陳家顯 ,劉先霞,陳躍武,陳磊,張遠生,陳勁松

（1.海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，海南 海口 570311；2.南華大學附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南 衡陽 421001）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是一種常見的心血管疾病，也是各種心臟疾病的終末期表現(xiàn)，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢，且因其具有高發(fā)病率和高死亡率的特點已引起研究者高度關注［1］。目前CHF 的治療仍以藥物治療為主，西藥控制心力衰竭進展及改善癥狀有良好的效果，但其局限于對癥處理，且藥物不良反應明顯。中醫(yī)藥治療心血管疾病已體現(xiàn)出其獨特優(yōu)勢，近年來的研究［2-3］表明：中醫(yī)藥治療心血管疾病療效確切，安全性高，且具有多靶點、多層次和多環(huán)節(jié)等優(yōu)勢。芪參益氣滴丸（Qishen-Yiqi Dropping Pill，QSYQ）是治療氣虛血瘀型胸痹的中藥制劑，主要由黃芪、丹參、三七和降香組成，具有益氣活血的功效，臨床廣泛地應用于冠心病及心力衰竭的治療，并取得了良好效果［4-5］，但其作用機制尚未明確。本研究通過觀察CHF 大鼠心臟超聲表現(xiàn)、心肌細胞形態(tài)、氧化應激水平及細胞凋亡蛋白的表達，探討QSYQ 對心力衰竭發(fā)生時氧化應激水平和心肌細胞凋亡的影響，闡明其在CHF 發(fā)生發(fā)展過程中的保護作用及其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器無特定病原體（SPF）級雄性SD 大鼠60 只，鼠齡6～7 周，體質(zhì)量（220±20）g，由湖北省動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2018-0027。大鼠飼養(yǎng)條件：溫度24℃，濕度50%，通風良好，明暗光照交替12 h，標準飼料喂養(yǎng)，自由進食及飲水。適應環(huán)境1 周，術前禁食24 h，不禁水。QSYQ（批號150906）購于天津天士力制藥集團股份有限公司，卡托普利（批號H31022986）購于中美上海施貴寶制藥有限公司，蘇木素、脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒和活性氧（ROS）檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司，乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）試劑盒購于南京建成生物工程研究所，活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved-Caspase-3）、B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）、核因子E2 相關因子2（Nrf2）和血紅素氧化酶1（HO-1）抗體購于美國Cell Signaling Technology 公司。ACUSON X300 超聲心動圖儀購于德國西門子公司，RX50M 正置顯微鏡和攤片機購于德國徠克顯微系統(tǒng)有限公司，UniCel DxC600全自動生化分析儀購于美國Beckman Coulter 公司，Tanon-3500（R）全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)購于上海天能科技有限公司，Varioskan LUX 酶標儀購于美國Thermo Fisher Science 公司。

1.2 實驗動物模型制備和分組60 只SPF 級雄性SD 大鼠，適應性飼養(yǎng)1 周后，隨機分為假手術組、模型組、陽性藥對照組（6.75 mg·kg－1·d－1卡托普利）［6-7］、低劑量（135 mg·kg－1·d－1）QSYQ 組和高劑量（270 mg·kg－1·d－1）QSYQ 組，每組12 只。3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，采用冠狀動脈前降支結扎法建立CHF 模型（假手術組不結扎冠狀動脈）［8］，造模結束后利用超聲心動圖儀檢測大鼠心功能，左室射血分數(shù)（ejection raction，EF）≤50%視為CHF 造模成功［9-10］，術后24 h 灌胃給藥，連續(xù)4 周，其中假手術組和模型組大鼠每天給予其他3 組等量生理鹽水灌胃。

1.3 超聲檢查各組大鼠灌胃4 周后進行心臟超聲檢測，記錄左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVSD）、左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVDD）、EF 和左室短軸縮短率（left ventricular short-axis shortening rate，F(xiàn)S）。

1.4 TUNEL 法檢測大鼠心肌組織細胞凋亡率3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，取左室心肌組織，洗凈后用10%甲醛固定24 h 后脫水處理，常規(guī)石蠟包埋，制作3～4 μm 厚度的石蠟切片，采用脫TUNEL 標記凋亡的細胞核。于200 倍視野計數(shù)凋亡細胞數(shù)，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.5 大鼠血清中LDH和SOD 活性及MDA 水平大鼠腹主動脈取血，4℃條件下3 000 r·min－1離心10 min，取血清。按照試劑盒操作說明書加入相應試劑，孵育后于440 nm 波長處檢測各樣品吸光度（A）值，根據(jù)試劑盒操作說明書提供的計算公式分別計算LDH 和SOD 活性及MDA 水平。

1.6 大鼠心肌組織中ROS 水平檢測取大鼠左室心肌組織，在預冷的PBS 緩沖液中漂洗，加入適量胰酶消化液，37℃消化30 min，間斷性吹打已消化組織，用預冷PBS 緩沖液終止消化，采用300 目尼龍網(wǎng)過濾，收集細胞，500 r·min－1離心10 min，棄上清，重懸細胞，重懸后按照試劑盒操作說明書步驟進行，加入10 μmol·L－1DCFH-DA 熒光探針避光孵育30 min，PBS 緩沖液洗滌3 次，使用488 nm 激發(fā)波長、525 nm 發(fā)射波長，采用流式細胞儀檢測，以相對平均熒光強度值表示細胞內(nèi)ROS 水平。

1.7 Western blotting 法檢測各組大鼠心肌組織中Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平取大鼠左室心肌組織，稱質(zhì)量后加入預冷的組織蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑勻漿，冰上碾磨組織，4℃條件下12 000×g 離心20 min，收集上清，采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。取20 μg 蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，并將蛋白轉移至PVDF膜上，5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1 和β-actin 抗體，4℃孵育過夜。次日，加入相應二抗室溫孵育1 h，ECL 試劑曝光顯影，在全自動凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，目的蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組大鼠LVSD、LVDD、EF 和FS，心肌細胞凋亡率，血清中LDH 和SOD 活性及ROS 和MDA 水平，心肌組織中cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心功能指標與假手術組比較，模型組大鼠LVSD 和LVDD 明顯升高（P＜0.05），EF 和FS 明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，高劑量QSYQ 組和陽性藥對照組大鼠LVSD 和LVDD 明顯降低（P＜0.05），EF 和FS 明顯升高（P＜0.05），低劑量QSYQ 組大鼠心功能指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心功能指標Tab.1 Cardiac function indexes of rats in varions groups（n＝12,）

表1 各組大鼠心功能指標Tab.1 Cardiac function indexes of rats in varions groups（n＝12,）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group.

2.2 各組大鼠心肌組織細胞凋亡情況假手術組大鼠心肌組織TUNEL 染色切片中棕黃色細胞不明顯，細胞凋亡率為（5.67±0.62）%；模型組大鼠心肌細胞棕黃色細胞明顯增多，細胞凋亡率為（39.40±3.07）%，較假手術組明顯升高（P＜0.05）；高劑量QSYQ 組和陽性藥對照組大鼠心肌組織中棕黃色細胞明顯減少，細胞凋亡率分別為（15.65±1.90）%和（9.84±0.88）%，較模型組明顯降低（P＜0.05），低劑量QSYQ 組大鼠肌細胞凋亡率與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1。

2.3 各組大鼠血清中LDH 和SOD 活性及MDA 和ROS 水平與假手術組比較，模型組大鼠血清中LDH 活性和MDA 及ROS 水平明顯升高（P＜0.05），SOD 活性明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，高劑量QSYQ 組和陽性藥對照組大鼠血清中LDH 活性及MDA 和ROS 水平明顯降低（P＜0.05），SOD 活性明顯升高（P＜0.05），低劑量QSYQ 組大鼠血清中上述各指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清中LDH 和SOD 活性及MDA 和ROS 水平Tab.2 Activities of LDH and SOD and levels of MDA and ROS in serum of rats in various groups（n＝12,）

表2 各組大鼠血清中LDH 和SOD 活性及MDA 和ROS 水平Tab.2 Activities of LDH and SOD and levels of MDA and ROS in serum of rats in various groups（n＝12,）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group.

2.4 各組大鼠心肌組織中凋亡相關蛋白表達水平與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中Cleaved-Caspase-3 和Bax 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，高劑量QSYQ 組和陽性藥卡托普利組大鼠心肌組織中Cleaved-Caspase-3 和Bax 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），低劑量QSYQ組大鼠心肌組織中凋亡相關蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2 和表3。

圖2 各組大鼠心肌組織中Cleaved-Caspase-3、Bax和Bcl-2 蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of leaved-Caspase-3，Bax，and Bcl-2 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

表3 各組大鼠心肌組織中Cleaved-Caspase-3、Bax 和Bcl-2蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of Cleaved-Caspase-3,Bax,and Bcl-2 proteins in myocardium tissue of rats in various groups（n＝12,）

表3 各組大鼠心肌組織中Cleaved-Caspase-3、Bax 和Bcl-2蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of Cleaved-Caspase-3,Bax,and Bcl-2 proteins in myocardium tissue of rats in various groups（n＝12,）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group.

2.5 各組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，高劑量QSYQ 組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），陽性藥對照組和低劑量QSYQ 組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3 和表4。

圖3 各組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of Nrf2 and HO-1 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

表4 各組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of Nrf2 and HO-1 proteins in myocardium tissue of rats in varions groups（n=12,）

表4 各組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of Nrf2 and HO-1 proteins in myocardium tissue of rats in varions groups（n=12,）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group.

3 討論

CHF 是由于長期心臟負荷過重，心肌損害和收縮力減弱所致的心功能不全的一種綜合征，也是眾多心臟疾病的終末階段，病死率極高［11］。我國中草藥資源豐富，種類繁多，從中草藥的有效成分中探尋并開發(fā)對抗心力衰竭藥物意義重大。近年來有研究［12-13］報道：QSYQ 在治療心力衰竭、改善心臟功能、提高運動耐量及抑制炎癥反應等方面具有良好效果。本研究采用冠狀動脈前降支結扎法建立大鼠CHF 模型，并給予QSYQ 治療心肌損傷，應用超聲檢測各組大鼠心功能，結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠LVSD 和LVDD 明顯升高，而EF 和FS 明顯降低，提示CHF 模型構建成功；與模型組比較，高劑量QSYQ 組大鼠LVSD 和LVDD 明顯降低，EF 和FS 明顯升高，表明QSYQ可明顯改善CHF 模型大鼠心臟功能。

氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生過多，清除能力降低，導致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而引起的氧化損傷過程。氧自由基可改變心臟結構而造成心臟功能異常，參與心力衰竭的演變進程。近年來研究［14］表明：心力衰竭動物模型中氧自由基明顯增多，抵抗被氧化的能力降低。當氧自由基抵抗物質(zhì)活性降低或產(chǎn)生過度時，將導致氧自由基沉積，進而刺激細胞膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應［15］。本研究結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠血清中LDH 活性及MDA 和ROS 水平明顯升高，SOD 活性降低，機體內(nèi)的氧化與抗氧化平衡被打破，產(chǎn)生氧化應激損傷；與模型組比較，高劑量QSYQ 組大鼠血清中LDH活性及MDA和ROS水平明顯降低，SOD活性升高，表明QSYQ 可以通過降低CHF 模型大鼠機體內(nèi)的氧化應激水平，緩解氧化損傷。

氧化應激可導致心肌細胞結構破壞和功能異常，進而導致心肌細胞凋亡增加，從而引起心功能損害，發(fā)生心力衰竭。細胞凋亡的發(fā)生由細胞凋亡蛋白調(diào)控，Bcl-2 家族蛋白在細胞凋亡過程中起著重要作用，Bcl-2 和Bax 蛋白表達水平與凋亡調(diào)控直接相關。在外界刺激或Caspase-3 等因子活化時，Bax 從胞漿轉入線粒體或細胞核膜，導致促凋亡因子與抗凋亡因子失衡，誘導細胞凋亡［16-17］。本研究采用TUNEL 染色觀察各組大鼠心肌組織細胞凋亡情況，結果顯示：假手術組大鼠心肌組織TUNEL染色切片中棕黃色細胞不明顯，細胞凋亡率低，模型組大鼠心肌組織中棕黃色細胞明顯增多，細胞凋亡率明顯升高，高劑量QSYQ 組大鼠心肌組織中棕黃色細胞明顯減少，細胞凋亡率明顯降低；Western blotting 實驗檢測結果顯示：QSYQ 能明顯降低CHF 大鼠心肌組織中促凋亡蛋白Bax 和Cleaved-Caspase-3 的表達水平，同時上調(diào)Bcl-2 蛋白的表達水平，起到抗心肌細胞凋亡作用。

Nrf2/HO-1 信號通路是迄今發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應激通路之一，機體內(nèi)多種抗氧化酶都含有一個共同的啟動子序列——抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE），在與ARE結合的多種轉錄因子中，Nrf2 是目前被認為起關鍵作用且可被外界因素誘導的，當發(fā)生氧化應激或受到其他化學物質(zhì)刺激時，Nrf2 通過磷酸化與Keap1解耦連，激活Nrf2 進入細胞核，與ARE 特異性位點結合，進而誘導其下游表達一系列內(nèi)源性的保護基因［18］。HO-1 為Nrf2 重要的下游靶基因，且為一種新型的心肌保護因子［19-20］。本研究結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平明顯降低；與模型組比較，陽性藥對照組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義，可能與卡托普利的作用機制有關，其可以通過擴張血管而控制血壓，減輕心臟負荷來阻滯CHF 的進行性心室擴張［21］。而高劑量QSYQ 組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平明顯升高，表明QSYQ 可能通過激活Nrf2/HO-1 信號通路，來發(fā)揮對CHF 模型大鼠心肌組織的保護作用。

綜上所述，QSYQ 可能通過激活Nrf2/HO-1 信號通路抑制CHF 模型大鼠心肌組織的氧化損傷，發(fā)揮其對心肌細胞損傷的保護作用。本研究揭示了QSYQ 潛在的心肌保護作用機制，為其相關藥物的開發(fā)和臨床應用提供了實驗依據(jù)。