李小兵 ,王旭 ,呂瑛,黃建成,李紅英,王軍，張會軍,蘇振宇

（1.河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院放射科，河北 石家莊 050031；2.河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院心臟外科，河北 石家莊 050031）

心房顫動（房顫）為臨床上常見的心律失常之一，房顫患者常并發(fā)腎功能障礙和腦卒中等嚴重疾病，給患者、家庭和社會帶來沉重負擔。房顫病因尚不十分清楚，近年來，炎癥反應(yīng)與房顫的關(guān)系受到研究者的關(guān)注。研究［1-3］顯示：房顫心肌組織中有多種炎癥細胞浸潤，表明炎癥反應(yīng)在房顫的疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，抑制炎癥反應(yīng)可降低房顫的發(fā)病風險。丹參多酚酸為中藥丹參水溶性活性成分，具有抑制血管損傷、抗心肌缺血、抗炎癥反應(yīng)和減輕鈣超載等作用［4-5］。研究［6］顯示：丹參多酚酸可通過降低心肌細胞重構(gòu)過程改善房顫大鼠的心肌損傷程度，從而發(fā)揮治療房顫的作用。丹參多酚酸還可以通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮對多種疾病的治療作用，如其可通過抑制機體微炎癥狀態(tài)發(fā)揮對糖尿病腎病的治療作用［7］，通過抑制炎癥反應(yīng)改善不穩(wěn)定型心絞痛的心功能［8］。但有關(guān)丹參多酚酸治療房顫機制方面的研究尚未見相關(guān)報道，本研究通過分析丹參多酚酸對房顫大鼠心肌組織炎癥反應(yīng)和細胞外信號調(diào)節(jié)酶1/2-核轉(zhuǎn)錄因子-κB（extracellular signal-regulating enzymes 1/2-nuclear transcription factor-κB，ERK1/2-NF-κB）信號通路的影響，探討丹參多酚酸是否通過抗炎作用發(fā)揮其對房顫的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器清潔級健康雄性SD 大鼠48 只，12 周齡，體質(zhì)量200～250 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-001。注射用丹參多酚酸鹽（規(guī)格：每瓶50 mg，批號：20190523，上海綠谷制藥有限公司），蘇木精-伊紅（HE）染液（美國Sigma 公司），RIPA 裂解液、Masson 試劑盒、免疫組織化學試劑盒、兔抗鼠基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）多克隆抗體、兔抗鼠基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）多克隆抗體、兔抗鼠血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）多克隆抗體、兔抗鼠細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）多克隆抗體、兔抗鼠ERK1/2 多克隆抗體、兔抗鼠磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）多克隆抗體、兔抗鼠NFκB 多克隆抗體和兔抗鼠磷酸化NF-κB（p-NF-κB）多克隆抗體（美國Abcam 公司）。TGL-16M 高速離心機（湖南長沙湘儀儀器廠），EN61010-1 水平電泳儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 實驗動物模型建立、分組及給藥方式將48 只大鼠隨機分為對照組、房顫組和丹參多酚酸組，每組16 只。房顫模型建立：除對照組外，房顫組和丹參多酚酸組大鼠建立房顫模型［9］，行刺激前先描記各大鼠心電圖，然后舌下靜脈注射氯化鈣、乙酰膽堿混合液（1 mL·kg－1），再次描記大鼠心電圖，待出現(xiàn)典型的房顫f 波；隔日進行1 次，共4 周。造模成功標準：停藥后心電圖仍有典型的房顫波改變。建模成功后，丹參多酚酸組大鼠采用丹參多酚酸注射液（4 mg·kg－1·d－1）灌胃［10］，對照組和房顫組大鼠灌胃給予等量生理鹽水，每天1 次，共4 周。

1.3 實驗動物取材治療結(jié)束后處死大鼠，取心肌組織，將其分為2 份：一份心肌組織經(jīng)多聚甲醛固定72 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋，用于HE 染色、Masson 染色和免疫組織化學染色；一份心肌組織用于Western blotting 法測定。

1.4 HE染色觀察大鼠心肌組織病理形態(tài)表現(xiàn)將石蠟切片烤片30 min，常規(guī)脫蠟，蘇木精染色7 min，自來水沖洗，稀鹽酸反應(yīng)數(shù)秒，自來水沖洗，氨水返藍，自來水沖洗，伊紅染色，水洗，脫水透明，顯微鏡下觀察大鼠心房組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.5 Masson染色觀察各組大鼠心肌纖維化情況將心肌組織石蠟切片脫蠟至水，蘇木精染色10 min，鹽酸乙醇分化，比布列猩紅水-酸性品紅-冰乙酸溶液染色2 min，磷鉬酸-磷鎢酸溶液染色15 min，苯胺藍-冰乙酸溶液染色5 min，乙酸溶液浸洗5 min，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察大鼠心肌纖維化情況。

1.6 免疫組織化學染色檢測各組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平將心肌組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，加入H2O2室溫靜置10 min，PBS 緩沖液沖洗，山羊血清封閉液封閉20 min，加入一抗兔抗鼠MMP-2 多克隆抗體和兔抗鼠MMP-9多克隆抗體孵育過夜，PBS 緩沖液沖洗，加入二抗孵育1 h，PBS 緩沖液沖洗，加入鏈霉素和過氧化物酶孵育30 min，PBS 緩沖液沖洗，DAB 顯色劑顯色，自來水沖洗，復染，脫水，透明，封片。采用BioMias 2000 圖像處理分析軟件進行MMP-2 和MMP-9 蛋白陽性染色面積和積分光密度值測定。以積分光密度值代表蛋白表達水平。積分光密度＝平均光密度×蛋白陽性染色面積。

1.7 Western blotting 法測定各組大鼠心肌組織中VCAM-1、ICAM-1、ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白水平取心肌組織50 mg，加入裂解液提取總蛋白，煮沸表型，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，加入一抗：兔抗鼠VCAM-1 多克隆抗體、兔抗鼠ICAM-1 多克隆抗體、兔抗鼠ERK1/2 多克隆抗體、兔抗鼠p-ERK1/2 多克隆抗體、兔抗鼠NFκB 多克隆抗體和兔抗鼠p-NF-κB 多克隆抗體，孵育過夜，加入二抗孵育2 h，采用Image lab software 軟件采集條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參。目標蛋白表達水平＝目標蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 積分光密度值以及VCAM-1、ICAM-1、ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平與VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物模型的建立停藥后大鼠心電圖仍有典型的房顫波改變，表明大鼠房顫模型建立成功。見圖1。

圖1 房顫模型大鼠造模前后ECG 表現(xiàn)Fig.1 ECG performance of atrial fibrillation model rats before and after modeling

2.2 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)表現(xiàn)對照組大鼠心肌細胞未見明顯異常；房顫組大鼠心肌細胞排列紊亂，心肌組織間質(zhì)增多，可見炎性細胞浸潤；與房顫組比較，丹參多酚酸組大鼠心肌細胞排列尚正常，心肌組織間質(zhì)稍多，炎性細胞浸潤不明顯。見圖2。

2.3 各組大鼠心肌纖維化情況對照組大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維正常；房顫組大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維明顯增多；與房顫組比較，丹參多酚酸組大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維較房顫組明顯減少。見圖3。

2.4 各組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平與對照組比較，房顫組和丹參多酚酸組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與房顫組比較，丹參多酚酸組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。見表1 和圖4。

表1 各組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平Tab.1 Expression levels of MMP-2 and MMP-9 in myocardium tissue of rats in various groups（n＝16，）

表1 各組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平Tab.1 Expression levels of MMP-2 and MMP-9 in myocardium tissue of rats in various groups（n＝16，）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with atrial fibrillation group.

2.5 各組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平與對照組比較，房顫組和丹參多酚酸組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與房顫組比較，丹參多酚酸組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平降低（P＜0.05）。見圖5 和表2。

圖5 各組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expressions of VCAM-1 and ICAM-1 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

表2 各組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of VCAM-1 and ICAM-1 proteins in myocardium tissue of rats in various groups（n＝16,）

表2 各組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of VCAM-1 and ICAM-1 proteins in myocardium tissue of rats in various groups（n＝16,）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with atrial fibrillation group.

2.6 各組大鼠心肌組織中ERK1/2-NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白表達水平各組大鼠心肌組織中ERK1/2 和NF-κB 蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與對照組比較，房顫組和丹參多酚酸組大鼠心肌組織中p-ERK1/2 和p-NF-κB 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與房顫組比較，丹參多酚酸組大鼠心肌組織中p-ERK1/2 和p-NF-κB蛋白表達水平降低（P＜0.05）。見表3 和圖6。

表3 各組大鼠心肌組織中ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of ERK1/2,p-ERK1/2,NF-κB,and p-NF-κB proteins in myocardium tissue of rats in various groups（n＝16,）

表3 各組大鼠心肌組織中ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of ERK1/2,p-ERK1/2,NF-κB,and p-NF-κB proteins in myocardium tissue of rats in various groups（n＝16,）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with atrial fibrillation group.

圖6 各組大鼠心肌組織中ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達電泳圖Fig.6 Electrophoregram of ERK1/2，p-ERK1/2，NF-κB，and p-NF-κB proteins in myocardium tissue of rats in various groups

2.7 房顫組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平與VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平相關(guān)性分析房顫組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平與VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。見表4。

表4 房顫組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平與VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平相關(guān)性Tab.4 Correlations between MMP-2 and MMP-9 protein expression levels and VCAM-1 and ICAM-1 protein expression levels in myocardium tissue of rats in atrial fibrillation group

3 討論

本研究中房顫組大鼠心肌組織中VCAM-1、ICAM-1、p-ERK1/2 和p-NF-κB 蛋白表達水平升高，表明房顫大鼠心肌組織存在炎癥反應(yīng)，且ERK1/2-NF-κB 信號通路激活。房顫患者或動物模型中多種炎癥細胞因子水平升高。VCAM-1 和ICAM-1 為膜表面糖蛋白，是介導細胞與細胞之間以及細胞與細胞外基質(zhì)之間相互黏附、結(jié)合的黏附分子，VCAM-1 和ICAM-1 為體內(nèi)重要的炎癥因子。在多數(shù)單核細胞膜上均存在VCAM-1 受體，VCAM-1 主要發(fā)揮促進單個核細胞黏附作用；ICAM-1 可介導細胞間識別，直接誘導白細胞聚集［11］。在白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等多種炎癥介質(zhì)的作用下，VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平升高［12］。在房顫時大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平升高，其通過介導炎癥反應(yīng)引起心房組織結(jié)構(gòu)改變，從而導致房顫的發(fā)生［13-14］。ERK1/2-NF-κB 信號通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，在多種因素作用下，ERK1/2 發(fā)生磷酸化，進而被激活，由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細胞核，進一步介導NF-κB 磷酸化，p-NF-κB 被進一步激活，促進炎性細胞活化，參與機體炎癥反應(yīng)［15-16］。NF-κB 的靶基因眾多，其靶基因（包括多種炎癥細胞因子）均含有與NF-κB 結(jié)合的位點，VCAM-1和ICAM-1 序列中均含有NF-κB 結(jié)合位點，故VCAM-1 和ICAM-1的表達水平受NF-κB 調(diào)控，NF-κB 信號通路激活可促進VCAM-1 和ICAM-1 水平升高［17-18］。故激活的ERK1/2-NF-κB 信號通路通過調(diào)控VCAM-1 和ICAM-1 炎癥因子水平參與房顫的發(fā)生和維持。丹參多酚酸具有抗炎作用［19-20］，本研究結(jié)果顯示：丹參多酚酸治療后房顫大鼠心肌組織中VCAM-1、ICAM-1、p-ERK1/2 和p-NF-κB蛋白表達水平降低，表明丹參多酚酸可能通過抑制ERK1/2-NF-κB 信號通路激活，從而下調(diào)VCAM-1和ICAM-1 炎癥因子水平，發(fā)揮對房顫的治療作用。

本研究中房顫大鼠心肌組織中有炎癥細胞浸潤，可見大量膠原沉積，心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平升高。心肌纖維化為房顫心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的重要特征，心肌纖維化主要表現(xiàn)為心肌細胞外基質(zhì)重構(gòu)。心肌細胞外基質(zhì)的主要成分為膠原蛋白，當受到異常刺激時心肌成纖維細胞大量合成和分泌膠原，導致細胞外基質(zhì)中的膠原過量沉積，最終引起心肌纖維化，心肌纖維化對心房組織結(jié)構(gòu)和功能造成破壞，使房顫更容易發(fā)生和維持［21］。MMPs 在維持心肌細胞外基質(zhì)的合成和降解中發(fā)揮重要作用，MMP-2 和MMP-9 為2 種常用的MMPs，在心肌纖維化中發(fā)揮重要作用；正常情況下，MMP-2 和MMP-9 在細胞中以酶原形式存在，房顫早期細胞內(nèi)存在鈣超載，并可引起一系列病理生理變化，誘導MMP-2 和MMP-9 的分泌和活化，導致MMP-2 和MMP-9 活性增加，表達水平升高，引起正常的細胞外基質(zhì)成分降解，同時合成不具有正常結(jié)構(gòu)和功能的結(jié)締組織和膠原蛋白，引起心肌組織重塑，導致房顫的發(fā)生發(fā)展［22］。故在房顫早期，細胞內(nèi)鈣超載誘導MMP-2 和MMP-9分泌和活化，導致心肌組織不具有正常結(jié)構(gòu)和功能的結(jié)締組織和膠原蛋白增加，從而發(fā)生心肌重構(gòu)，引起房顫的發(fā)生。MMPs 與VCAM-1 和ICAM-1 分子共同參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，在房顫發(fā)病過程中MMPs 與VCAM-1 和ICAM-1 相互作用參與房顫的發(fā)生發(fā)展［23-24］。本研究結(jié)果顯示：房顫組大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平與VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平呈正相關(guān)關(guān)系；丹參多酚酸可降低房顫大鼠心肌組織中MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平。VCAM-1 和ICAM-1 作為炎癥因子，通過影響MMP-2 和MMP-9 水平，引起房顫大鼠心肌纖維化，導致房顫發(fā)生；丹參多酚酸通過抑制炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子VCAM-1 和ICAM-1 水平，從而降低MMP-2 和MMP-9 水平，抑制心肌重構(gòu)，阻止房顫的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，丹參多酚酸治療房顫可能是通過其抑制ERK1/2-NF-κB 信號通路激活，下調(diào)其靶基因VCAM-1 和ICAM-1 炎癥因子水平，影響MMP-2和MMP-9 表達，從而抑制房顫心肌纖維化，發(fā)揮對房顫的治療作用。