分離膠，微量注射器加樣，濃縮膠內(nèi)電泳電壓設(shè)為80 V，分離膠內(nèi)電泳電壓設(shè)置為120 V。轉(zhuǎn)膜后用含5%血清的TBST 溶液37℃封閉1 h，加入一抗稀釋液GAPDH（1∶10 000）、p-PDGFR-α（1 ∶200）、PDGFR-α（1 ∶200）、GFAP（1∶50 000）和IBA-1（1∶1 000），4℃冰箱內(nèi)搖床上孵育過夜，洗膜后二抗工作液（1∶5 000）搖床孵育2 h。TBST 漂洗后，ECL 發(fā)光用Bio-Rad凝膠電泳圖像分析儀進行采圖。

1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。2 組小鼠腦組織中p-PDGFRα、GFAP 和IBA-1 蛋白表達水平以表示，所有實驗重復(fù)3 次。多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腦損傷后腦組織中p-PDGFRα 蛋白表達水平采用免疫組織化學染色和Western blotting 法檢測2 組小鼠腦損傷1、4、7 和14 d 后p-PDGFRα 蛋白表達。免疫組織化學染色檢測結(jié)果顯示：各時間點 AG1296 組小鼠腦組織中p-PDGFRα 蛋白棕黃色陽性表達細胞數(shù)較DMSO組明顯減少（圖1）。Western blotting 法檢測結(jié)果顯示：在相對分子質(zhì)量為185 000 標記處可見p-PDGFRα 蛋白的免疫印跡條帶（圖2）；定量分析結(jié)果：各時間點AG1296 組小鼠腦組織中 p-PDGFRα 蛋白表達水平明顯低于DMSO組（P＜0.05 或P＜0.01）（圖3）。

圖2 Western blotting 法檢測2 組小鼠腦損傷后腦組織中p-PDGFRα 蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of p-pDGFR α protein in brain tissue of mice after injury in two groups detected by Western blotting method

圖3 2 組小鼠腦損傷后不同時間點腦組織中p-PDGFRα 蛋白表達水平Fig.3 Expression levels of p-PDGFRα protein in brain tissue of mice after brain injury

2.2 各組小鼠腦損傷后腦組織中GFAP 和IBA-1蛋白表達水平免疫組織化學染色檢測結(jié)果顯示：與DMSO 組比較，AG1296 組小鼠腦損傷后1、4、7 和14 d 損傷部位周圍棕黃色星形膠質(zhì)細胞數(shù)明顯減少，并且細胞體積變小，突起變短（圖4）。與DMSO 組比較，AG1296 組小鼠腦損傷部位周圍小膠質(zhì)細胞IBA-1 陽性細胞數(shù)明顯減少（圖5）。Western blotting 法檢測結(jié)果顯示：在相對分子質(zhì)量為48 000 和17 000 標記處可見GFAP 和IBA-1 蛋白的免疫印跡條帶（圖6）；定量分析結(jié)果：AG1296 組GFAP 和IBA-1 蛋白相對表達水平明顯低于DMSO 組（P＜0.05 或P＜0.01）（圖7）。

2.3 各組小鼠腦損傷后14 d 腦組織中FN、ColⅣ、CD45、NG2 和GFAP 蛋白表達免疫組織化學染色結(jié)果顯示：損傷14 d 后，DMSO 組小鼠腦組織中可見FN 陽性細胞聚集在損傷中心部位（圖8A），ColⅣ陽性細胞也密集地沉積在損傷的中心部位（圖8B），表明纖維瘢痕形成在損傷中心部位；大量CD45 陽性細胞聚集在損傷區(qū)周圍（圖8C），NG2 陽性細胞即少突膠質(zhì)前體細胞數(shù)在損傷位置大量增多（圖8D），激活的星形膠質(zhì)細胞（GFAP 陽性細胞）在損傷周邊明顯增多并且其突起形成境界膜包圍著纖維瘢痕（圖8E）。AG1296 組小鼠腦組織中，F(xiàn)N 陽性細胞在損傷中心區(qū)明顯減少（圖8F），ColⅣ陽性細胞只有少量沉積在損傷的中心部位（圖8G），表明纖維瘢痕形成明顯減少，在纖維瘢痕區(qū)，損傷空洞消失，僅留一條縫隙；CD45 陽性細胞少量存在于損傷區(qū)周圍（圖8H），NG2 陽性細胞在損傷部位的周邊明顯減少（圖8I），激活的星形膠質(zhì)細胞（GFAP 陽性細胞）雖然分布整個損傷區(qū)，但并未形成明顯境界膜（圖8J）。

圖6 Western blotting 法檢測2 組小鼠腦損傷后腦組織中GFAP 和IBA-1 蛋白表達電泳圖Fig.6 Elecrophoregram of expressions of GFAP and IBA-1 proteins in brain tissue of mice after injury in two groups detected by Western blotting method

3 討論

成年的哺乳動物中樞神經(jīng)創(chuàng)傷性損傷后橫斷的軸突幾乎無再生能力，各種抑制因子在損傷周圍阻止離斷的軸突生長。本研究結(jié)果顯示：DMSO 組小鼠腦組織中FN 陽性細胞聚集在損傷中心部位，ColⅣ陽性細胞也密集沉積在損傷的中心部位，表明纖維瘢痕形成在損傷中心部位，大量CD45 陽性的粒細胞聚集在纖維瘢痕位置。研究者［6］發(fā)現(xiàn)：在脊髓損傷模型的纖維化組織中有巨噬細胞、淋巴細胞和成纖維細胞。研究［7-8］表明：瘢痕是腦損傷后主要阻止軸突再生的因素，腦損傷形成瘢痕表達各種潛在的軸突生長抑制因子，包括CSPGs、核因子E2 相關(guān)因子 2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）［9-12］、黏蛋白-C 和信號素3A，上述因子均可能是阻礙軸突再生的化學因素。LI 等［13］和AHMED 等［14］報道：在損傷的脊髓組織中加入ColⅣ的抑制劑DPY 可以抑制纖維瘢痕的形成，促進軸突再生穿過損傷區(qū)，并能促進脊髓損傷后軸突再生和功能恢復(fù)。本研究結(jié)果顯示：給予AG1296后14 d，小鼠腦損傷部位腦組織中FN、ColⅣ和CD45 陽性細胞數(shù)較DMSO 組減少，表明小分子抑制劑AG1296 可以減少細胞增殖，進而減少纖維瘢痕的形成。本課題組將在后續(xù)實驗中進一步驗證抑制劑AG1296 是否可以促進損傷后軸突再生和功能的恢復(fù)。

圖7 2 組小鼠腦損傷后腦組織中GFAP 和IBA-1 蛋白表達水平Fig.7 Expression levels of GFAP and IBA-1 proteins in brain tissue of mice in two groups after injury

已有研究［15-18］表明：小鼠腦損傷后多種細胞因子刺激膠質(zhì)細胞激活并增殖，如轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）、沉默調(diào)節(jié)蛋白1（recombinant sirtuin 1，Sirt1）和c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）。通過調(diào)控Sirt1［19］抑制膠質(zhì)細胞的激活可以促進神經(jīng)元的恢復(fù)。本研究結(jié)果顯示：小鼠腦損傷后激活PDGFRα，并且引起反應(yīng)性的星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和NG2 陽性的少突膠質(zhì)前體細胞明顯增多，膠質(zhì)細胞的軸突最終封閉病變部位形成膠質(zhì)界膜。這一結(jié)果導(dǎo)致即使神經(jīng)纖維增生也無法穿透膠質(zhì)界膜，進而影響損傷神經(jīng)的修復(fù)；給予小分子 PDGFR α 抑制劑 AG1296 后，AG1296 組小鼠腦組織中GFAP 和IBA-1 蛋白表達水平明顯降低，星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞增殖明顯減少，盡管損傷周圍的膠質(zhì)細胞仍然很多，但膠質(zhì)界膜基本消失，NG2 蛋白免疫組織化學陽性表達的少突膠質(zhì)前體細胞也明顯減少，表明AG1296可以抑制PDGFRα 的活化，減少膠質(zhì)細胞反應(yīng)和腦損傷后膠質(zhì)瘢痕的形成及炎癥細胞的擴散。因此，在腦損傷后期抑制PDGFRα 信號的持續(xù)激活可能是減少細胞增殖，減少瘢痕形成，從而促進神經(jīng)軸突再生的關(guān)鍵。從PDGFRα 信號通路與瘢痕組織形成的相關(guān)性入手研究中樞神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生機制具有重要意義，而其作用的具體機制仍需進一步深入研究。