李琪,徐瑞,李藤藤,江一川,李敏,

（1.吉林大學藥學院實驗藥理與毒理學教研室，吉林 長春 130021；2.錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院病理科，遼寧 錦州 120001；3.吉林大學藥學院藥理實驗中心，吉林 長春 130021）

蒽環(huán)類藥物是多種實體腫瘤和血液淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤的基礎(chǔ)性治療藥物。臨床研究［1-2］顯示：蒽環(huán)類藥物可誘導心臟毒性發(fā)生，且常呈進展性和不可逆性。由于蒽環(huán)類藥物導致的心臟毒性反應(yīng)發(fā)生的復雜性和臨床表現(xiàn)的多樣性，目前尚無有效的治療方法。近年來，抗腫瘤藥物心臟毒性的研究成為熱點，蒽環(huán)類藥物導致的心臟毒性模型和心肌細胞損傷模型也逐漸在相關(guān)的研究中被廣泛使用。其中，阿霉素（doxorubicin，DOX）誘導為目前國內(nèi)外實驗研究中常用制備心肌細胞損傷模型的方法，但其細胞死亡率較高［3-5］，干預手段常不能明顯緩解心肌細胞的損傷。DOX 作為第1 代蒽環(huán)類藥物，因其抗腫瘤針對性弱、心臟毒性大，臨床上已逐漸被第3 代蒽環(huán)類藥物吡柔比星（theprubicin，THP）等所取代。目前THP 在臨床中廣泛應(yīng)用，但在接受THP 化療的患者依然會出現(xiàn)不同程度的心臟毒性反應(yīng)，限制其長期使用。深入研究蒽環(huán)類藥物導致的心肌細胞損傷，尋找恰當?shù)念A防蒽環(huán)類藥物導致的心臟毒性反應(yīng)的手段仍然是腫瘤和心血管疾病研究的熱點。由于DOX 誘導心肌細胞損傷的模型存在諸多缺陷，根據(jù)臨床上蒽環(huán)類藥物的實際應(yīng)用情況，建立THP 誘導心肌細胞損傷模型具有現(xiàn)實意義。因此，本研究采用THP 作為造模藥物，對比分析不同時間、不同濃度THP 誘導大鼠心肌細胞（H9C2 細胞）的損傷情況，探討THP 誘導心肌細胞損傷模型的建立條件，為今后開展蒽環(huán)類藥物心臟毒性的相關(guān)研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株、藥品、主要試劑和儀器大鼠H9C2細胞由吉林大學生命科學學院實驗室饋贈，吉林大學藥學院實驗藥理與毒理學教研室凍存。注射用THP（深圳萬樂藥業(yè)有限公司），DMEM 高糖培養(yǎng)液（美國Hyclone 公司），CCK-8 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），DCFH-DA 活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（上海祤圣生物科技有限公司），丙二醛（malonaldehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（北京索萊寶公司），乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），TUNEL試劑盒（瑞士羅氏公司），TRIzol 試劑盒（美國Invitrogen 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司），總蛋白提取試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。倒置熒光顯微鏡和生物顯微鏡（日本Nikon 公司），酶聯(lián)免疫檢測儀（美國MD 公司），實時熒光定量PCR儀（德國耶拿公司），電泳槽、流式細胞儀、CO2恒溫培養(yǎng)箱和JJ260 型精密電子天平（美國BD 公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)H9C2細胞生長于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫密閉培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)并傳代，0.25%胰蛋白酶消化，每2～3 d 消化傳代1 次。

1.3 CCK-8 法檢測各組細胞存活率在DMEM中制備濃度分別為1×10－6、1×10－5、1×10－4和1×10－3mol·L－1的THP工作液。將細胞接種于96 孔細胞培養(yǎng)板（每孔5×104個細胞），分別培養(yǎng)12、24、36 和48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8，37℃孵育2 h。酶標儀檢測450 nm 波長處吸光度（A）值。細胞存活率=實驗組A 值/對照組A 值×100%。根據(jù)結(jié)果選擇THP 最佳造模濃度（1～10 μmol·L－1）和時間（24 h），隨后采用不同濃度THP（1、3、5、7 和9 μmol·L－1）處理細胞24 h，加入10 μL CCK-8，37℃孵育2 h，再次檢測各組細胞存活率。

1.4 光學顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)表現(xiàn)將細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板（每孔1×106個細胞）中培養(yǎng)24 h。細胞分為空白對照組和不同濃度THP 組，分別采用0、1、5 和9 μmol·L－1THP 處理24h后，將6孔細胞培養(yǎng)板放入倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)表現(xiàn)，并拍照記錄。

1.5 DCFH-DA ROS 試劑盒檢測各組細胞中ROS水平使用DCFH-DAROS 檢測試劑盒測定各組細胞中ROS 水平。將細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板（每孔1×106個細胞）中培養(yǎng)24 h。細胞分為空白對照組和不同濃度THP 組，分別采用0、1、5 和9 μmol·L－1THP 處理24 h。吸除棄液，用無血清DMEM清洗2次，加入1mL DCFH-DA（10 μmol·L－1），37℃孵育30 min，置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6 各組細胞中MDA 水平及SOD 和LDH 活性檢測將細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板（每孔1×106個細胞）中培養(yǎng)24 h。細胞分為空白對照組和不同濃度THP 組，分別采用0、1、5 和9 μmol·L－1THP處理24 h，收集各組細胞，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.7 TUNEL 試劑盒檢測H9C2 細胞凋亡率將高壓滅菌多聚賴氨酸處理過的蓋玻片放入6 孔細胞培養(yǎng)板中，細胞分組同“1.6”，將細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板（每孔1×106個細胞）中培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛中固定25 min，按照TUNEL 試劑盒說明書進行操作。應(yīng)用熒光顯微鏡觀察凋亡細胞，任選1 個視野進行凋亡細胞計數(shù)，計算H9C2 細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/全部細胞×100%。

1.8 qRT-PCR 法檢測各組細胞中B 淋巴細胞瘤2相關(guān)X 蛋白（Bax）、B 淋巴細胞瘤2（Bcl-2）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和半胱氨酸蛋白酶9（Caspase-9）mRNA 水平將細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板（每孔1×106個細胞）中培養(yǎng)24h。細胞分組同“1.6”，采用THP（1、5 和9 μmol·L－1）處理各組細胞24 h。收集細胞，TRIzol 法提取細胞中的總RNA，實驗步驟參照試劑盒說明書。應(yīng)用紫外分光光度計檢測RNA 的濃度及純度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，步驟參照cDNA 合成試劑盒，根據(jù)qRT-PCR 試劑盒檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3 和Caspase-9 mRNA 表達水平，內(nèi)參基因為GAPDH。反應(yīng)程序：94℃、15 s（變性）；58℃、15 s（退火），72℃、15 s（延伸），40 個循環(huán)。采用相對定量2－△△Ct法計算各組細胞目的基因mRNA表達水平。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 Sequences of qRT-PCR primers

1.9 Western blotting 法檢測各組細胞中凋亡相關(guān)蛋白表達水平將細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板（每孔1×106個細胞）中培養(yǎng)24 h。細胞分組和處理見“1.6”。收集細胞，按照總蛋白提取試劑盒說明書提取各組總蛋白，采用BCA 定量，進行SDSPAGE 凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，Western blotting 法封閉液封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過夜，次日加入用Western blotting 法二抗稀釋液稀釋后的二抗，并在室溫搖床孵育2 h，按照高敏感度化學發(fā)光檢測試劑盒說明書滴加發(fā)光工作液顯色后，以 GAPDH 為內(nèi)參，采用 Image proplus 6.0 軟件進行灰度分析。實驗過程中涉及的抗體及稀釋濃度見表2。目的蛋白表達水平＝目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計學分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組H9C2 細胞存活率，細胞凋亡率，各組細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9 mRNA 表達水平和Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9 蛋白表達水平均符合正態(tài)分布且方差齊，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

表2 Western blotting 法檢測中使用的抗體和稀釋濃度比例Tab.2 Antibodies and dilutions used in Western blotting method detection

2 結(jié)果

2.1 CCK-8 法檢測各組細胞存活率及倒置顯微鏡下H9C2 細胞形態(tài)表現(xiàn)CCK-8 法檢測THP 細胞存活率，結(jié)果顯示：THP 最佳造模時間為24 h，見圖1A；造模濃度范圍為1×10－6～1×10－5mol·L－1，見圖1A 和B。與空白對照組比較，1、3、5、7 和9 μmol·L－1THP 組細胞存活率均明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），各組細胞存活率見圖1C。倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示：THP 處理后的細胞形態(tài)變小、數(shù)量減少，甚至死亡漂浮，見圖2。根據(jù)以上結(jié)果，選擇1、5 和9 μmol·L－1THP 組進行后續(xù)實驗。

圖1 各組H9C2 細胞的存活率Fig.1 Survival rates of H9C2 cells in various groups

圖2 各組H9C2 細胞形態(tài)表現(xiàn)（×40）Fig.2 Morphology of H9C2 cells in various groups（×40）

2.2 各組H9C2 細胞中ROS 和MDA水平及SOD 和LDH 活性DCFH-DA 探針法檢測細胞中ROS 水平，結(jié)果顯示：與空白對照組比較，1、5 和9 μmol·L－1THP 組細胞中ROS 水平升高，且呈濃度依賴性。5μmol·L－1THP組細胞形態(tài)正常；9 μmol·L－1THP 組細胞變圓，見圖3。與空白對照組比較，1 μmol·L－1THP 組細胞中MDA 水平和SOD 活性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），5 和9 μmol·L－1THP 組細胞中MDA 水平明顯升高（P＜0.01），SOD 活性明顯降低（P＜0.01），1、5 和9 μmol·L－1THP 組LDH 活性明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組細胞中MDA 水平及SOD 和LDH 活性Fig.4 Intracellular MDA levels and SOD and LDH activities in various groups

2.3 各組H9C2 細胞凋亡率1、5 和9 μmol·L－1THP 組的細胞凋亡率分別為（7.01±3.03）%、（42.09±4.98）%和（92.21±3.08）%，較空白對照組（1.05%±0.94%）明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖5。

2.4 各組細胞中 Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9mRNA表達水平與空白對照組比較，1、5 和9 μmol·L－1THP 組細胞中Bax和Caspase-3 mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05），Bcl-2 mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.05），1 μmol·L－1

THP 組Caspase-9 mRNA 表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），5 和9 μmol·L－1THP 組Caspase-9 mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.01）。見表3。

2.5 各組細胞中Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3 和Cleaved caspase-9 蛋白表達水平與空白對照組比較，1、5 和9 μmol·L－1THP 組細胞中Bax、Cleaved Caspase-3 和Cleaved Caspase-9 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。見圖6。

表3 qRT-PCR 法檢測各組H9C2 細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3 和Caspase-9 mRNA 表達水平Tab.3 Expression levels of Bax,Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 mRNA in H9C2 cells in various groups determined by qRTPCR method(n＝3，）

表3 qRT-PCR 法檢測各組H9C2 細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3 和Caspase-9 mRNA 表達水平Tab.3 Expression levels of Bax,Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 mRNA in H9C2 cells in various groups determined by qRTPCR method(n＝3，）

*P＜0.05，**P＜0.01vscontrol blank group.

3 討論

圖6 Western blotting 法檢測各組H9C2 細胞中Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3 和Cleaved Caspase-9 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.6 Electrophoregram（A）and histogram（B）of expression levels of Bax，Bcl-2，Cleaved Caspase-3 and Cleaved Caspase-9 proteins in H9C2 cells in various groups determined by Western blotting method

蒽環(huán)類藥物引起的心臟毒性具有累積性和劑量依賴性。2011 年中國臨床腫瘤學會（CSCO）專家共識［6］指出：給予蒽環(huán)類藥物6 年后超過50%的患者可發(fā)生左心室組織和功能亞臨床心臟超聲變化。氧化應(yīng)激是目前公認的蒽環(huán)類藥物引起心臟損傷的機制［7］。蒽環(huán)類藥物易聚集于心肌細胞的線粒體中，其醌基結(jié)構(gòu)在代謝過程中可循環(huán)生成許多ROS，促使心肌細胞發(fā)生凋亡和壞死［8-12］。此外，蒽環(huán)類藥物還可以螯合鐵離子后觸發(fā)氧自由基的生成，引起心肌細胞膜脂質(zhì)過氧化和心肌線粒體DNA 損傷［13-15］。另外，鈣蓄積、心肌細胞凋亡的觸發(fā)、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白生長因子1（neuregulin-1，NRG-1）/ErbB 信號通路、腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號通路、β 腎上腺素受體（β-adrenergic receptor，βAR）和Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）等也參與蒽環(huán)類藥物相關(guān)心臟毒性發(fā)病機制［16］。

目前，蒽環(huán)類藥物心臟毒性的預防和治療尚缺乏令人滿意的方法，是國內(nèi)外的腫瘤心臟病學研究領(lǐng)域一個亟需解決的問題。以DOX 制作實驗性心肌損傷的細胞和動物模型為目前研究心臟毒性常用的途徑與手段，這些模型制備方式因具有操作簡單和費用低等特點而逐漸在基礎(chǔ)研究中得到推廣和應(yīng)用［17］。但以DOX 誘導細胞和實驗動物心肌損傷模型會出現(xiàn)較高的死亡率，DOX 誘導心肌損傷大鼠的死亡率高達30% 以上，給研究造成了極大困擾［18］。并且，由于DOX 的不良反應(yīng)較為嚴重，臨床上已經(jīng)不再使用DOX 作為腫瘤患者的一線化療藥物。因此，尋找一種誘導成功率高、細胞和動物實驗的死亡率低且與臨床上實際用藥相結(jié)合的制備心肌損傷模型的方式為目前關(guān)注的重點。本研究采用的造模藥物為THP，是一種蒽環(huán)類藥物，其所致心臟毒性等不良反應(yīng)少于其他蒽環(huán)類藥物，在臨床中應(yīng)用較為廣泛，具有較實際的研究價值。

本研究采用CCK-8 法篩選出THP 制備H9C2損傷模型的作用最佳時間（24 h）和濃度范圍（1～10 μmol·L－1）。當THP 濃度為1 μmol·L－1時，細胞的形態(tài)學改變，細胞中MDA 水平，SOD 和LDH 活性，細胞凋亡率，細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3 和Caspase-9 mRNA 表達水平及Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 和Cleaved caspase-9 蛋白表達水平變化不明顯，提示THP 濃度在低于1 μmol·L－1時引起H9C2 損傷程度過低，達不到實驗造模要求；隨著給藥濃度的升高，當THP濃度為9 μmol·L－1時，細胞損傷程度過重，細胞變形嚴重，全部凋亡甚至死亡，提示THP 濃度過高也會對H9C2 損傷模型制備造成影響，不符合實驗造模要求。而THP 濃度為5 μmol·L－1時，細胞形態(tài)趨于正常并未發(fā)生嚴重變形，細胞中ROS 水平升高，細胞凋亡率為40%，各項指標也符合實驗要求，若增加保護心肌細胞損傷的藥物或方法等有益干預，能夠達到改善H9C2 造模后的損傷程度，可視為造模成功［19］。根據(jù)各實驗組細胞形態(tài)學指標和細胞中MDA 水平、SOD 和LDH 活性、細胞凋亡率、細胞內(nèi)凋亡相關(guān)因子mRNA 和蛋白表達水平等實驗指標最終確定5 μmol·L－1THP 作為大鼠心肌細胞H9C2 損傷模型的最佳造模藥物濃度。

綜上所述，本研究所確定的造模藥物濃度和時間僅針對研究中所提及的細胞系和培養(yǎng)條件，但對其他類似的實驗條件也具有參考價值。在選取心肌細胞損傷模型時，還需要根據(jù)實驗室條件，模型藥物試劑的安全性、可重復性、有效性以及細胞凋亡時間、細胞活力和實驗細胞檢測指標的時間等綜合考慮，盡量避免模型中試劑所引起的干擾，根據(jù)實際情況，選擇合適的實驗模型。